Leonardo Arduino Marano ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE MC1R ASSOCIADOS A FENÓTIPOS HUMANOS DE PIGMENTAÇÃO NA POPULAÇÃO BRASILEIRA Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Área de Concentração: Genética Orientador: Prof. Dr. Celso Teixeira Mendes Junior Ribeirão Preto 2011 Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. Catalogação da Publicação Departamento de Genética Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo Marano, Leonardo Arduino ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE MC1R ASSOCIADOS A FENÓTIPOS HUMANOS DE PIG MENTAÇÃO NA POPULAÇÃO BRASILEIRA/ Leonardo Arduino Marano ; orientador Celso Teixeira Mendes Junior – Ribeirão Preto, 2011. Número de páginas: 130 Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, 2011 1 – MC1R. 2 – polimorfismos. 3 – pigm entação. 4 – população brasileira Nome: Leonardo Arduino Marano Título: ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE MC1R ASSOCIADOS A FENÓTIPOS HUMANOS DE PIGMENTAÇÃO NA POPULAÇÃO BRASILEIRA Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências Área de Concentração: Genética Aprovado em:_______________ Banca Examinadora Prof. Dr. ________________________Instituição_____________ Julgamento:_____________________Assinatura_____________ Prof. Dr. ________________________Instituição_____________ Julgamento:_____________________Assinatura_____________ Prof. Dr. ________________________Instituição_____________ Julgamento:_____________________Assinatura_____________ Dedico este trabalho aos meus pais e amigos Agradecimentos Inicialmente agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Celso Teixeira Mendes Junior, pela disponibilidade, boa vontade, paciência e ensinamentos oferecidos. Agradeço por ter sido tão brilhante em sua primeira orientação de Mestrado e por ter colaborado infinitamente em minha formação profissional; Ao Prof. Dr. Aguinaldo Luiz Simões por todo conhecimento compartilhado e ensinamentos durante esses mais de dois anos de convivência; Ao Prof. Dr. Eduardo Antônio Donadi, por ter gentilmente cedido seu laboratório, sem o qual, esse trabalho não teria sido realizado; A todo o pessoal que conviveu comigo no laboratório do anexo A (Maria, Olívia, João, Yara, Breno, Erick, Luciana, Camila e o amigo Rafael (Xixa), que mesmo preferindo o laboratório do HC, aparecia às vezes por lá; A todas as meninas da genética (Nadia, Lidia, Edilene, Natália, Cláudia Caixeta, Edna, Cláudia Wiezel, Juliana, Renata, Yara (novamente) e Flávia Japa (Just Call my Name, Just Call my Name, Salzano!!! Hahaha); Ao pessoal da 41ª turma de Biologia da USP Ribeirão, por ainda tentarmos manter contato, mesmo com a correria que nossa vida se tornou (graças a Deus) e principalmente às meninas da Terra do Nunca (Carol, Gi e Carlinha), por entenderem que às vezes eu dou uma desaparecida, mas que não me esqueço de vocês; Às queridas técnicas Maria e Ana Lúcia, por todo o apoio, disposição e conhecimento compartilhado (prometo dar menos trabalho pra vocês hehehe); Às técnicas do anexo A, Flávia e Sandra, pela convivência, pelos ensinamentos, pela paciência e pela disponibilidade em sempre me ajudar; À minha família, por todo apoio que sempre me deram nessa minha caminhada como pesquisador, pelo orgulho que têm de mim e pelo amor de sempre; Ao Gustavo, não só por toda ajuda possível no ambiente de trabalho, me acompanhando e me ensinando a rotina de laboratório, mas por ser, antes de tudo, um grande amigo. Merci, mon ami. A todos os doadores voluntários, sem o qual essa pesquisa não poderia ser desenvolvida; À Deus, por estar sempre pronto para nos auxiliar, mesmo quando nos esquecemos de sua presença. “When you open your mind to the impossible, sometimes you find the truth” Dr. Walter Bishop RESUMO Marano, L.A. ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE MC1R ASSOCIADOS A FENÓTIPOS HUMANOS DE PIGMENTAÇÃO NA POPULAÇÃO BRASILEIRA. 2011. 130 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011. Dentre os genes conhecidos por influenciarem a variação normal de pigmentação de olhos, pele e cabelos em humanos, o gene MC1R (receptor de melanocortina 1) é o mais bem caracterizado até o momento. A atuação do MC1R ocorre pela produção de uma proteína transmembrana nos melanócitos, responsável pela regulação da produção de melanina nos mesmos. Sabe-se que a atuação do MC1R determina a proporção entre eumelanina (coloração castanha/preta) e feomelanina (coloração amarela/vermelha) presente nos melanócitos. O presente trabalho tem como objetivo analisar os SNPs conhecidos do gene MC1R com o propósito de se avaliar a influência da diversidade deste gene em características como a presença de sardas e variação da pigmentação dos olhos, pele e cabelos em humanos. Foram analisados 29 SNPs conhecidos da região codificadora do gene MC1R em 131 indivíduos da região de Ribeirão Preto, SP. A extração do DNA foi feita pela técnica de salting-out. A região codificadora do gene MC1R (951pb) foi amplificada em uma única reação de PCR, a qual foi seqüenciada em um analisador genético ABI-PRISM 310 por eletroforese capilar, utilizando-se os mesmos primers empregados para a amplificação. Dos 29 SNPs avaliados, 22 deles mostraram variação nas amostras estudadas, sendo que metade deles demonstrou estar associados a características de pigmentação. Observou-se um conjunto de SNPs associados claramente à fenótipos relacionados à feomelanina (+1645 A, +1831 T,+1858 T e +2260 C), enquanto outros se relacionam à ocorrência de eumelanina (+1558 G, +2322 G, +2346 A).A reconstrução de haplótipos gerou 31 haplótipos, sendo que quatro deles estavam associados à pele escura e dois outros tinham freqüências significativamente baixas em pele clara. Um haplótipo se associou a olhos verdes, enquanto dois outros tiveram associação com olhos castanho escuros. Cores escuras de cabelo se relacionaram à seis haplótipos distintos enquanto cabelos ruivos estavam associados à dois e um outro associado à cabelos loiros. Por fim, a ocorrência de sardas foi significativamente relacionada à três haplótipos. O presente trabalho apresenta associações significativas entre SNPs individuais e pigmentação de olhos, cabelos e pele, sendo que nosso dados confirmam que tal gene também desempenha papel relevante na variação de pigmentação na população Brasileira. Palavras-chave: MC1R; polimorfismos; pigmentação; pele; olhos; cabelo; população brasileira ABSTRACT Marano, L.A. MC1R GENE POLYMORPHISMS ANALYSIS ASSOCIATED WITH HUMAN PIGMENTATION PHENOTYPES ON THE BRAZILIAN POPULATION. 