Fino a pochi anni fa conosciute solo da pochi specialisti, le malattie da prioni sono diventate uno spauracchio per i politici e una oscura minaccia per i consumatori. Ma qual è la verità su questa strana infezione? di Adriana Giannini i sentono discriminati gli amanti della «fiorentina» divenuta fuo- rilegge dal 31 marzo e, in effetti, se nel nostro paese non si im- pedisce a un fanatico delle grosse cilindrate di acquistare l'auto dei suoi sogni o a un fumatore di perseverare nel suo vizio, non è 3 ben chiaro perché si debbano proteggere con tanto rigore i man- giatori di costate. Il fatto è che qualcosa bisogna pur fare per ri- S mediare al distacco con cui nel nostro paese si sono ascoltati negli anni passati gli allarmi provenienti dall'Inghilterra, dall'Irlanda, dal Porto- gallo, dalla Svizzera e dalla Francia, i paesi in cui - in ordine decrescente - sono stati riscontrati i casi più numerosi di mucca pazza. In effetti, fino al 2000 il no- -•g2 stro paese poteva vantare due soli casi segnalati nel 1994, casi che però sono già diventati 11 nei primi tre mesi di quest'anno, da quando si è deciso di com- ne piere, sui bovini di età superiore ai 30 mesi portati nei macelli, test rapidi segui- -% ti, in caso di non negatività, da test di conferma. 3? solo mediante l'autopsia, quando è troppo Al centro della lotta tardi per prevenire il contagio. Tra l'altro non è detto che non esistano altre vie di trasmissione della malattia oltre all'inge- eperduto nelle verdi campagne delle Fiandre, vicino alla cittadina di Geel, c'è il stione; tanto è vero che, negli Stati Uniti, ..)quartier generale della lotta alla BSE. È l'Institute for Reference Materials and non si accettano più donazioni di sangue Measurement (IRMM), uno dei centri di ricerca della UE facenti capo al Joint da cittadini provenienti da paesi europei. Research Centre (JRC). «Noi non operiamo sui materiali - puntualizza Heinz L'ingestione è stata comunque la via Schimmel, uno dei responsabili del progetto di lotta alla BSE - bensì sui metodi.» attraverso cui si sono infettati i bovini ammalati. Tranne qualche caso, non del Come ente per la certificazione delle procedure di ricerca e misura (in ogni campo), tutto chiarito, erano stati tutti nutriti con l'IRMM è infatti secondo, per importanza e risultati, solo allo statunitense NIST. mangimi addizionati di farine animali, L'IRMM aggiorna costantemente centinaia di laboratori di analisi sui miglioramenti per aumentare la produttività, ed erano nelle procedure da seguire, li rifornisce di campioni e prescrive le modalità così sicuramente incappati in resti infetti. con cui operare per avere un monitoraggio e rapporti il più possibile omogenei, I prioni resistono infatti ai trattamenti più e quindi confrontabili. drastici e non è certo l'alta temperatura o In nove mesi, a partire dall'autunno 1998, l'IRMM ha preparato e spedito ai l'acidità dello stomaco a distruggerli. laboratori d'analisi della DE oltre 14 000 campioni standardizzati per la valutazione Anche per la variante umana la re- sponsabilità va attribuita all'ingestione. dei casi sospetti di BSE: è dall'esame dei 5290 rapporti che ne sono scaturiti che è Per una sfortunata combinazione il prio- nato l'attuale vasto programma di controllo. ne patologico che infetta i bovini è simile Oltre alla supervisione sui test ora in corso, l'IRMM cura lo sviluppo di un a quello umano e può moltiplicarsi all'in- protocollo per individuare la BSE in fase pre-clinica: per questo sta lavorando con terno del tessuto cerebrale dell'uomo. Or- 146 campioni di cervello e di midollo spinale e 25 prelievi omogeneizzati. Per mai tutti sanno quali sono i tessuti più pe- comprendere la delicatezza delle operazioni, Schimmel, indicando l'involucro di ricolosi ma, secondo alcuni esperti, prima plastica che sigilla il contenitore con il campione e gli strumenti, dice: «Anche la che questo fosse del tutto chiaro, hambur- plastica andrà bruciata: solo con il fuoco si cancella ogni rischio». ger e salsicce che spesso contengono frammenti di tessuto nervoso, milza o al- In collaborazione con altri istituti, tra cui il JRC di Ispra, l'IRMM sta sviluppando Vedremo che cosa succederà nei prossi- GLI ENORMI VACUOLI visibili nella microfotografia della pagina precedente, eseguita presso i tre parti a rischio potrebbero essere stati anche altri filoni di ricerca. Di recente, per esempio, ha messo a punto test per mi mesi in quanto, da luglio, in tutta l'U- laboratori del Dipartimento di patologia animale dell'Università di Torino, sono il tipico segno della un veicolo di contagio. Ciò spiegherebbe nione Europea i bovini di età superiore ai encefalopatia spongiforme bovina riscontrabile nel cervello degli animali macellati. l'identificazione di mangimi a base di ossa d'altri animali. Un ulteriore programma l'incidenza della variante umana tra i gio- 30 mesi dovranno essere sottoposti ai test I dati della tabella sottostante sono quelli ufficiali dell'Unione Europea a metà gennaio 2001 (sito: riguarda la possibilità che la malattia da prioni colpisca anche la pecora. In questo vani inglesi, notoriamente affezionati per la BSE, oppure dovranno essere elimi- europa.eu.int/comm/food/bse/bse 26_en.pdf). Al 31 marzo i casi italiani erano però già saliti a 11, di quadro si sta indagando anche la possibilità che altre patologie degli ovini possano consumatori di questo tipo di cibi. nati dalla catena alimentare. Una misura cui uno importato, così come importati erano i due casi del 1994. In quella data i controlli eseguiti aggravarsi «approfittando» della presenza dei prioni. I risultati finali sullo sviluppo drastica, che alcuni paesi come Francia e nel nostro paese erano arrivati a circa 65 000. Sui risultati dei test il Ministero della Sanità fornisce di questi test si avranno peraltro soltanto fra quattro o cinque anni. I problemi dei test diagnostici Germania hanno messo in atto già a gen- un aggiornamento quotidiano sul sito: www.sanitait/sanita/comunicati_stampa/defauft.asp. naio e che in Germania ha previsto anche I test rapidi sono eseguiti post mortem l'abbassamento dell'età a 24 mesi. Cencefalopatia spongiforme bovina nel mondo su campioni di tronco encefalico e forni- Ma qual è il rischio reale che i 182 507 scono l'esito in 36-48 ore. Tre sono i tipi casi di BSE riscontrati