UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS PARTICIPACIÓN DE KISSPEPTINA EN LA FUNCIÓN OVÁRICA Y SUS CAMBIOS DURANTE LA ACTIVACIÓN DEL SISTEMA NERVIOSO SIMPÁTICO INDUCIDA POR EL ESTRÉS POR FRÍO EN LA RATA Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Farmacología Por MANUEL ALEJANDRO RICU MOYA DIRECTORES DE TESIS Profesor Dr. Hernán Lara Peñaloza Profesor Dr. Alfonso Paredes Santiago - Chile 2013 FINANCIAMIENTO: La realización de esta tesis fue financiada por proyectos de investigación y gracias a las becas de mantención de las siguientes instituciones. Proyectos del Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT):  FONDECYT N° 1090036 “Neonatal exposure to estradiol and stress in rats, activates neural genes and programs sympathetic nerve activity to determine changes in reproductive function and polycystic ovary syndrome”. Investigador Responsable: Dr. Hernán Lara.  FONDECYT N° 1120147 “Participación de kisspeptina y del sistema nervioso simpático en el desarrollo folicular ovárico de la rata durante la senescencia reproductiva”. Investigador Responsable: Dr. Alfonso Paredes. Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT):  Beca para la mantención Estudiante de Doctorado (2008-2012)  Beca de apoyo a la realización de la Tesis Doctoral N° 24110140  Beca de Termino de Tesis Doctoral (2012) Becario: Manuel Ricu Moya Programa de Mejoramiento de la Calidad y equidad de la Educación Superior (MECESUP): “Programa de Doctorado en Farmacología de la Universidad de Chile. Hacia un claustro Académico Nacional”  Beca Para estadía corta en el extranjero. Proyecto MECESUP UCH 0704 (2011). Becario: Manuel Ricu Moya PUBLICACION: Parte de los resultados de esta tesis han dado origen a un artículo científico, publicado en la revista internacional “Endocrinology”. Manuel A. Ricu, Víctor D. Ramírez, Alfonso H. Paredes, and Hernán E. Lara. “Evidence for a Celiac Ganglion-Ovarian Kisspeptin Neural Network in the Rat: Intraovarian Anti-Kisspeptin Delays Vaginal Opening and Alters Estrous Cyclicity”. Endocrinology, 2012, 153(10):4966-77. Presentación a congresos Los resultados de esta tesis han sido presentados en los siguientes congresos científicos: 1.- Ricu, M. Dorfman, M. Paredes, A. Lara, H. El estrés por frío crónico aumenta la expresión de kisspeptina y su receptor GPR54 en el hipotálamo y ovario de rata. XXXI Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de chile. Exposición poster, Concepción, Chile, 2009. 2.- Ricu, M. Paredes, A. Lara, H. Cold Stress exposure modifies Kisspeptin/GPR54 system in the rat ovary. US-Latinoamerican Workshop in Neuroendocrinology. Exposición poster, Viña del Mar, Chile, 2011. 3.- Ricu, M. Paredes, A. Ramírez, V. Lara, H. Kisspeptina en el eje ganglio celíaco-ovario es activada por el sistema nervioso simpático y se requiere para una correcta ciclicidad estral. XXIII Reunión Anual de la Sociedad Chilena de Reproducción y desarrollo. Exposición poster, Viña del Mar, Chile, 2012. 4.- Paredes A, Ricu M, Lara H. PARTICIPACIÓN DE KISSPEPTINA EN EL DESARROLLO FOLICULAR Y LA OVULACIÓN. XXXIV Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de chile. Exposición poster, Pucón, Chile, 2012. Dedicatoria A mi amada esposa Yenny, quien con sus concejos, fuerza y amor, me ha permitido llegar al final de este camino, y como conversamos un día, realizar ambos el doctorado iba a ser duro, pero si lo llevábamos a cabo juntos podríamos lograr esto y mucho más. A mis hijos Catalina y Matías, quienes han llegado a nuestras vidas durante el doctorado, acompañándonos e iluminado nuestras vidas. A mi madre a quien debo todo lo que soy, por su esfuerzo, dedicación y amor, ha sido el pilar fundamental para poder darme las herramientas para desenvolverme. A Mis suegros Por su cariño y amistad incondicional, desde que nos conocimos, apoyándonos siempre en los caminos que hemos emprendido. A mi cuñados Por su apoyo durante estos años. Agradecimientos  En primer lugar agradezco a mis tutores, Al doctor Hernán Lara, por su inmenso apoyo desde mi llegada al laboratorio en el año 1998, gracias profesor por darme todas las herramientas necesarias para lograr esta gran meta.  Doctor Alfonso Paredes por sus concejos y apoyo durante todos estos años, y en especial en mi tesis de Doctorado.  A los miembros de la comisión, por sus concejos siempre constructivos.  A Gonzalo Cruz y Rafael Barra por su amistad y apoyo en todos estos momentos compartidos.  A todo el grupo de laboratorio, Monika. Jonathan, Daniela, Michelle, Beatriz, Grisel, Paola, Javier, Daniel, Sergio y Ariel por su apoyo y amistad.  Al Señor Cortez, por su excelente trabajo, el cual siempre facilito el desarrollo de nuestras tesis.  A la señora Rafaela por su disposición y buen humor.  