MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ ZAHRADNICKÁ FAKULTA DIZERTAČNÍ PRÁCE Lednice 2010 Ing. Eva Chroboková Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta Dizertační práce Identifikace kultivarů meruněk pomocí molekulárních metod Autor: Ing. Eva Chroboková Školitel: Doc. RNDr. Miroslav Pidra, CSc. Studijní program: Zahradnické inženýrství P4108 Studijní obor: Zahradnická produkce 4108V003 Lednice 2010 Čestné prohlášení Prohlašuji, ţe jsem dizertační práci na téma „Identifikace kultivarů meruněk pomocí molekulárních metod“ vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uloţena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Lednici, dne ................................................................................ Podpis ............................................................................................. 2 Poděkování Na tomto místě chci poděkovat mému školiteli, panu Doc. RNDr. Miroslavu Pidrovi, za odborné vedení a cenné rady nezbytné pro realizaci a sepsání této dizertační práce. Dále děkuji panu prof. Dr. Borisovi Krškovi za poskytnutí rostlinného materiálu z genofondové kolekce genových zdrojů na Zahradnické fakultě v Lednici, včetně poskytnutí důleţitých informací o analyzovaných poloţkách. V neposlední řadě poděkování patří všem pracovníkům Mendelea – ústavu genetiky za přátelskou spolupráci, trpělivou pomoc a odborné konzultace, poskytované v průběhu realizace molekulárně-genetických analýz v laboratoři. Velký dík patří také moji rodině za veškerou podporu poskytovanou v průběhu studia. 3 Obsah Seznam tabulek 7 Seznam obrázků 10 1. Úvod 15 2. Literární přehled 17 2.1 Původ a historie pěstování meruněk 17 2.2 Botanická charakteristika meruněk 17 2.2.1 Zařazení do systému 17 2.2.2 Botanická charakteristika a botanické druhy meruněk 18 2.2.3 Další botanické formy meruněk 23 2.2.4 Interspecifická hybridizace 23 2.3 Ekologicko-geografické rozdělení meruněk 24 2.3.1 Ekologicko-geografické skupiny meruněk podle K. F. Kostiny 24 2.3.2 Ekologicko-geografické skupiny meruněk podle N. I. Vavilova 26 2.3.3 Ekologicko-geografické skupiny meruněk podle Bailey a Hough 26 2.4 Genetické zdroje meruněk 27 2.4.1 Biodiverzita a genetické zdroje 27 2.4.2 Mezinárodní legislativa 28 2.4.2.1 Mezinárodní organizace 28 2.4.2.2 Mezinárodní smlouvy 28 2.4.3 Národní legislativa 30 2.4.3.1 Národní program – Česká republika 30 2.4.4 Studium genetických zdrojů meruněk 31 2.4.5 Genetické zdroje meruněk v Lednici 32 2.4.6 Genové zdroje meruněk v Číně 33 2.4.6.1 Hlavní oblasti výskytu meruněk v Číně 34 2.4.6.2 Původní druhy a variety meruněk v Číně 34 2.4.7 Kolekce genových zdrojů 36 2.4.7.1 Obecný postup vytváření základní kolekce 36 2.4.7.2 Příklad konstrukce základní kolekce rýţe (Oryza sativa) 37 2.5 Polymerázová řetězová reakce (PCR) 38 2.5.1 Princip metody PCR 38 2.5.2 Komponenty PCR reakce 39 2.5.3 Modifikace PCR reakce 41 2.5.4 Výhody, nevýhody a aplikace PCR 42 2.6 Metoda RAPD 43 2.6.1 Podstata metody 43 2.6.2 Přednosti a nedostatky metody RAPD 43 2.6.3 Obecné uplatnění metody RAPD ve výzkumu 44 2.6.4 Uplatnění metody RAPD při identifikaci odrůd zemědělských plodin 44 2.6.4.1 Identifikace kultivarů meruněk 45 2.6.4.2 Identifikace kultivarů dalších ovocných druhů 45 2.6.5 Další techniky zaloţené na principu RAPD 46 2.7 Metoda SSR 46 2.7.1 Podstata mikrosatelitů 46 2.7.2 Minisatelity – jejich podstata a vyuţití 47 2.7.3 Obecné uplatnění SSR markerů ve výzkumu 48 2.7.4 Uplatnění metody SSR při identifikaci kultivarů meruněk 49 2.7.5 Uplatnění metody SSR při identifikaci kultivarů dalších plodin 50 2.7.6 Metody zaloţené na SSR 52 4 2.8 Hodnocení molekulárně-genetických dat 53 2.9 Knihovny cDNA 55 2.9.1 Knihovny cDNA 55 2.9.2 Klonování genů 55 2.9.3 Identifikace genů 56 2.9.4 Sekvenování DNA 56 2.10 Aplikace molekulárně-genetických metod při studiu PPV (šarka švestek) 57 2.10.1 Výzkum