fino al 31 gennaio di test attualmente previsti dalle normati- 2001 in tutto il mondo si traducano in ca- Paesi fino al 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Totale ve europee: Prionics Check, che si basa su si della temuta variante della malattia di una procedura di tipo Western blot, per Creutzfeldt-Jakob, l'encefalopatia umana Regno Unito 442 2473 7166 14294 25202 37056 34829 24290 14475 8090 — 4335 3197 2280 1312 0 179441 l'identificazione di frammenti di proteina indotta dai prioni infettivi bovini che por- Germania O 0 O 0 0 1 0 3 0 0 2 O 0 7 7 20 prionica resistenti alla proteasi mediante ta in pochi anni alla demenza, all'invali- Belgio O O O O O O O O O O 1 6 3 9 0 19 anticorpi monoclonali; Enfer, un test tipo dità e alla morte? Come spiega Piero Par- Danimarca O O O O O 1 O O O O O 0 0 1 1 3 ELISA chemioluminescente che utilizza chi nell'articolo a pagina 50, i fattori di ri- Spagna O O O O O O O o o o o O 0 2 3 5 anticorpi policlonali; e un immunosaggio schio dipendono non solo dal ceppo di Francia O o o o 5 o 1 4 3 12 6 18 31 162 6 248 «a sandwich» per la proteina prionica resi- prione infettivo, ma anche dalla predispo- Irlanda 0 0 15 14 17 18 16 19 16 74 80 83 95 152 0 599 stente eseguito dopo un processo di dena- sizione genetica degli individui. Italia O O O O 0 0 0 2 0 0 0 O O 0 1 3 turazione e di concentrazione. Qualche rassicurazione viene dal fatto Lussemburgo O O O O 0 o o o o o i O o o o Basandosi sulla ricerca della proteina, e che, come scrive Manfred Eigen nell'arti- Paesi Bassi O o o o o o o o o o 2 2 2 2 1 9 non delle lesioni tipiche della malattia, i 1 colo a pagina 40, la probabilità del pas- Portogallo O O 0 1 1 3 12 14 29 30 106 170 136 0 503 test rapidi hanno una sensibilità superiore saggio dei prioni patologici dalla specie all'esame istopatologico e permettono di bovina a quella umana esiste, ma è molto Totale senza U.K. 0 0 15 15 23 21 20 40 33 115 122 215 301 471 19 1410 identificare la patologia prima della com- bassa. Gli 87 casi di variante umana della parsa dei segni clinici. Nell'esperienza malattia sui 179 000 bovini sicuramente Totale U.E. 442 2473 7181 14309 25225 3707? 34849 24330 14508 8205 4457 3412 2581 1783 19 180851 francese, per esempio, i test risultavano affetti da BSE nel Regno Unito sono indi- positivi anche quando i campioni di ani- cativi, ma non del tutto consolanti. La *sola dagtin O 6 6 22 67 109 111 55 33 11 9 3 0 o 437 mali infetti erano diluiti di 10-20 volte. moltiplicazione del prione infettivo è in- Jersey O 1 4 8 15 23 35 22 10 12 5 8 6 3 o 152 Va però detto che secondo alcuni studi la Ihemsey fatti lenta, nell'ordine di anni, ma, d'altro 4 34 52 83 75 92 115 69 44 36 44 25 11 11 o 695 positività ai test inizierebbe solo poco pri- lato, non disponiamo di metodi in grado Liechtenstein O O O O O O O O O O O 2 0 o 2 ma del manifestarsi dei primi segni clinici. di evidenziare la malattia nel sangue o in libizzera O O 0 2 8 15 29 64 68 45 38 14 50 33 O 366 Da dicembre la società svizzera che altri liquidi organici accessibili. Per ora, Altri O o 3 O o O 1 o o O o o o o o 4 produce uno dei test rapidi sta cercando di quindi, sia negli uomini sia negli animali sviluppare un test per identificare l'infe- la malattia si diagnostica con sicurezza Totale mondiale 446 2514 7246 14424 25390 37316 35140 24540 14663 8309 4553 3466 2651 1830 19 182507 zione con un semplice esame del sangue. 38 39 LE SCIENZE 393 / maggio 2001 www.lescienzeit Gli attuali test possono rivelare se gli animali macellati sono affetti dalla malattia della mucca pazza in uno stadio avanzato, ma sono ancora ben lontani dall'accertare se un taglio di carne è sicuro. Un aiuto potrà venire solo da un'approfondita conoscenza dei meccanismi di moltiplicazione degli agenti patogeni della BSE e di altri prioni infettivi 40 a quando sono emersi i primi casi della malattia della mucca pazza in Europa la sigla BSE - dal nome malattie da prioni in «Le Scienze» n. 319, marzo 1995, riprodot- to anche nel Quaderno n. 114, Epidemie). Prusiner è riuscito a scientifico inglese della malattia, l'encefalopatia spongiforme bovina - ha fatto la sua comparsa nei me- dimostrare che una piccola proteina con la medesima sequenza dia, scatenando forte allarme tra la popolazione. La malattia deve il suo nome alla degenerazione spu- di amminoacidi è normalmente presente negli organismi sani, in gnosa del sistema nervoso centrale che si manifesta nello stadio finale della malattia nei bovini che ne cui svolge una funzione ancora sconosciuta. Per entrambe le proteine - quella normale e quella patologica - Prusiner ha co- sono colpiti. Al livello attuale delle conoscenze sappiamo che la BSE può essere trasmessa agli esseri niato il concetto di prione, introducendo la corrispondente sigla umani provocando, dopo un periodo di incubazione di uno o più anni, una nuova variante della malattia PrP (proteina prionica). Egli ha inoltre distinto le due proteine indicando con il suffisso c (per «cellula») la forma normale e col di Creutzfeldt-Jakob, che si conclude con la demenza progressiva e la morte. (La forma classica del- suffisso sc la variante infettiva, patologica. Quest'ultimo suffisso la malattia di Creutzfeldt-Jakob, nota già da molto tempo, presenta lo stesso decorso, ma non è contagiosa: ha origi- fa riferimento alla malattia osservata da molto tempo negli ovi- ni, lo scrapie, sulla quale Prusiner iniziò le sue ricerche all'inizio ne spontaneamente, con una probabilità estremamente bassa.) degli anni ottanta (quando la BSE non era ancora nota). La PrPc Quanto è grande il rischio di infezione? Che cosa si può man- e la PrPsc si differenziano esclusivamente per il modo in cui la giare senza pericolo? Quanto sono sicuri i test? Quanto è lunga catena degli amminoacidi è avvolta. l'incubazione nei bovini e nell'uomo? Finora non siamo in gra- Una singola molecola di PrPsc non è peraltro ancora conta- do di dare risposte esatte e definitive a queste importanti do- giosa. L'«unità infettiva» - ossia la quantità minima che può sca- mande perché non sappiamo ancora con certezza in che modo tenare un'infezione - comprende almeno 100 000 molecole di l'agente della malattia della mucca pazza si moltiplichi nel cor- PrPw. Lo si è accertato per mezzo di esperimenti nei quali si era- po umano. Per capire