T.C. DOKUZ EYLÜL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ELEKTROMANYETİK ALANA MARUZ KALAN SIÇAN BEYİN DOKUSUNDA OKSİDATİF STRES ÜZERİNE KARNİTİNİN İMMUNOHİSTOKİMYASAL VE YAPISAL ETKİLERİ MÜGE KİRAY HHHİİİSSSTTTOOOLLLOOOJJJİİİ VVVEEE EEEMMMBBBRRRİİİYYYOOOLLLOOOJJJİİİ DOKTORA TEZİ İZMİR-2010 T.C. DOKUZ EYLÜL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ELEKTROMANYETİK ALANA MARUZ KALAN SIÇAN BEYİN DOKUSUNDA OKSİDATİF STRES ÜZERİNE KARNİTİNİN İMMUNOHİSTOKİMYASAL VE YAPISAL ETKİLERİ HHHİİİSSSTTTOOOLLLOOOJJJİİİ VVVEEE EEEMMMBBBRRRİİİYYYOOOLLLOOOJJJİİİ DOKTORA TEZİ MÜGE KİRAY Danışman Öğretim Üyeleri: Doç. Dr. Bekir Uğur ERGÜR Prof. Dr. Candan ÖZOĞUL Bu ara ştırma DEÜ Bilimsel Ara ştırma Projeleri Şube Müdürlü ğü taraf ından 2006.KB.SAG.003 sayı ile desteklenmiştir. 2 İÇİNDEKİLER Sayfa no TABLO LİSTESİ ...................................................................................................vi ŞEKİL LİSTESİ ....................................................................................................vii KISALTMALAR...................................................................................................viii ÖZET......................................................................................................................1 YABANCI DİLDE ÖZET ......................................................................................2 1. GİRİŞ VE AMAÇ ...............................................................................................3 2. GENEL BİLGİLER ............................................................................................6 2.1. Elektromanyetik Alan......................................................................................6 2.1.1. Elektriksel Alan ..........................................................................................6 2.1.2. Manyetik Alan .............................................................................................7 2.1.3. Elektromanyetik Alan ..................................................................................7 2. 1. 3.1.Elektromanyetik Alan Oluşumundaki Temel Teoriler…………………..…8 2.1.3.1.1. Helmholts Teorisi………………………………………..…………….…….8 2.1.3.1.2. Selenoid Boru Teorisi…………………………………………….…………8 2.1.3.2. Elektromanyetik Alanların Ölçü Birimleri…………………………….………8 2.1.3.3. Manyetik Alanın İnsan Sağlığı Üzerine Etkisi………………………………9 2.1.3.3.1. Elektromanyetik alanın santral sinir sistemi üzerine etkileri…………….9 2.1.3.4. EMA’nın olası etki mekanizmaları……………………………………….…10 2.2. Serbest radikal; tanımı ve yapısı ..................................................................11 2.2.1. Serbest radikaller ve reaktif oksijen türleri ................................................12 2.2.3. Serbest radikallerin kaynakları ..................................................................13 2.2.2.1. Endojen kaynaklar...................................................................................13 2.2.2.1.1. Mitokondrial ve endoplazmik retikulum elektron transport zinciri ...............................................................................................13 2.2.2.1.2. Nötrofil fagositoz sistemi .....................................................................14 2.2.2.1.3. Ksantin oksidaz sistemi .......................................................................14 2.2.2.1.4. Araşidonik asit metabolizması .............................................................14 2.2.2.1.5. Enzimatik olmayan reaksiyonlar ..........................................................15 3 2.2.2.2. Eksojen kaynaklar ..................................................................................15 2.2.3. Serbest radikaller ile oluşan hücresel hasarlar .........................................15 2.2.3.1. Lipid Peroksidasyonu ........................................................................................15 2.2.3.2. DNA ve serbest radikal hasarı ..........................................................................16 2.2.3.3. Proteinler ve serbest radikal hasarı ..................................................................16 2.2.3.4. Karbonhidratlar ve serbest radikal hasarı .........................................................17 2.3. Antioksidan savunma mekanizmaları .....................................................................17 2.3.1. Antioksidan savunma enzimleri ...........................................................................18 2.3.1.1. Süperoksid dismutaz (SOD) .............................................................................18 2.3.1.2. Katalaz (CAT) ...................................................................................................19 2.3.1.3. Glutatyon Peroksidaz (GPx) .............................................................................19 2.3.2. Diğer antioksidan moleküller ................................................................................20 2.3.2.1. Glutatyon ..........................................................................................................20 2.3.2.3. Nutrisyonel antioksidanlar ................................................................................20 2.4. Beyin ve serbest radikaller......................................................................................21 2.5. Apopitoz .................................................................................................................22 2.5.1. Apopitoz ve hücre morfolojisi………………………………………………………...24 2.5.2. Apopitozun moleküler mekanizması…………………………………………………26 2.5.3. Apopitoz saptama yöntemleri…………………………………………………………28 2.6. Merkezi sinir sistemi……………………...................................................................29 2.7. Hippokampal formasyon..........................................................................................31 2.8. Karnitin ……………………………………………………………..……………………..31 2.8.1. Karnitin biyosentezi..……….…………………………………………………………..32 2.8.2. Karnitin ve metabolik işlevleri…………………………………………………………32 2.8.3. Karnitin ve nöron koruyucu etkisi……………………………………………………..34 2.8.4. Karnitin ve oksidatif stres…………………………………………...…………………36 3.GEREÇ VE YÖNTEM .................................................................................................38 3.1. Çalışma grupları ....................................................................................................38 3.2. EMA oluşturulması ..................................................................................................38 3.3. Doku örneklerinin hazırlanması ..............................................................................39 3.3.1. Işık mikroskopik doku takibi…………………………………………………………...39 3.3.2. Krezil violet ile boyama yöntemi………..…………………………………...………..40 4 3.3.3. TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling) Tekniği ile Boyama ……………………………………………………………………………40 3.3.4. İndirekt İmmünohistokimya Yöntemi…………………………………………………41 3.3.5. Elektron mikroskopik inceleme……………………………………………………….41 3.4. Homojenizasyon………………………………………………………………………….42 3.5. Enzim aktiviteleri ve TBARS düzeylerinin saptanması ...........................................42 3.6. İstatistik değerlendirme ...........................................................................................43 4.BULGULAR ................................................................................................................44 4.1. MDA sonuçları ........................................................................................................44 4.2. SOD ve GPx enzim aktivitesi sonuçları ..................................................................46 4.3. Işık mikroskopik bulgular…………………………………………………………...……49 4.3.1. Krezil violet boyama………………………………………………………………...….49 4.3.2. TUNEL boyama……………………………………………………………………...…52 4.3.3. Aktive kaspaz-3 immunohistokimyasal boyama…………………………………….55 4.3.4. Elektron mikroskopik inceleme………………………………………………………..58 5.TARTIŞMA .................................................................................................................61 6. SONUÇ VE ÖNERİLER ............................................................................................66 7. KAYNAKLAR ............................................................................................................67 5 TABLO LİSTESİ Sayfa no Tablo 1. Tüm grupların MDA değerleri (µM – SH)...............................................45 Tablo 2. Tüm grupların SOD aktivitesi değerleri (U/mL – SH).............................46 Tablo 3. Tüm grupların ortalama GPx aktivitesi değerleri (U – SH)....................48 Tablo 4: Prefrontal korteks ve hipokampus bölgelerindeki hücre sayıları……….51 6 ŞEKİL LİSTESİ Sayfa no Şekil 1. Ortalama MDA değerleri .........................................................................44 Şekil 2. SOD enzim aktiviteleri ............................................................................46 Şekil 3. GPx enzim aktiviteleri .............................................................................48 Şekil 4. Krezil Violet boyama (prefrontal korteks)................................................49 Şekil 5 Krezil Violet boyama (hipokampus)..........................................................50 Şekil 6. TUNEL boyama (prefrontal korteks)........................................................52 Şekil 7. TUNEL boyama (hipokampus)................................................................53 Şekil 8: TUNEL (+) hücre oranı…………………………………..…………………..54 Şekil 9. Aktive antikaspaz-3 immunohistokimyasal boyama (prefrontal korteks)……………………………………………………..…………….......55 Şekil 10: Aktive antikaspaz-3 immunohistokimyasal boyama (hipokampus)……………………………………………………………..56 Şekil 11: Antikaspaz-3 (+) hücre oranı………….