rezistence vůči PPV 57 2.10.2 Studium PPV na molekulární úrovni 58 3. Cíl práce 60 4. Materiál a metoda 61 4.1 Rostlinný materiál 61 4.1.1 Charakteristika odrůd sortotypu ´Velkopavlovická´ 61 4.2 Izolace DNA 67 4.2.1 Postup izolace 68 4.2.2 Kontrola čistoty a koncentrace DNA na 0,8% agarózovém gelu 68 4.2.3 Seznam číslování genotypů v průběhu izolace DNA 69 4.3 Analýza RAPD 70 4.3.1 RAPD reakční směs 71 4.3.2 Teplotní program 71 4.3.3 Separace RAPD produktů v agarózovém gelu 72 4.4 Výběr SSR primerů 74 4.5 Metoda SSR 75 4.5.1 SSR reakční směs 76 4.5.2 Teplotní programy SSR reakcí 76 4.5.2.1 Teplotní program podle LOPES et al. (2002) 76 4.5.2.2 Teplotní program podle MESSINA et al. (2004) 77 4.5.2.3 Teplotní program podle HAGEN et al. (2004) 78 4.5.2.4 Teplotní program podle CIPRIANI et al. (1999) 78 4.5.2.5 Teplotní program podle ARANZANA et al. (2002) 79 4.5.3 Separace SSR produktů na nedenaturačním polyakrylamidovém gelu (PAGE) 79 4.5.4 Analýza SSR produktů na genetickém analyzátoru ABI PRISM 310 81 5. Výsledky 84 5.1 Izolace DNA 84 5.2 Hodnocení výsledků RAPD analýz 85 5.2.1 Hodnocení efektivnosti RAPD primerů 85 5.2.2 Hodnocení genové diverzity RAPD primerů 86 5.2.3 Sestavení RAPD dendrogramů 90 5.3 Předběţný screening (testování) SSR primerů 95 5.4 Hodnocení výsledků SSR analýz 98 5.4.1 Hodnocení genetické diverzity SSR analýz 98 5.4.2 Sestavení dendrogramů pomocí SSR analýz 102 5.5 Sestavení dendrogramu pomocí RAPD a SSR dat 107 5.6 Porovnání binární matice RAPD a binární matice SSR pomocí Mantelova testu 110 6. Diskuze 113 6.1 Hodnocení genové diverzity a RAPD dendrogramů 113 6.2 Hodnocení genové diverzity a SSR dendrogramů 117 6.3 Hodnocení dendrogramu RAPD/SSR 121 5 6.4 Základní kolekce (core collection) 122 7. Závěr 124 8. Souhrn a Summary 126 8.1 Souhrn 126 8.2 Summary 127 9. Seznam zkratek 128 10. Seznam citované literatury 131 11. Seznam vlastních publikovaných prací 146 Přílohy dizertační práce 147 6 Seznam tabulek Tab. 1. Ekologicko-geografické skupiny meruněk (převzato z MEHLENBACHER et al. 1991). 27 Tab. 2. Zařazení genotypů do skupin z hlediska jejich geografického původu. ............................ 63 Tab. 3. Zařazení genotypů do skupin z hlediska jejich geografického původu. ............................ 64 Tab. 4. Popis jednotlivých genotypů: původ genotypu z hlediska genových zdrojů; země původu z pohledu jejich registrace. .................................................................................................... 65 Tab. 5. Popis jednotlivých genotypů: původ genotypu z hlediska genových zdrojů; země původu z pohledu jejich registrace. .................................................................................................... 66 Tab. 6. Popis jednotlivých genotypů: původ genotypu z hlediska genových zdrojů; země původu z pohledu jejich registrace. .................................................................................................... 67 Tab. 7. Číslování genotypů v průběhu izolace DNA. .................................................................... 70 Tab. 8. Sloţení mastermixu pro RAPD reakci (chemikálie pro reakční směs RAPD s primery Operon). ................................................................................................................................. 71 Tab. 9. Seznam pouţitých RAPD primerů a jejich sekvence. ........................................................ 71 Tab. 10. Seznam vybraných 12 SSR primerů. ............................................................................... 75 Tab. 11. Seznam 9 SSR primerů označených fluorescenčně barvami FAM, JOE a NED. ............ 75 Tab. 12. Sloţení mastermixu pro SSR reakce (chemikálie pro reakční směs RAPD s primery Operon). ................................................................................................................................. 