il meccanismo d'infezione della BSE e i no inoculate quantità diverse di PrPse in gruppi di animali spe- suoi effetti è perciò essenziale chiarire esattamente la cinetica rimentali, osservando poi quanti animali di ogni gruppo si am- dei processi molecolari che consentono agli agenti infettanti di malavano e dopo quanto tempo. moltiplicarsi. Soltanto allora si potranno prendere misure effica- Una delle dimostrazioni più convincenti dell'esattezza delle ci per arginare il contagio. ipotesi di Prusiner sull'origine delle malattie da prioni è stata Già nel 1996 avevo preso in esame varie ipotesi sulla moltipli- fornita da Charles Weissmann e dalla sua scuola all'Università cazione dell'agente patogeno della BSE e di altri prioni per valu- di Zurigo. Weissmann ha dimostrato, fra l'altro, che in topi in tare come si conciliassero col decorso della malattia e con le co- cui sia stato rimosso il gene per la PrP, impedendo così la pro- noscenze sulla diffusione del contagio. I risultati di ricerche re- duzione della corrispondente proteina, anche l'introduzione del- centi confermano le conclusioni di quel mio lavoro e del model- le particelle infettive PrPsc non trasmette la malattia. lo molecolare che proponevo. Quel modello ha tra l'altro con- Il fatto che i prioni, in accordo con l'ipotesi di Prusiner, non sentito di sviluppare un nuovo test per accertare la presenza dei posseggano acidi nucleici contenenti le informazioni sul patri- prioni della BSE già in concentrazioni da 10 a 100 volte minori monio ereditario è stato invece dimostrato da Detlev Riesner, di quelle che possono essere scoperte con i metodi standard at- dell'Università di Dfisseldorf. Attraverso misurazioni fisico-chi- tuali. Grazie a esso si potrà quindi diagnosticare la malattia della miche estremamente sensibili, Riesner ha escluso la presenza di mucca pazza in uno stadio molto più precoce. Occorrerebbero quantità significative di RNA o di DNA nell'agente patogeno di però test molto più sensibili per poter accertare se un taglio di malattie come la BSE. Conoscendo il procedimento utilizzato da carne bovina sia veramente sicuro, ossia se contenga meno prio- Riesner possiamo escludere che le unità infettive di PrP sc con- ni pericolosi di quanti siano necessari per trasmettere la BSE. tengano più di una molecola formata da 100 nucleotidi: troppo pochi perché in essa possa venire codificata la proteina prionica. Questo è un risultato importante, poiché la BSE e altre malat- Che cos'è un prione? tie da prioni sono «infettive» nel senso che il loro agente si mol- Stanley Prusiner, dell'Università della California a San Fran- tiplica in modo esponenziale. Tutte le malattie contagiose di cisco, ha il merito - che gli è valso il premio Nobel per la chimi- 2 questo genere sono state finora ricondotte ad agenti patogeni ca nel 1997 - di avere riconosciuto in una proteina l'agente in- «riproducibili», alla cui base c'è la duplicazione dell'RNA o del fettivo della BSE e di malattie affini (si veda il suo articolo Le DNA. Ciò non vale chiaramente nel caso dei prioni. Tuttavia la LA PROTEINA PRIONICA NORMALE PrPc I TEST DIAGNOSTICI PER LA Resistenza della PrP alla proteasi K dei bovini ha una struttura spaziale BSE (fotografia in alto) si ben definita fra gli amminoacidi nu- basano sulla proprietà mero 121 e 230, mentre il resto della dell'enzima proteasi K di molecola (amminoacidi numero 23- demolire completamente il PrP PrP sc 121) presenta una catena libera- prione normale Prfk, ma non mente fluttuante. Lambito «ordina- la forma patologica PrPsc to» contiene tre alfa-eliche (in verde) (dalla posizione 90 fino alla 33 209 amminoacidi e una struttura a foglietti beta ripie- 230). La figura qui a fianco gati (in blu). La conversione della mostra come con la tecnica 142 amminoacidi proteina prionica normale PrP' in Western Blot si possono 2? quella patologica PrPsc comporta una distinguere le proteine diversa conformazione spaziale della normali (a sinistra) da 18 parte della molecola costituita dai fo- quelle patologiche (a glietti beta. Nella fotografia in que- destra) prima e dopo sta pagina in alto un tecnico mostra l'aggiunta di proteasi K. campioni di cervello bovino inviati Come si può notare, nella per controlli sulla BSE al Laboratorio striscia del campione Senza Con Senza Con veterinario statale di Oldenburg, nel- patologico rimane una enzima enzima enzima enzima la Germania nordorientale. grande unità proteica. 4-2 LE SCIENZE 393 / maggio 2001 www.lescienzeit 4-3 nismo per la trasformazione della PrPc in PrPsc. Egli ha suppo- Cinetica o IN PILLOLE O PrI3` o Numero sto che una singola molecola di PrPsc si leghi con una di PrPc, O PrP" delle terminazioni • L'agente infettivo della BSE ha un inducendola ad assumere la forma patologica. Questo meccani- della moltiplicazione smo corrisponderebbe all'autocatalisi diretta di una trasforma- • Terminazione o tempo d'incubazione molto lungo. La o O zione strutturale: l'agente patogeno agisce «autonomamente» malattia si manifesta solo anni dopo il favorendo la conversione della forma innocua nella forma ma- O 2 contagio. I test attuali possono ligna e in tal modo riuscendo a replicarsi. o er esprimere matematicamente la moltiplicazione dei prioni o diagnosticare la malattia non più di sei Peter Lansbury, del Brigham and Women's Hospital di Bo- o • mesi prima della comparsa dei sintomi. ston, ha invece ipoti77ato un meccanismo di amplificazione del- pinfettivi, si devono considerare tutte le reazioni che una O le catene intorno a un «germe» di crescita. Secondo Lansbury, la catena di molecole PrP" di lunghezza i piegate in modo sbagliato Un bovino contagiato è però C1111111•9 CIMO moltiplicazione della proteina patologica PrPsc assomiglierebbe può compiere, e stimare le relative velocità. Fra le reazioni possibili o o O O 4 probabilmente infettivo anche prima. a un processo di polimerizzazione paragonabile alla produzione c'è la degradazione (scomposizione] a opera delle difese O O Inoltre i test attuali si possono di sostanze sintetiche lineari come il polietilene: una catena di immunitarie, o un'altra forma di disattivazione (11n. Inoltre la O 1\ 77 E-1=1LE o eseguire solo su animali macellati. unità di PrPsc disposte in fila l'una dopo l'altra cresce accumu- catena può spezzarsi in un punto a piacere (B). Rimangono • Un nuovo test, la spettrometria a lando, legando e trasformando singole molecole nella forma pa- o O 011C11#0 --so collimo CE NO o fluorescenza con correlazioni tologica. Presuppone la formazione di un germe per la crescita infettivi solo frammenti che abbiano una certa lunghezza minima o 0 o o o o ‘, o 0 8 incrociate, è 10-100 volte più sensibile della catena significa che essa debba raggiungere una grandez- n. Infine la catena può allungarsi (E) legando a sé una molecola di 0 e • •12111111• . dei test standard e può essere usato za critica prima di poter aggiungere nuove unità più rapidamen- proteina prionica normale PrP, e trasformandola nella forma o „-----o i ..,...