A la comisión nacional de investigación científica y tecnológica (CONICYT) por premiarme con las becas para: Estudios de doctorado en Chile, 2008, apoyo a la realización de tesis doctoral, 2011 y termino de tesis doctoral 2012.  A MECESUP, por financiar mi viaje de estadía en el Laboratorio del Doctor Sergio Ojeda, en Portland, USA. Índice Lista de Abreviaciones ............................................................................................. 1 Resumen ..................................................................................................................... 3 Abstract ...................................................................................................................... 6 Introducción ............................................................................................................... 9 1.1 Kisspeptina y la función reproductiva ............................................................................ 9 1.2 Kisspeptina en el hipotálamo ........................................................................................ 11 1.3 Kisspeptina en el Ovario................................................................................................ 13 1.4 Participación de la inervación simpática en la función ovárica ............................... 14 2 Hipótesis de trabajo ......................................................................................... 17 3 Objetivo general ................................................................................................ 17 4 Objetivos específicos ....................................................................................... 18 5 Materiales y métodos ....................................................................................... 19 5.1 Animales .......................................................................................................................... 19 5.2 Protocolo de estrés ........................................................................................................ 21 5.2.1 Estrés agudo por frío .............................................................................................. 21 5.2.2 Estrés crónico intermitente por frío ...................................................................... 21 5.3 Administración hipotalámica de MK801 ...................................................................... 22 5.4 Sección del nervio ovárico superior (SONX) .............................................................. 23 5.5 Administración de antagonista de kisspeptina (p234) en el ovario de ratas entre 22 y 50 días de edad ................................................................................................................. 23 5.6 Administración de kisspeptina o un antagonista de kisspeptina en el ovario de ratas sometidas a estrés por frío crónico intermitente .......................................................... 24 Procedimientos experimentales realizados al terminar los protocolos experimentales .. 25 5.6.1 PCR en tiempo real para kisspeptina y GPR54 ................................................. 25 5.6.2 Medición de hormonas esteroidales y LH plasmáticas de rata ....................... 27 5.6.3 Determinación de los niveles del péptido kisspeptina ...................................... 28 5.6.4 Inmunohistoquímica para Kisspeptina en ovario ............................................... 29 5.6.5 Doble inmunofluoresencia para kisspeptina y tirosina hidroxilasa (TH) ........ 30 5.7 Estadística ....................................................................................................................... 31 6 Resultados ......................................................................................................... 32 6.1 Objetivo 1 ......................................................................................................................... 32 6.1.1 Cambios en la expresión de kisspeptina al llegar a la pubertad. Efectos del bloqueo de kisspeptina sobre la ciclicidad estral y la aparición de la pubertad ........... 32 6.1.2 Presencia de kisspeptina y su receptor en ganglio celíaco y ovario .............. 34 6.1.2.1 Inmunodetección de kisspeptina en ovario y ganglio celiaco _________________ 34 6.1.2.2 Kisspeptina y GPR54 se expresan tanto en células de la teca como en células de la granulosa 37 6.1.2.3 Colocalización de fibras inmunoreactivas para kisspeptina y tirosina hidroxilasa en ganglio celiaco ____________________________________________________________________ 38 6.1.3 Estudio de la función de kisspeptina en la pubertad......................................... 