76 Tab. 13. Popis mikrosatelitů u meruněk (podle LOPES et al. 2002): název lokusu, opakovaná sekvence, sekvence primeru (5´-3´), velikost klonované alely (rozsah velikostí v bp), teplota nasedání primeru (°C). .......................................................................................................... 77 Tab. 14. Popis mikrosatelitů u meruněk (podle MESSINA et al. 2004): název lokusu, opakovaná sekvence, sekvence primeru (5´-3´), velikost klonované alely (rozsah velikostí v bp), teplota nasedání primeru (°C). .......................................................................................................... 77 Tab. 15. Popis mikrosatelitů u meruněk (podle HAGEN et al. 2004): název lokusu, opakovaná sekvence, sekvence primeru (5´-3´), velikost klonované alely (rozsah velikostí v bp), teplota nasedání primeru (°C). .......................................................................................................... 78 Tab. 16. Popis mikrosatelitu UDP96-005 u broskvoní (vybráno podle CIPRIANI et al. 1999): název lokusu, opakovaná sekvence, sekvence primeru (5´-3´), velikost klonované alely (rozsah velikostí v bp), teplota nasedání primeru (°C). ......................................................... 78 Tab. 17. Popis mikrosatelitů u broskvoní (vybráno podle ARANZANA et al. 2002): název lokusu, opakovaná sekvence, sekvence primeru (5´-3´), velikost klonované alely (rozsah velikostí v bp), teplota nasedání primeru (°C)....................................................................... 79 Tab. 18. Sestavení SSR primerů do analyzátoru podle fluorescenčního označení barvou (byl aplikován směsný vzorek od 3 primerů tak, aby byl zastoupen primer označený příslušnou barvou). ................................................................................................................................. 82 Tab. 19. Genová diverzita podle NEI (1973) u všech RAPD lokusů; barevně jsou vyznačeny RAPD lokusy s nejvyšší a nejniţší hodnotou genové diverzity (modře – nejvyšší hodnoty, červeně – nejniţší hodnoty). h* - genová diverzita ............................................................... 88 Tab. 20. Genová diverzita (h*) podle NEI (1973) u vybraných 7 RAPD primerů; jsou vyznačeny RAPD primery, které vykazovaly nejvyšší součty hodnot genové diverzity. h* - genová diverzita; součet h* - součet genové diverzity pro jednotlivé RAPD primery. ..................... 89 Tab. 21. Seznam 6 SSR primerů, jejich barevné značení a spektrum velikostí produktů. ............. 98 Tab. 22. Seznam 3 SSR primerů, vybraných pro další SSR analýzy. ............................................ 98 Tab. 23. Genová diverzita podle NEI (1973) pro 6 SSR lokusů (6U410 – CTA 10); barevně jsou vyznačeny SSR lokusy s nejvyšší a nejniţší hodnotou genetické diverzity (modře – nejniţší hodnoty, červeně – nejvyšší hodnoty). ..................................................................... 99 Tab. 24. Genová diverzita podle NEI (1973) pro další 3 SSR lokusy (CTA27 – UDP96-005); barevně jsou vyznačeny SSR lokusy s nejvyšší a nejniţší hodnotou genetické diverzity (modře – nejniţší hodnoty, červeně – nejvyšší hodnoty). ................................................... 100 7 Tab. 25. Zobrazení genové diverzity podle NEI (1973) u vybraných 5 SSR lokusů; jsou vyznačeny SSR lokusy, které vykazovaly nejvyšší součty hodnot genové diverzity. h* - diverzita jednotlivých SSR lokusů; součet h* - suma heterozygozit u jednotlivých SSR primerů. ............................................................................................................................... 101 Tab. 26. Popis vybraných pěti SSR primerů (název lokusu, opakovaná sekvence, sekvence primeru (5´ - 3´), velikost klonované alely v párech bází (bp) a teplota nasedání primerů (Ta) v °C). ........................................................................................................................... 