----• \iO o------„, o \ o------- o te di quanto perda le vecchie per separazione. Con questo mo- patologica. In condizioni normali le molecole di PrP, vengono anche su bovini vivi. Esso 0E1,1: 1o1 110 CE,:I IeII ED 0.111,: 1o11 10 111•1;1 1e1 110 c111o1 0 CE _ :__ Eo D CIE7.1o1 13 011LIZoO 16 consentirebbe quindi di scoprire la dile flalott oL cahnesb lua rPyr hPas cc enrecla ctoe rdvie sllpoi edgeagrlei asonpimraatltiu tmtoa ldautie sfiean pormeseenni-: costantemente fornite (X) e decomposte (6). i4o; o; o: o: o o o o malattia con qualche mese di anticipo. te abitualmente nella forma di bacillo e il fatto che l'«unità infet- •Terminaz one i i i 4 4 4 • Lo studio del meccanismo di tiva» comprenda un gran numero di molecole PrP. O PrPc moltiplicazione dei prioni evidenzia la o prpsc possibilità di riconoscere un'infezione Come «reagisce» un prione? LA MOLTIPLICAZIONE DEI PRIONI INFETTIVI awiene in due fasi. Nella prima le catene di PrP" legano di BSE sin dall'inizio. Il principio alle loro estremità molecole di PrI3 proprie dell'organismo e le trasformano nella forma patologica. L'intento della mia ricerca del 1996 era quello di valutare i Nella seconda le catene in crescita si spezzano (cosicché la loro lunghezza rimane costante nel consiste nel far moltiplicare in provetta due meccanismi sulla base della loro cinetica chimica. Risultò tempo). Mentre la crescita in lunghezza di una catena non aumenta il numero delle unità proteiche le particelle infettive, prima della loro che, se si ipotizzano per le costanti di velocità e di equilibrio va- prioniche infettive, la rottura delle catene causa la loro crescita esponenziale. L'evento è rappre- naturale comparsa. lori analoghi a quelli noti per le interazioni fra proteine, il mec- sentato in questo schema in modo molto più regolare di quanto avvenga in realtà. canismo ipotizzato da Prusiner con due sole unità prioniche che interagiscono non può plausibilmente funzionare. Questa ipote- loro scoperta non ha affatto tolto valore si applicata alla malattia di Creutzfeldt-Jakob, che compare alle conoscenze della virologia e della spontaneamente nell'uomo, avrebbe la conseguenza che con un batteriologia, bensì ha semplicemente ri- dato valore di parametri la concentrazione di proteina prionica Per tutte queste trasformazioni valgono costanti di velocità velato che esistono anche sistemi speciali, patologica dovrebbe continuare o a diminuire o ad aumentare. specifiche. Lo schema di reazione fornisce allora per le velocità fondati esclusivamente su proteine, che Varrebbe in questo caso il principio del «tutto o nulla»: l'infezio- simulano il comportamento di replicazio- dei processi parziali i termini seguenti. Qui x sta per la ne dovrebbe o estinguersi costantemente da sola prima di insor- ne tipico degli acidi nucleici. concentrazione in PrPc normale, y per il numero complessivo gere, oppure originarsi spontaneamente con una probabilità Un altro progresso è stato fatto segnare delle catene e z per il numero complessivo delle molecole di Pr13, molto maggiore di quanto non avvenga. da Kurt Wiithrich, del Politecnico Federa- Il problema si risolve ipotizzando un'interazione cooperativa presenti. le di Zurigo. Il suo gruppo ha determinato fra più di due unità proteiche. Parecchi enzimi «allosterici», che con la risonanza magnetica nucleare la vengono trasformati in una forma attiva solo attraverso l'asso- Velocità Metabolismo Degradazione Rottura Allungamento Separazione struttura dei prioni normali. Questi con- di reazione di catena terminale ciazione con una molecola effettrice, ne dirigono in questo mo- (i = dx/dt) X/5 D e EKI n53 terrebbero un dominio «globulare», in cui do l'attività. Attraverso la cooperatività, e in presenza di para- X ' +À. -3X. -Cra + n(n-1)By la catena di amminoacidi forma tre strut- LA MARCATURA DI ANTICORPI con coloranti fluorescenti verdi ture avvolte a elica. Questo dominio, così Molecola di PrPc e rossi, che possono legarsi specificamente in un sito della metri cinetici appropriati, la trasformazione strutturale autoca- 9 ' -Dy +Bz -(2n-1)By talitica consente di raggiungere un valore di soglia per l'insor- i = - Dz +Ekiu -In-118u come il resto della molecola, può essere molecola prionica, è la base del metodo SIFT (Scanning for genza della malattia. «digerito» grazie a un enzima che scom- Molecola di PrPsc Intensely Fluorescent Targets], un nuovo test, più sensibile, In effetti il meccanismo di Lansbury contiene, attraverso la Questi termini si possono legare in equazioni differenziali in pone le proteine, cosa che non è possibile per rivelare la presenza di prioni patologici. Se questi formazione del germe, una sorta di interazione cooperativa che, cui compaiono per la variazione temporale di y e z. In per un segmento analogo di PrPsc. La ra- Anticorpo anticorpi marcati incontrano una particella di una lunga gione di questa differenza risiede nel fatto con colorante catena di PrP", le si attaccano in molti punti. La particella si in questo caso, agisce fra i componenti della catena di PrPsc. Un corrispondenza dello stato di equilibrio la concentrazione in che la forma patologica contiene, invece fluorescente verde rivela anche attraverso il fatto che, qualora venga eccitata solo componente non è quindi in grado di legare e trasformare molecole di PrP, può essere considerata approssimativamente della porzione avvolta a elica, dei fogliet- Anticorpo intensamente con la luce laser corrispondente, appare una molecola di PrPc. Perché la trasformazione avvenga in mo- costante (x0). Le soluzioni delle equazioni differenziali sono do efficace devono interagire