……………………………..…….57 Şekil 12. Sham grubu elektron mikroskopik görüntüleri…………………..…..…...58 Şekil 13. EMA grubu elektron mikroskopik görüntüleri…………………..…..…....59 Şekil 12. EMA+KAR grubu elektron mikroskopik görüntüleri………………….….60 7 KISALTMALAR EMA……………………………………………………………Elektromanyetik Alan GPx…………………………………………..………………..Glutatyon Peroksidaz GSH…………………………………………………………...İndirgenmiş Glutatyon GSSG……………………………………………..…….…Yükseltgenmiş Glutatyon H O …………………………………………………………….....Hidrojen Peroksid 2 2 MDA……………………………………………………………………Malondialdehit MSS………………………………………………….…………Merkezi Sinir Sistemi NO………………………………………………………………………....Nitrik Oksid O -• ……………………………………………………………....Süperoksid radikali 2 •OH …………………………………………………………………Hidroksil Radikali 1O ……………………………………………………………………..Singlet Oksijen 2 ROS…………………………………………………………...Reaktif Oksijen Türleri SOD…………………………………………………..………..Süperoksid Dismutaz 8 ÖZET ELEKTROMANYETİK ALANA MARUZ KALAN SIÇAN BEYİN DOKUSUNDA OKSİDATİF STRES ÜZERİNE KARNİTİNİN İMMUNOHİSTOKİMYASAL VE YAPISAL ETKİLERİ Müge KİRAY Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji&Embriyoloji ABD Balçova, İzmir Bu çal ışmada Elektromanyetik Alana (EMA) maruz b ırakılan sıçanlarda, beyin dokusunda karnitinin yap ısal, antiapopitotik ve oksidatif stres üzerine etkilerini incelemek amaçlanmıştır. Çalışmada Wistar cinsi yeti şkin erkek s ıçanlar (250-300 g) kullan ıldı. Çal ışma grupları şu şekilde olu şturuldu: I. grup: Sham grubu. EMA’na maruz kalma ve enjeksiyon uygulaması yok (n=10). II. grup: EMA+S grubu. EMA’na maruz kalan ve serum fizyolojik uygulanan s ıçanlar (n=10, 1 ml/kg, po, 30 gün). III. grup: EMA+KAR grubu. EMA’na maruz kalma+L-karnitin uygulanan s ıçanlar (n=10, 300 mg/kg, po, 30 gün). EMA+S ve EMA+KAR gruplar ına 30 gün süreyle 50 Hz, 3 mT, 4 saat/gün EMA uygulandı Sham grubuna EMA veya ilaç uygulanmad ı. Deney sonunda oksidatif stres parametrelerinden lipid peroksidasyon ürünleri (malondialdehit; MDA), antioksidan enzimlerden süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx), apopitozu göstermek için TUNEL ve aktive antikaspaz-3 immunohistokimyasal incelemeler yapıldı. Gruplar arasındaki farklar one-way ANOVA posthoc Bonferroni testi ile de ğerlendirildi. P< 0.05 anlamlılık düzeyi esas alındı. EMA+S grubunda MDA de ğerleri, prefrontal korteks, striatum ve hipokampus bölgelerinde sham ve EMA+KAR gruplar ına göre anlamlı olarak yüksek bulundu. SOD ve GPx enzim aktiviteleri her üç beyin bölgesinde, sham ve EMA+KAR gruplar ında EMA+S grubuna göre anlaml ı olarak yüksek bulundu. EMA+S grubunda apopitotik hücre yoğunluğu sham ve EMA+KAR gruplarına göre yüksek olarak bulundu. Sham ve EMA+KAR gruplarının sonuçları benzerlik göstermekteydi. Sonuç olarak bu çal ışmada beynin farkl ı bölgelerinde EMA’n ın neden oldu ğu hasarlara karşı karnitinin koruyucu etkisi ilk kez gösterilmiştir. Karnitin antioksidatif etkisi aracılığıyla antiapopitotik etki gösterebilmektedir. Anahtar kelimeler: Elektromanyetik alan, beyin, oksidatif stres, apopitozis, karnitin SUMMARY 9 THE IMMUNOHISTOCHEMİCAL AND STRUCTURAL EFFECTS OF CARNITINE ON OXIDATIVE STRESS IN ELECTROMAGNETIC FIELD EXPOSED RAT BRAINS Muge KIRAY Dokuz Eylul University Medical School Departments of Histology&Embryology Balcova, Izmir The aim of this study was to investigate the effects of carnitine on apoptosis and oxidative stres in electromagnetic field (EMF) exposed rat brains. In this study, male Wistar rats (250-300 g) were used. Rats were divided in three groups; group I: Sham group (n=10) was not exposed to EMF. Group II was exposed to EMF and received physiological saline solution for 30 days (EMF+S, n=10, 1 ml/kg, po). Group III was exposed to EMF and received L-carnitine for 30 days (EMF+CAR, n=10, 300 mg/kg, po). Rats in EMF+S and EMF+CAR groups were exposed to 50 Hz, 3 mT EMF for 30 days (4 h/day). Subsequently, oxidative stress markers (malonedialdehid; MDA), antioxidative enzymes (superoxide dismutase; SOD and glutathione peroxidase; GPx), TUNEL and active-anticaspase-3 immunohistochemistry for apoptosis were examined in each group. All data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) post hoc Bonferroni test. P< 0.05 was considered statistically significant. MDA levels in prefrontal cortex, striatum and hippocampus regions were significantly higher in EMF+S rats than those in sham and EMF+CAR rats. SOD and GPx enzyme activities in all brain regions were significantly higher in sham and EMF+CAR rats than those in EMF+S rats. Apoptotic cell death was increased in EMF+S group. The results of sham and EMF+CAR rats were similar. In conclusion, the protective effect of carnitine on EMF-induced damage in brain tissue was demonstrated firstly in the present study. Carnitine exhibits antiapoptotic effect via its antioxidative properties. Key words: Electromagnetic field, brain, oxidative stress, apoptosis, carnitine 10