102 Seznam tabulek - Přílohy Tab. 27. Vyhodnocení SSR lokusů po amplifikaci 10 SSR primery do podoby binární matice, ve které je přítomnost produktu označena jako „1“ a jeho nepřítomnost jako „0“; č. 10 – 89: označení vybraných genotypů meruněk. ............................................................................. 158 Tab. 28. Rozdíly v sestavě skupiny hybridů E x As skupiny, evropských a amerických genotypů v RAPD dendrogramech. .................................................................................................... 159 Tab. 29. Rozdíly v sestavě skupiny asijských genotypů a mezidruhových hybridů v RAPD dendrogramech. ................................................................................................................... 160 Tab. 30. Rozdíly v zařazování genotypů v RAPD dendrogramu 1 a RAPD dendrogramu 2 – hybridy E x As skupiny. ...................................................................................................... 160 Tab. 31. Genotypy ze skupiny E x As hybridů (1 klastr) nezařazené pomocí metody RAPD. .... 161 Tab. 32. Rozdíly v zařazování genotypů v RAPD dendrogramu 1 a RAPD dendrogramu 2 – evropská skupina. ................................................................................................................ 161 Tab. 33. Genotypy evropské skupiny (2 klastr) nezařazené pomocí metody RAPD. .................. 161 Tab. 34. Rozdíly v zařazování genotypů v RAPD dendrogramu 1 a RAPD dendrogramu 2 – americká skupina. ................................................................................................................ 161 Tab. 35. Genotypy americké skupiny (3 klastr) nezařazené pomocí metody RAPD. .................. 162 Tab. 36. Rozdíly v zařazování genotypů v RAPD dendrogramu 1 a RAPD dendrogramu 2 – asijská skupina. .................................................................................................................... 162 Tab. 37. Zařazení hybridů SEO-40, SEO-44 a SEO-104 v RAPD dendrogramu 1 a RAPD dendrogramu 2. .................................................................................................................... 162 Tab. 38. Genotypy asijské skupiny (4 klastr) nezařazené pomocí metody RAPD....................... 163 Tab. 39. Rozdíly v zařazování genotypů v RAPD dendrogramu 1 a RAPD dendrogramu 2 – skupina mezidruhových hybridů. ........................................................................................ 163 Tab. 40. Přehled „M“-hybridů a rodičovské druhy pouţité v průběhu kříţení. ........................... 163 Tab. 41. Genotypy ze skupiny mezidruhových hybridů (5 klastr) nezařazené pomocí metody RAPD. ................................................................................................................................. 163 Tab. 42. Rozdíly v sestavě genotypů ve skupinách hybridů E x As skupiny, evropských a amerických genotypů v SSR dendrogramech. ..................................................................... 164 Tab. 43. Rozdíly v sestavě genotypů ve skupině asijských genotypů a mezidruhových hybridů v SSR dendrogramech. ........................................................................................................ 165 Tab. 44. Rozdíly v zařazování genotypů v SSR dendrogramu 1 a SSR dendrogramu 2 – hybridy E x As skupiny. ....................................................................................................................... 166 Tab. 45. Genotypy skupiny E x As hybridů (1 klastr) nezařazené pomocí metody SSR. ............ 166 Tab. 46. Rozdíly v zařazování genotypů v SSR dendrogramu 1 a SSR dendrogramu 2 – evropská skupina. ............................................................................................................................... 166 Tab. 47. Genotypy evropské skupiny (2 klastr) nezařazené pomocí metody SSR. ..................... 