40 6.1.3.1 La administración de un antagonista de kisspeptina retrasa la apertura vaginal y altera la ciclicidad estral ____________________________________________________________ 40 6.1.3.2 La administración de un antagonista contra kisspeptina disminuye la esteroidogénesis y la concentración de kisspeptina en el eje ganglio celíaco-ovario. ______ 43 6.2 Objetivo 2 ......................................................................................................................... 46 6.2.1 La activación del receptor β-adrenérgico aumenta el contenido de mRNA que codifica para Kisspeptina en ovario ............................................................................. 46 6.2.2 Estudios de los efectos del estrés sobre el eje hipotálamo-ganglio celíaco- ovario (HGO) ........................................................................................................................... 48 6.2.2.1 El estrés por frío agudo de 64 horas altera de distinta forma la expresión de kisspeptina y su receptor a lo largo del eje HGO _______________________________________ 50 6.2.2.2 La sección del nervio ovárico superior (SONX) disminuye significativamente el mRNA para kisspeptina, a lo largo del eje HGO _______________________________________ 50 6.2.2.3 La sección del nervio ovárico superior (SONX) modifica el efecto del estrés por frío de 64 horas sobre la expresión de kisspeptina y GPR54 a lo largo del eje HGO _______ 51 6.2.2.4 La administración ICV de MK801 disminuyó la expresión de kisspeptina en ovario de rata 54 6.3 Objetivo 3 ......................................................................................................................... 56 6.3.1 La aplicación del estrés por frío crónico de 4 semanas afecta la expresión de kisspeptina y GPR54 a lo largo del eje HGO ..................................................................... 56 6.3.2 La aplicación del estrés por frío crónico de 8 semanas afecta la expresión de kisspeptina y GPR54 a lo largo del eje HGO ..................................................................... 59 6.4 Objetivo 4 ......................................................................................................................... 61 6.4.1 La administración de kisspeptina mediante una bomba osmótica en el ovario disminuye la ciclicidad estral. ............................................................................................... 61 6.4.2 La administración de kisspeptina mediante una bomba osmótica en el ovario aumenta el número de cuerpos lúteos y la producción de progesterona y estradiol .. 66 La administración de antagonista contra kisspeptina mediante una bomba osmótica en el ovario revierte los efectos del estrés por frío .......................................... 69 6.4.3 ........................................................................................................................................... 69 6.4.4 La administración de kisspeptina mediante una bomba osmótica en el ovario mantiene su efecto aún en presencia del estrés por frío crónico aumentando el número de cuerpos lúteos y modificando los niveles de esteroides plasmáticos. ....... 74 7 Discusión ........................................................................................................... 77 7.1 Kisspeptina en el eje ganglio celiaco-ovario .............................................................. 78 7.2 Kisspeptina en el desarrollo .......................................................................................... 80 7.3 Rol de kisspeptina en la pubertad y la ciclicidad estral ............................................ 82 7.4 Efecto del estrés por frío sobre la expresión de kisspeptina en el eje ganglio celíaco-ovario .............................................................................................................................. 84 7.5 Efectos del estrés crónico por frío sobre la expresión de kisspeptina ................... 89 7.6 Efecto de la administración local de kisspeptina sobre el ovario en ratas sometidas a estrés crónico por 4 semanas ............................................................................ 91 8 Conclusiones .................................................................................................... 95 8.1 General ............................................................................................................................. 96 8.2 Proyección ....................................................................................................................... 96 9 Modelo Propuesto ............................................................................................ 97 10 Referencias ........................................................................................................ 98