almeno altrettanti componenti ti beta, nei quali la catena di amminoaci- con colorante intensamente colorata sia in rosso, sia in verde. nella seguente forma generale: fluorescente rosso quanti ne contiene il germe. Solo allora la velocità di costruzio- di ha un andamento paragonabile a una ne della catena risulterà superiore a quella della sua distruzione. lamiera ondulata. In questo caso gli enzi- Ma rimane ancora una difficoltà. La catena, dopo avere rag- y tt = Aie-kit-i- A2e'-k2, z(t)=B,e-kit+ B2ek2t mi possono scindere solo l'estremità aperta della catena. L'AUTORE giunto la grandezza del germe, continua sì a crescere in modo Questo diverso comportamento della PrPc e della PrPsc è alla autocatalitico, ma senza quell'accelerazione esponenziale che è In esse compare sempre un termine di crescita e un termine base del test oggi utilizzato per l'accertamento della BSE. Kurt MANFRED EIGEN è direttore emerito della sezione di cinetica Wilithrich ha studiato le differenze a livello della struttura glo- biochimica al Max-Planck-lnstitut fúr Biophysikalische Chemie tipica delle reazioni autocatalitiche. Un'accelerazione esponen- di diminuzione. Ques'ultimo porta all'instaurarsi di uno stato di ziale presuppone che, dopo la trasformazione, sia il catalizzato- bulare dei prioni di diverse specie animali traendo interessanti di Gottingen, la città dove si è laureato nel 1951. Nel 196? è equilibrio temporaneo con distribuzione costante della re originario sia il prodotto della sua reazione rimangano dispo- conclusioni su una possibile trasmissibilità della malattia. Ne è stato insignito del premio Nobel per la chimica per i suoi studi lunghezza delle catene. Dopo un certo tempo domina invece il nibili per ulteriori cicli autocatalitici, cosicché il numero delle risultato, per esempio, che le proteine prioniche bovine e umane sulle reazioni chimiche veloci. In seguito si è occupato di evolu- termine di crescita. L'analisi di queste equazioni mostra perché i specie cataliticamente attive raddoppia a ogni ciclo di reazioni. hanno strutture molto simili, il che suggerisce che il contagio zione molecolare. Insieme con Rudolf Rigler ha sviluppato un In una progressiva polimerizzazione, però, ciò non avviene: ogni prioni infettivi si moltiplichino solo con estrema lentezza. abbia una discreta probabilità di passare da una specie all'altra. metodo spettrografico per evidenziare singole molecole. volta resta cataliticamente attiva solo la terminazione proteica Stanley Prusiner è stato anche il primo a proporre un mecca- 4. www.lescienzeit .4-5 4. LE SCIENZE 393 / maggio 2001 Anche per questa difficoltà c'è però una soluzione. 11 mecca- catene con un valore medio definito viene mantenuta staziona- nismo di polimerizzazione fornisce, in certi casi, una crescita al- Un metodo sicuro er verificare l'accuratezza del metodo SIFT nella diagnosi di una ria. Dopo un certo tempo esso non fornisce più un contributo trettanto esponenziale: ciò avviene quando le catene che si al- pmalattia da prioni nell'uomo, si è sostituito il liquido cerebrospi- degno di nota, cosicché rimane attiva solo la porzione terminale. lungano si spezzano di continuo, liberando così nuovi catalizza- nale di pazienti affetti da un disturbo neurologico, ma non da una Poi sia il numero delle catene polimeriche sia quello delle unità tori. Martin Nowak - un collega dei tempi in cui si studiavano i malattia da prioni, con una soluzione contenente una determinata patologiche in esse contenute aumenta in modo esponenziale, processi di evoluzione molecolare a Góttingen e a Vienna e che fino a superare la quota di prioni normali. quantità di aggregati prionici infettivi. La misurazione con il meto- oggi lavora all'Institute for Advanced Study di Princeton - ha ri- do SIFT che utilizza anticorpi marcati con colori fluorescenti rosso o preso, perfezionandolo, il modello della rottura della catena. Ne- Perché un'incubazione così lunga? verde, ha fornito il risultato qui riprodotto. Nella scala a destra è in- gli ultimi anni, grazie alla traduzione di questo modello in una forma risolvibile matematicamente, Joanna Masel, dell'Univer- dicato il numero dei lampi registrati nel corso della misurazione in Joanna Masel ha sviluppato in modo dettagliato questo mo- sità di Oxford, ha potuto chiarire molti particolari del decorso funzione della loro intensità. I più frequenti sono i segnali fluore- dello, valutandone esaurientemente tutte le conseguenze e con- delle malattie da prioni che finora non erano stati compresi. scenti deboli (a sinistra in basso). Essi si producono quando un anti- frontandole con i dati sperimentali. I risultati ottenuti da questa 10 corpo marcato con una sostanza fluorescente cade esattamente ricercatrice sono molto importanti ai fini di anticipare la dia- 20 50 gnosi delle malattie da prioni. Il confronto con i dati sperimen- Come si moltiplica l'agente della BSE 100 nel fuoco del laser. Se nel volume di campione da misurare viene a 200 tali chiarisce che l'associazione di una molecola di PrP c a una 500 trovarsi un agglomerato di proteina prionica patologica (PrP,,I, sul Nel suo modello Nowak ha inserito equazioni che esprimono 1000 catena di PrPsc e la sua trasformazione in una proteina patolo- 2000 lo stato di equilibrio per la crescita, la rottura e la dissoluzione di 105 000000 quale sono confluiti anticorpi marcati con sostanze che emettono gica richiede circa un quarto d'ora. La catena stabile di PrPse ha catene proteiche di qualsiasi lunghezza. La crescita viene resa 2500 000000 fluorescenza nei colori rosso e verde, si produce un lampo intenso, una lunghezza media di circa 1000 unità. Essa richiede quindi essenzialmente con un'espressione per l'allungamento delle ca- J formato da un ugual numero di parti verdi e rosse. Questi eventi si per la sua formazione un tempo 1000 volte più lungo. Gli espe- tene. In che modo l'allungamento e la rottura della catena coo- manifestano come punti gialli nello spazio a destra in alto, delimita- rimenti indicano un periodo compreso fra 5 e 20 giorni. Perché perino facendo in modo che il numero di terminali catalitica- to dalle due linee blu. I punti all'interno delle ellissi rossa o verde de- possa instaurarsi un equilibrio temporaneo, con una lunghezza mente attivi aumenti in modo esponenziale è