MANUAL TECNICO DE LA FIJACION SIMBIOTICA DEL NITROGENO LEGUMINOSA/RHIZOBIUM ORGANIZACIONOEUSNACIONESUNIDAS PARALAAGRICULTURATLAALIMENTACION MANUAL TECNICO DE LA FIJACION SIMBIOTICA DEL NITROGENO LEGUMINOSA/RHIZOBIUM ORGANIZACIONDELASNACIONESUNIDAS PARALAAGRICULTURAYLAALIMENTACION Roma,1995 PA64-SUW-DQGE Cf«yrightedmaterial Lasdenominacionesempleadasenestapublicaciónylafoimaen queaparecenpresentadoslosdatosquecontienenoimplican,de partedelaOrganizacióndelasNacionesUnidasparalaAgricultura ylaAlimentación,juicioalgunosobrelacondiciónjurídicade países,territorios,ciudadesozonas,odesusautoridades,ni respectodeladelimitacióndesusfronterasolimites. M-06 ISBN92-5-303199-9 Reservadostodoslosderechos.Nosepodráreproducirningunapartedeesta publicación,nialmacenarlaenunsistemaderecuperacióndedatosotransmitirla encualquierformaoporcualquierprocedimiento(electrónico,mecánico, fotocopia,etc.),sinautorizaciónpreviadeltitulardelosderechosdeautor.Las peticionesparaobtenertalautorización,especificandolaextensióndeloquese deseareproduciryelpropósitoqueconellosepersigue,deberánenviarseal DirectordePublicaciones,OrganizacióndelasNacionesUnidetsparala AgriculturaylaAlimentación,VíaledelleTermediCaracalla,00100Roma,Italia. ©FAO1995 Copyrightedmaterial PREFACIO FAOpersiguelaestrategiadeproducirmásamenorcostoconjuntamenteconla preservacióndelosrecursosnaturales,enelmarcodeunaagriculturasostenible,de maneradesuperarelhambreenelmundo. Elsistemaintegradodenutrición vegetalesunadelasherramientasmás apropiadasparaelestablecimientodetalestrategiaenlacuallafijaciónsimbióticadel nitrógenoatmosféricoesunelementobásico.Sinembargo,sabemosqueestemecanismo biológicoesamenudoafectadoporfactoreslimitantes,tantofísicoscomoquímicoso biológicos,loscualesnecesitanserprimeroidentificadosyluegoreducidosoeliminados. Elpropósitodeestemanualtécnico,editadoporprimeravezen1983,espermitir alostrabajadoresdelcampo, investigadores,técnicosendesarrollo,agrónomosy agricultoresobtenerinformaciónparaunmejorentendimientodelfenómenoobservado yactuarsobrelasimbiosis. Estasegundaedición 1993 hasidopreparadapor Marc Neyra, quien ha modificadolapresentacióntomandoencuentalanecesidaddeasociarlainvestigación encursoysusaplicacionesdecampo. Elmanualconsistedecuatrocapítulosprincipales; Elprimercapítulo("GENE")contienelosaspectosgeneralesquedebemos conocercuandoseencarauntemamultidisciplinariocomoeldela FijaciónBiológica deNitrógeno. Elsegundocapítulo("RHIZ")describevariastécnicas,usadasprincipalmenteen laboratorios,paracaracterizar losmicroorganismossimbióticos,asícomoparasu crecimientoyrecuento. Eltercercapítulo("INCX^")presentaunodelosprincipalesprocedimientospara mejorarlafijaciónsimbióticadenitrógeno:elsuministroderizobiosfijadores.Se establecenlaslimitacionesyseexponenloselementosbásicosparalaproducciónde inoculantesdebuenacalidad. Elúltimocapítulo("EXPE")proponemétodosparaelestudiodelafijaciónde nitrógenoenelcampo,discutelosposiblesenfoquesdeltemayrefiere,cuandoes necesario,alosmétodosdescritosenlaspáginasanteriores. Elavanceseobtieneconjugandolasnecesidadesconelconocimiento.Poresta razón,seagradecenloscomentariososugerenciasquepuedanmejorarestemanual. Copyrightedmaterial