166 Tab. 48. Rozdíly v zařazování genotypů v SSR dendrogramu 1 a SSR dendrogramu 2 – americká skupina. ............................................................................................................................... 167 Tab. 49. Genotypy americké skupiny (3 klastr) nezařazené pomocí metody SSR. ..................... 167 Tab. 50. Rozdíly v zařazování genotypů v SSR dendrogramu 1 a SSR dendrogramu 2 – asijská skupina. ............................................................................................................................... 167 Tab. 51. Dodatečné asijské skupiny. ............................................................................................ 168 Tab. 52. Genotypy asijské skupiny (4 klastr) nezařazené pomocí metody SSR. ......................... 168 Tab. 53. Rozdíly v zařazování genotypů v SSR dendrogramu 1 a SSR dendrogramu 2 – skupina mezidruhových hybridů. ...................................................................................................... 168 8 Tab. 54. Mezidruhové hybridy (5 klastr) nezařazené pomocí metody SSR. ................................ 168 Tab. 55. Rozdíly v sestavě genotypů pro RAPD/SSR dendrogram, SSR dendrogram 1 a RAPD dendrogram 1 – skupina E x As hybridů, evropských a amerických genotypů. ................. 169 Tab. 56. Rozdíly v sestavě genotypů pro RAPD/SSR dendrogram, SSR dendrogram 1 a RAPD dendrogram 1 – asijská skupina a skupina mezidruhových hybridů. .................................. 170 Tab. 57. Rozdíly v sestavě genotypů pro RAPD/SSR dendrogram, SSR dendrogram 1 a RAPD dendrogram 1 – hybridy E x As skupiny. ............................................................................ 171 Tab. 58. Rozdíly v sestavě genotypů pro RAPD/SSR dendrogram, SSR dendrogram 1 a RAPD dendrogram 1 – evropská skupina. ...................................................................................... 171 Tab. 59. Rozdíly v sestavě genotypů pro RAPD/SSR dendrogram, SSR dendrogram 1 a RAPD dendrogram 1 – americká skupina. ...................................................................................... 171 Tab. 60. Rozdíly v sestavě genotypů pro RAPD/SSR dendrogram, SSR dendrogram 1 a RAPD dendrogram 1 – asijská skupina. ......................................................................................... 172 Tab. 61. Rozdíly v sestavě genotypů pro RAPD/SSR dendrogram, SSR dendrogram 1 a RAPD dendrogram 1 – skupina mezidruhových hybridů. .............................................................. 172 Tab. 62. Genotypy zařazené v stejných skupinách v rozsahu všech tří sestavených dendrogramů, mohou být základem základních kolekcí (core kolekcí). .................................................... 173 Tab. 63. Ukázka velikosti SSR alel získaných po amplifikaci fluorescenčně značenými SSR primery CPPCT 26, CPPCT 27 a UDP96-005 u genotypů č. 1 – 50. ................................. 174 Tab. 64. Ukázka velikosti SSR alel získaných po amplifikaci fluorescenčně značenými SSR primery CPPCT 26, CPPCT 27 a UDP96-005 u genotypů č. 51 – 95. ............................... 175 Tab. 65. Ukázka velikosti SSR alel získaných po amplifikaci fluorescenčně značenými SSR primery AMPA123, UDAp420 a UDAp410 u genotypů č. 1 – 50. .................................... 176 Tab. 66. Ukázka velikosti SSR alel získaných po amplifikaci fluorescenčně značenými SSR primery AMPA123, UDAp420 a UDAp410 u genotypů č. 51 – 95. .................................. 177 Tab. 67. Ukázka velikosti SSR alel získaných po amplifikaci fluorescenčně značenými SSR primery 1ssrPaCITA 7, 1ssrPaCITA 10 a 1ssrPaCITA 27 u genotypů č. 1 – 50. ............... 178 Tab. 68. Ukázka velikosti SSR alel získaných po amplifikaci fluorescenčně značenými SSR primery 1ssrPaCITA 7, 1ssrPaCITA 10 a 1ssrPaCITA 27 u genotypů č. 51 – 95. ............. 179 9