mostrato schema- di catena stabile, in questo intervallo di tempo deve avvenire in rivano da altri aggregati proteici, che si legano casualmente a uno ticamente nell'illustrazione a pagina 44 in alto. La dissoluzione, media un evento di rottura di catena. Il tempo di dimezzamento dei due marcatori fluorescenti. a cui sono soggetti tutti i polimeri, fa sì che i germi infettivi ab- Intensità dei lampi di fluorescenza verdi per la rottura in un punto prestabilito si aggira intorno a 30 an- biano solo una durata di vita limitata. ni. Dal momento che ogni catena contiene in media un migliaio La velocità di allungamento è il risulta- di punti di rottura possibili, nell'insieme si ha una rottura di ca- to di tre fattori che descrivono processi in tena ogni 10 giorni circa. Costruzione e rottura di catene si parte in competizione fra loro: mantengono così in equilibrio, ma il numero di catene cresce in • il legame di un'unità proteica PrPe a Volume modo esponenziale. del campione una estremità (o a tutt'e due) della catena Una grandezza importante è anche il rapporto fra velocità di di PrPsc; la sua velocità di allungamento costruzione e velocità di eliminazione delle catene di PrP sc. Se- Capillare è limitata dalla probabilità che le due di vetro condo misurazioni eseguite su animali di laboratorio, le due ve- unità si incontrino per diffusione; sigillato locità avrebbero pressappoco lo stesso ordine di grandezza. Ciò • la separazione dell'unità PrPc che non significa che il materiale infettivo, per poter restare tale, deve ri- si è ancora trasformata strutturalmente; Obiettivo prodursi costantemente. La causa dell'eliminazione non è del • la trasformazione strutturale della PrPc tutto nota; forse vi svolgono un ruolo le difese immunitarie, ma in PrPse, che provvede all'integrazione potrebbero esistere anche altri processi in grado di disattivare le Specchio stabile nella catena e quindi stabilisce il catene di PrPse. Perciò si è scelto di indicare la velocità di elimi- dicroico tasso di allungamento. nazione con un termine negativo non specifico, proporzionale Le velocità di questi tre processi posso- alla quantità del materiale infettivo presente. Questo fatto però no essere descritte da un'unica espressio- Raggi laser paralleli Singola non rende meno attendibili le stime dei tempi di reazione. 488 nm + 633 nm molecola ne matematica. Invece di costruire equa- Un punto importante è il fatto che solo il substrato della rea- diffondente zioni di equilibrio separate per ogni sin- zione, la PrPc in trasformazione, può muoversi liberamente in Lente gola catena di PrPsc, per descrivere la si- soluzione e venire in contatto con una catena di PrP se in accre- tuazione Nowak pensò di ricorrere a due scimento. Quanto alle catene di PrPse, esse sono invece preva- termini da me introdotti nel 1996: l'uno lentemente legate a membrane. Ciò spiega perché l'unità infetti- Specchio contiene tutte le unità di PrP comprese Lente dicroico Rivelatore va comprenda circa 100 000 singole molecole prioniche, benché nelle catene di polimeri di diversa lun- del rosso le catene si rompano già quando ne contengono un migliaio. I ghezza; l'altro è una misura del numero frammenti rimangono vicini e cooperano fra loro; solo quando di queste catene, e quindi di tutte le posi- Specchio si staccano dalla membrana raggiungono altri distretti corporei. zioni terminali cataliticamente attive. Filtro Il risultato delle ricerche della Masel è che il materiale richiede Diaframma Rivelatore Questo approccio consente di semplifi- del verde settimane per raddoppiarsi; per raggiungere una concentrazione care molte espressioni delle singole equa- tale da essere individuabile nelle analisi occorre circa un anno. ! MAL zioni. Alla fine rimangono solo due equa- Specchio Queste ricerche rispondono a molti interrogativi, ma certa- zioni differenziali lineari - risolvibili ana- Filtro mente non a tutti: non spiegano per esempio la fase iniziale e fi- liticamente - che descrivono il variare dei Analisi di correlazione nale dell'infezione, le vie di contagio, il tempo impiegato dall'in- incrociata due termini nel corso del tempo. Le solu- fezione per colpire il cervello e il midollo spinale, come pure il ti- Analisi di intensità zioni consistono nella somma di due fun- po di distruzioni che si verificano nella fase finale. zioni esponenziali, nelle quali il tempo compare come esponente una volta col Verso un test più sensibile della BSE segno positivo e una col segno negativo. IL NUOVO METODO DIAGNOSTICO SIFT utilizza un laser ad argo e uno a elio-neon i cui raggi vengono Una funzione rappresenta un termine concentrati su un punto della soluzione da misurare. Ogni volta che una particella marcata con un La conoscenza della cinetica dell'infezione è decisiva per sta- di crescita, e l'altra un termine di diminu- colorante fluorescente verde o rosso cade nel fuoco dei raggi laser, emette luce del colore corri- bilire quanto precocemente si possa diagnosticare la malattia. zione. Quest'ultimo descrive la fine di un spondente. Le particelle sono raccolte e separate a seconda del colore emesso. La simultanea Una diagnosi il più possibile tempestiva rappresenta a sua volta equilibrio temporaneo in cui una determi- comparsa della fluorescenza rossa e verde indica un prione. La foto a destra mostra un tecnico che un'importante premessa per impedire il contagio. nata distribuzione delle lunghezze delle seziona la testa di un bovino per ricavare un campione di cervello su cui eseguire i test per la BSE. A causa dell'estrema lentezza della moltiplicazione dei prioni LE SCIENZE 393 / maggio 2001 wwvviescienzeit 4-7 patologici, un tipo di test più sensibile permetterà di riconoscere C'è vera sicurezza per il consumatore? Vecchio metodo la malattia con mesi o addirittura anni di anticipo. Nel 1994 ho studiato insieme con i miei collaboratori un metodo che, in teo- Quanto all'individuazione di agenti patogeni della BSE nei bo- ria, è adatto all'identificazione di quantità minime di prioni. Es- vini, le esigenze sono estremamente elevate. Non basta accertare so si riallaccia a un'ipotesi concepita da Rudolf Rigler fra il 1968 che la concentrazione dei prioni patologici sia inferiore al limite e il 1971, durante un suo soggiorno al Max-Planck-Institut ffir di sensibilità di un