MANUALTECNICOSOBREFIJACION FAO SIMBIOTICADENITROGENO RESUMENPAGINA1/2 I. GENE-InformaciónGeneralsobre FijaciónSimbióticadeNitrógeno GENE1InformaciónGeneralsobrelaFgacióndeNitrógeno: A•Definiciónyubicaciónenelciclodelnitrógeno. B- Organismosfijadoresdenitrógeno. C•Importancia y ubicación de diferentes sistemas fijadores de nitrógeno atmosférico. D-Generalidadessobrelafijaciónsimbióticadenitrógenoenplantasactinorrízas. GENE2LasimbiosisRAtzoóium-leguminosa: A-Información general sobre la simbiosis fijadora de nitrógeno Rhizobium- Leguminosa. B- Lafamilialeguminosae. CD--CHliasstiofriicaacyióonrídgeenleossgreiozgorbáiofsi.cosdelasleguminosas. E- AspectosgenéticosdelasimbiosisRhizobium-\egum\nosa. GENE3LafgacióndeNsimbióticoensistemasdecultivo: AB--CUasroasctdereísltaisclasegbuimoilnóogsiacassyysaugriímcpoolratsandceialasecloengóummiicnao.sas. C-Algunosaspectosdelrolydelaubicacióndelasplantasproductorasdeaceitey proteínasenlasrotacionesdecultivosenclimastemplados. II. RHIZ-Aislamiento,identificaciónvrecuentoderizobios RHIZ1Aislamientoypreservaciónderizobios: A-Procedimientoparamuestreoypreservacióndenódulosobtenidosderaícesde leguminosas. B- Preparacióndeunmediodecultivopararizobios. C-AislamientodecepasdeRhiwbium. D-CultivodecepasdeRhizobium. RHIZ2Identificaciónderizobios: A-Losdiferentesmétodosparalaidentificacióndelosrizobios. B- Identificaciónderizobiosusandodostécnicasserológicas. C-Caracterizacióndecepasporunmétodorápidodeaislamientodeplásmidos. RHIZ3Recuentoderizobios: A-Cuantificaciónderizobios:Comparacióndemétodos. B- Recuentoderizobiosusandounatécnicadedilución/estriadoenplacasdePetrí. CD--RReeccuueennttooddeerirziozboiboisosenexeilstseunetleoscoennuenlastuéeclnoicapodreiinnfmeucncoifólnuoernepslcaenntcaisa.sobre membranasdefiltración. Copyrightedmaterial RESUMENPAGINA2/2 III. INQC•ProduccióndeuninoculanteeinocMiaciéndeleguminosas INOC1Introducción: A•Informacióngeneralsobreinoculación. B- Informacióngeneralsobreinoculantes. INOC2Produccióndeuninoculante: A-Selecciónypreparacióndeunsoportepatainoculantes. B- Preparacióndeuncultivoliquidoparainoculaciónenunfermentador. C• DescripciónyutilizacióndeunaparatoparacrecimientodeRhizobiumenmedio líquido. INOC3Controldecalidaddeuninoculante. INOC4Técnicasdeinoculación. IV. EXPE-Experimentos EXAPE-M1éCtuoldtoivdoedceullteigvuomdienopslaanstaesnelnabtourbaotsoreistoé:riles. B- Cultivodeleguminosasensustratoinerte. EXPE2Experimentosdecampo: A-Experimentosdecampo;Eleccióndediseños;característicascomunes. B- Experimentosdecampo:Diseños,observacióneinterpretación. EXPE3EvaluacióndelacompelilividaddecepasdeRhizobiumparalaformación denódulos. EXPE4Estimacióndelaactividaddefijacióndenitrógeno: A-Comparacióndemétodos. B- Análisisdenitrógenototal. C- Evaluacióndelaactividadnitrogenasadenódulosdeleguminosasusandoel métododereduccióndeacetileno. D-UtilizacióndelisótopoISdelnitrógeno. EXPE5Unmétodoempíricosimpleparaevaluaciónenelcampodefactores limitantesdeiaryacióndenitrógeno. EXPE6Estudioscomplementarios: A-Medicióndelcoeficientedeutilizacióndefertilizantesnitrogenados; usodel isótoponitrógeno15enelcampo. B• Métodosparamedirlaactividadnitratoreductasa. EXPE7Resumenestadísticodelanálisisdevarianza. V. INPX-Indice