2011. 130 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011. Among the known genes influencing eye, skin and hair normal pigmentation variation, the MC1R (melanocortin 1-receptor) gene is the best characterized so far. The activity of MC1R occurs due the production of a transmembrane protein in melanocytes, responsible for regulating the production of melanin. It is known that the performance of MC1R determines the ratio of eumelanin (brown color / black) and pheomelanin (yellow / red) present in melanocytes. This study aims to analyze known SNPs of the MC1R gene in order to evaluate the influence of this gene diversity on features like freckles and pigmentation variation of eyes, skin and hair in humans. We analyzed 29 known SNPs in the coding region of MC1R gene in 296 individuals from the region of Ribeirão Preto, Brazil. DNA extraction was performed using the salting-out technique. The MC1R gene coding region (951pb) was amplified in a single PCR reaction, which was sequenced on a ABI PRISM-310 genetic analyzer by capillary electrophoresis, using the same primers used for amplification. Of the 29 SNPs evaluated, only 22 showed variation in the samples studied, half of them showing to be associated with pigmentation characteristics. We observed a set of SNPs clearly associated to pheomelanin (+1645 A, +1831 T,+1858 T e +2260 C), while others related to eumelanin occurrence (+1558 G, +2322 G, +2346 A).Haplotype reconstruction generated 31 haplotypes. Four of them were associated with dark skin and two had significantly low frequencies in fair skin. One haplotype was associated with green eyes, while two other had association with dark brown eyes. Darker hair color was associated with six different haplotypes, whereas red hair was associated with two and blonde hair with one haplotype. Finally, the absence or presence of freckles was significantly related to three haplotypes. Our study shows significant associations between individual SNPs and eyes, hair and skin pigmentation. The results presented here confirm that this gene also plays a relevant role in the pigmentation variation in the Brazilian population. Keywords: MC1R; polymorphisms; pigmentation; skin; eyes; hair; brazilian population SUMÁRIO 1 – INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 1 1.1 Identificação humana com fins forenses ............................................................................ 2 1.2 Polimorfismos de DNA ........................................................................................................ 3 1.3 Associação entre marcadores genéticos e características físicas ....................................... 8 1.4 Biologia da pigmentação ................................................................................................... 10 1.5 População Brasileira .......................................................................................................... 19 2 – JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS .................................................................................................. 22 2.1 Objetivo Geral ................................................................................................................... 24 2.2 Objetivos Específicos ......................................................................................................... 24 3 – MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 25 3.1 Amostra populacional ....................................................................................................... 26 3.2 Determinação das características dos indivíduos ............................................................. 26 3.3 Análise Laboratorial .......................................................................................................... 27 3.4 Análises estatísticas dos dados ......................................................................................... 33 4 – RESULTADOS ......................................................................................................................... 41 4.1 Amostra populacional ....................................................................................................... 42 4.2 Freqüências alélicas e heterozigose .................................................................................. 44 4.3 Equilíbrio de Hardy Weinberg ........................................................................................... 45 4.4 Reconstrução haplótipos .................................................................................................. 46 4.5 Desequilibrio de ligação .................................................................................................... 53 4.6 Network ............................................................................................................................ 61 4.7 Associações encontradas .................................................................................................. 63 5 – DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 69 5.1 Dificuldades laboratoriais ................................................................................................. 70 5.2 Aspectos Populacionais ..................................................................................................... 71 5.3 Associações encontradas .................................................................................................. 77 6 – CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................................................. 88 7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................. 91 APÊNDICES ................................................................................................................................ 100 1 1 – INTRODUÇÃO