procedimento. Il problema è accertare che la Biophysikalische Chemie a Gatingen, e successivamente svilup- carne sia priva di materiale infettivo. I metodi noti possono già pata al Karolinska Institut di Stoccolma. misurare concentrazioni da picomolari a nanomolari, dimostran- Si tratta del metodo FCS (Fluorescence Correlation Spectro- do una sensibilità elevatissima per un'analisi chimica. A tali va- scopy). Esso per così dire capovolge il principio della spettrosco- lori corrispondono, per ogni chilogrammo di sostanza, da 10,2 a pia a fluorescenza classica. In questa le molecole di cui si deve Limite di rilevabilità 10'5 unità molecolari, quantità molto superiori alle 100 000 unità accertare la presenza vengono marcate con un colorante che, di PrPsc contenute in un germe infettivo. Non è quindi di molto Concentrazione degli aggregati prionici 1111111.1,131-7TI n ( lì quando viene illuminato, emette una luce fluorescente di una aiuto il fatto che i nuovi procedimenti siano da uno a due ordini 13 pazienti di controllo 24 pazienti affetti lunghezza d'onda caratteristica. Dopo aver illuminato l'intero dalla malattia di Creutzfeldt-Jacob di grandezza più sensibili dei metodi già in uso. Possiamo sì «ve- campione, si misura l'intensità della luce fluorescente che indica dere» le singole molecole, ma dobbiamo prima «rintracciarle» al- la concentrazione delle molecole marcate quando essa è supe- Nuovo metodo SIFT l'interno della mole di particelle che fanno parte dell'organismo. riore a 10,5 particelle per litro, ossia quando il segnale fluore- I PRIONI CONTENUTI NEL LIQUIDO CEREBROSPINALE di pazienti affetti dalla La soluzione del problema potrebbe consistere nell'aumentare scente, misurato con continuità, si distingue chiaramente dal ru- malattia di Creutzfeldt-Jakob sono stati per la prima volta individuati artificialmente il numero di germi infettivi presenti fino a quan- more di fondo causato da fotoni dispersi e riflessi. CE) con il metodo SIFT. Il test ha funzionato solo in un quarto dei casi, do la loro concentrazione non superi la soglia della rilevabilità. Col nuovo metodo bastano concentrazioni molto minori. Il C:) ma nei pazienti di controllo non è stato riscontrato alcun falso positivo. Nel caso di virus e batteri, la cui infettività risiede nei geni, e L.13 trucco consiste nell'illuminare solo una parte del campione. Il fa- quindi nelle molecole degli acidi ribonu- scio laser viene concentrato su un elemento spaziale il più possi- cleico (RNA) o desossiribonucleico (DNA), bile piccolo (il limite è dato dalla lunghezza d'onda della luce). non c'è alcun problema del genere. Con Nel nostro caso il volume del fuoco del laser ammonta a meno di l'aiuto della reazione a catena della poli- un femtolitro (10-15 litri). Questo procedimento presenta il van- merasi (PCR), o di procedimenti analoghi, taggio che da un elemento spaziale così piccolo irraggia poca lu- si possono moltiplicare esponenzialmente ce diffusa e quindi il rumore di fondo non crea praticamente di- in breve tempo singole molecole fino a ot- sturbi. Un apparente svantaggio è che in un volume così piccolo 4278 138 72 29 12 tenerne quantitativi utilizzabili con i pro- è di solito rarissimo incontrare anche una sola molecola fluore- cedimenti di analisi abituali. Concentrazione degli aggregati prionici scente, con la conseguenza che nel tempo medio si avrà un se- E qui entra in gioco la cinetica della gnale minimo di fluorescenza, indistinguibile dal rumore. moltiplicazione. Nel caso dell'RNA e del Questo è però solo uno svantaggio apparente. Infatti non re- IL CONFRONTO TRA I TEST TRADIZIONALI e il metodo SIFT è stato eseguito DNA bastano pochi secondi, o minuti, per gistriamo più il segnale stazionario medio, ma aspettiamo che su una serie di diluizioni di materiale tratto da midollo spinale raddoppiare il numero di sequenze carat- una delle molecole fluorescenti entri nel fuoco del laser. Benché contenente aggregati di prioni. Come si vede, il nuovo metodo permette teristiche. Così in un campione contenente vi si trattenga solo per qualche millisecondo o anche meno, di rilevare concentrazioni molto più basse. un'unica sequenza di DNA è possibile ot- emette in questo tempo brevissimo una «salva» di alcune mi- tenere in mezz'ora 23° copie (circa un mi- gliaia di quanti di luce fluorescente. Questi vengono rivelati con fuoco del laser, emergono contemporaneamente un intenso se- liardo). Ma anche se esistesse un metodo un metodo noto come autocorrelazione. Si tratta semplicemente gnale rosso e uno verde. La loro coincidenza è un chiaro segno analogo per i prioni, una tale moltiplica- di moltiplicare le intensità registrate in due intervalli di tempo della presenza del prione, in quanto un'altra molecola proteica zione richiederebbe tempi dell'ordine di immediatamente successivi. Il prodotto è diverso da zero solo potrebbe forse contenere per caso uno dei due anticorpi e quin- un anno, salvo che non si trovi - cosa che quando le due intensità sono diverse da zero. Ciò vale per una di emettere o un segnale rosso o uno verde, ma sarebbe molto ritengo possibile - un modo per accelerare «salva» di fotoni, ma non, in generale, per il rumore di fondo improbabile l'emissione simultanea dei due segnali. notevolmente queste reazioni in vitro. Si formato dai singoli segnali di disturbo. In tal modo, nella regi- Nella sua tesi di dottorato, Jan Bieschke, in cooperazione con potrebbe sfruttare per esempio il fatto che strazione, la somma dei prodotti dell'intensità si distingue chia- Armin Giese, del gruppo di lavoro di Hans Kretzschmar alla Cli- gli aggregati sono idrofobi e quindi si ac- ramente dal rumore per l'intera durata del tempo in cui la mole- nica universitaria di attingen, ha sviluppato un efficace meto- cumulano di preferenza sulle membrane cola rimane nel fuoco del laser. do di diagnostica molecolare, che abbiamo chiamato SIFT lipidiche. E torniamo a un'affermazione L'apparecchiatura consiste essenzialmente in un microscopio (Scanning for Intensely Fluorescent Targets), basato su questa fatta all'inizio: la soluzione del problema a fluorescenza confocale molto sensibile, con analisi compute- correlazione incrociata. Esso consente di esaminare il liquido ce- della BSE - sempre che ce ne sia una - sta rizzata dei segnali autocorrelati. Essa