IINNDDXX21D¿iDróencdcieonyescódmeocoolbetcecnieorneisnodceulcaenptaess?deRhizobium. IINNDDXX43DBiibrleicocgiroanfeísa.deautores. Copyrightedmaterial I INFORMACIONGENERALSOBRE FIJACIONSIMBIOTICADE NITROGENO GENE LAFIJACIONBIOLOGICA FAO DELNITROGENOATMOSFERICO: IGENElAPAGINA1/2 DEFINICIONYUBICACIONEN ELCICLODELNITROGENO 1. DERNICION Lafijaciónbiológicadelnitrógenoatmosférico(FBN)eselprocesoporelcualalgunos microorganismosusanelnitrógenocontenidoenelaire,reduciéndoloaamoníacoa travésdeunaenzima llamada nitrogenasa para la produccióndeproteínas. Los microorganismosrijadoresdenitrógenosonbacteriasycianobacterias,devidalibreen elsuelo,eventualmenteasociadosaunaplanta,oviviendoensimbiosisconunaplanta (verIGENEIB).Laenergíarequeridaprovienedelsol(atravésdelafotosíntesis,por enderenovableydistribuidasobretodalasuperficiedelatierra)atravésde; loscarbohidratosdelsuelocuandolosmicroorganismossondevidalibre; losexudadosradicularesparaaquellosasociadosenlarizósferadeunaplanta; directamentedelosproductosdelafotosíntesisdelaplantahuéspedcuandoexiste unasimbiosis. II. NUBIITCRAOCGIEONNODE LA FIJACION BIOLOGICA EN EL CICLO DEL 1. Gananciasdenitrógenoenecoyagrosistemas Elnitrógeno,juntoconelagua,esunodelosfactoreslimitantesmáscomunesdela producción vegetal. Aunque la reserva de nitrógeno molecular (Nj) es enorme p(laatnmtóasfseorna,larsocmaisnesreadliems,entNaHr^i*asyypprriinmcairpiaalsme,nettec.N),O/la.sLúnaicFaBsNfo(r1m)asesasuinmailvaebnlteasjapoprarlaa lasplantasquepuedenhacerusodeellaypermitegananciasmuyimportantesde nitrógenoenlosecosistemas.Existenotrasposibilidadesdesuministrodenitrógeno,pero laFBNrealizalacontribuciónmásimportante(ver1GENEIC),particularmenteatravés delasimbiosisRhizobium-\eg\xminosaexplicadaenestemanual: usodefertilizantesnitrogenados,mineralesuorgánicos(2); suministrodenitrógenoatravésdelluviaysedimentos(3). INFORMACIONADICIONAL . NEnIvEiLrSonEmNenDi.R(2.wleutmeMsa)c.ADcaOcNlcAmLicOPrJe.sGs.,NeedwsY(o1r9k7.8) Nirrogen in the . CLARKF.E.elROSSWALLT.eds(1981)TerreslrialNitrogenCycles. Ecol.Bull.33.714p. Copyrightedmaterial IGENElAPAGINA2/2 2. E2nitrógenosufrealgunastransformacionesdentrodelosecosistemas: mineralizacióndenitrógenoorgánico(fertilizantes,desechosvegetales,rastrojos decosechas,carcasasyhecesdeanimales,etc.)aamonio(= amoniflcación), realizadapormicrofloravariadanoespecífica(4); oxidacióndeamonioanitritoyluegonitrato(=nitríficación)atravésdeuna microfloramuyespecífica(Nitrosomonas,Nitrobacter)(5); absorciónporraícesde plantasdenitratoyamonio(6); imnovilizaciónporlamicrofloradelsueloincorporandonitrógenomineralensus proteínas(7); adsorciónoaünfOacióndeNH4* porarcillasymateriaorgánica(8). 3. Pérdidasdenitrógeno extracciónporcultivos(9); lixiviacióndenitratosquepuedenalcanzarlasnapasfreáticasylos ríos(puede ivonldautciilriezuatcrioófnic(aecnióvna)ri(a1s0)c;ondicionesambientales,principalmenteconpHalto) (11); bdieonliótgriicfai;cacuinóanmqiucríomfilcoara(menuysudeilvoesrsiáfciicdaodsa)ryedupcreinnciitrpaatlomeyntnietridteoniatrpirfoidcuacctioósn gaseosos(N]0,N])cuandohaydeficienciadeoxígeno(12). Elciclodelnitrógeno Copyrightedmaterial