permette non solo di ren- rebrospinale di pazienti affetti dalla malattia di Creutzfeldt-Ja- UN AMMASSO DI CARCASSE DI BOVINI fotografato a Oberling, presso Monaco di Baviera, poco prima in un impiego appropriato delle conoscen- dere visibili singole molecole, ma anche di rivelare concentra- kob. La sensibilità del procedimento supera di 10-100 volte della distruzione, nel marzo 1997. Facevano parte di un allevamento di 160 capi, tutti abbattuti ze sul meccanismo e sulla cinetica di mol- zioni minime corrispondenti a un miliardo circa di particelle per quella dei metodi classici per la diagnosi della BSE. Esso funzio- dopo che un esemplare era risultato positivo al test per la BSE. tiplicazione dei prioni. Dobbiamo fare in litro e, con qualche trucco, concentrazioni ancora minori. na fino a una diluizione intorno a I su 250 000, un valore che modo di moltiplicare rapidamente in pro- Il metodo di autocorrelazione utilizza un marcatore fluore- equivale a un miliardo-mille miliardi di particelle per litro. Mi- BIBLIOGRAFIA vetta piccole tracce dell'agente patogeno. Solo così potremo sco- scente legato a una sostanza che si lega con grande affinità alla surazioni di questo tipo hanno dato buoni risultati sia in pazien- prire l'infezione quando è ancora allo stadio iniziale. molecola da rivelare, dotandola, per così dire, di un'etichetta lu- ti affetti dalla malattia di Creutzfeldt-Jakob sia in pazienti affet- EIGEN MANFRED, Prionics, in «Biophysical Chemistry», 63, pp. Anche il problema di che cosa sia un prione appare ora in una minosa. Ora, la PrPsc è un aggregato proteico abbastanza gran- ti dal morbo di Alzheimer; questi ultimi soffrono di una grave A1-A18, 1996. nuova luce. L'agente infettivo non è né una singola molecola de, che può ospitare varie etichette. Sono adatti a svolgere que- forma di demenza senile caratterizzata dalla presenza nel cer- MASELJ., JANSEN V. A. A. e NOWAK M. A., Quantifying the Kinetic proteica né un polimero. Si tratta piuttosto di un insieme di ag- sta funzione soprattutto anticorpi monoclonali, che si indirizza- vello di aggregati proteici costituiti non da prioni, ma da depo- Parameters of Prion Replication, in «Biophysical Chemistry», 77, gregati proteici essenzialmente unidimensionali caratterizzati da no specificamente contro epitopi (punti di legame formati da siti non infettivi di sostanza beta-amiloide. p. 139, 1999. catene di lunghezza media ben definita. Ma l'infettività non di- pochi amminoacidi) della molecola di PrPse. Il vantaggio del procedimento SIFT consiste innanzitutto EIGEN MANFRED, Molekulare Diagnostik, in Das Gen und der pende solo dalla lunghezza delle catene. Gli aggregati sono pre- Ciò permette di far ricorso a un altro trucco che accresce ulte- nell'avere permesso per la prima volta di eseguire misurazioni Mensch, a cura di G. Gottschalk, Wallstein Verlag, GOttingen 2000. sumibilmente legati alle membrane e quindi compaiono in forma riormente la sensibilità dell'indagine. Invece di un singolo anti- su liquidi organici accessibili, come per esempio il liquido ce- BIESCHKEJ. e altri, Ultra-sensitive Detection of Pathological Prion di associazioni che sono la più piccola sorgente di infezione. corpo monoclonale se ne usano due, che vengono indirizzati rebrospinale. In questo modo sarebbe teoricamente possibile Protein Aggregates by Dual-color Scanning for Intensely Fluore- Poiché solo le terminazioni delle catene sono infettive, una ca- verso distinti epitopi della molecola di PrP e che sono marcati eseguire test della BSE su bovini vivi, anche se il prelievo del scent Targets [SIFT], in «Proceedings of the National Academy of tena di 100 000 unità di PrPsc è contagiosa 1000 volte di meno con due coloranti fluorescenti diversi: per esempio, l'uno rosso e liquor resta un procedimento complicato, che può richiedere Sciences (USA]», 9?, p. 5468, 2000. della stessa quantità di unità di PrPsc distribuite in 1000 pezzi di l'altro verde. Non appena il complesso di prioni cercato cade nel l'uso dell'anestesia. catena di lunghezza media. -48 LE SCIENZE 393 / maggio 2001 www.lescienzeit Le malattie da PRION nell'uomo La più nota e di Piero Parchi diffusa è la malattia di Creutzfeldt- Jakob. La recente comparsa di una nuova variante LO SCRAPIE DEGLI a rara malattia umana di Creutzfeldt-Jakob e la più diffusa encefalopatia spongiforme bovina (BSE) hanno in comu- OVINI, la più diffusa ne l'appartenenza al gruppo delle malattie da prioni o encefalopatie spongiformi trasmissibili. Il nome stesso ne de- delle encefalopatie della malattia, spongiformi animali, scrive alcune caratteristiche: sono encefalopatie, in quanto il tessuto più colpito è quello nervoso; sono trasmissibi- è noto fin dal XVIII li, cioè infettive, e portano a una progressiva degenerazione del tessuto nervoso, che assume un aspetto spugnoso secolo, ma solo nel per la presenza di numerosi vacuoli. Sconosciute ai più prima della recente epidemia di BSE, queste malattie erano collegata alla 1939 se ne riconobbe la natura di malattia già da decenni oggetto di interesse da parte di microbiologi, biologi molecolari e biochimici perché il prione, infettiva. In alto, come viene comunemente chiamato l'agente infettivo che ne è responsabile, ha caratteristiche così pecu- BSE, preoccupa danze rituali liari da mettere in crisi uno dei dogmi centrali della biologia: l'unicità degli acidi nucleici come depositari e trasportatori del- di una tribù di Papua, l'isola in cui l'informazione biologica. Come spiega anche Manfred Eigen, la patogenesi di queste malattie è legata a una glicoproteina scienziati fu individuata, normalmente prodotta dall'ospite: la proteina prionica cellulare (PrPC). Nella malattia, la PrPC si coverte in una forma ab- negli anni cinquanta, un'encefalopatia norme, parzialmente insolubile e resistente alla digestione con proteasi, la PrPSc o PrP-res, che è il marcatore diagnostico e opinione umana - il kuru - di queste malattie. La conversione si associa a un cambiamento di conformazione della proteina, cui consegue l'insolubi- in una popolazione lità in soluzione acquosa fisiologica e la formazione di depositi proteici nel sistema nervoso. Ciò accomuna la proteina prio- dedita a pratiche pubblica ° cannibalistiche. nica ad altre proteine che sono alla base di malattie neurodegenerative come il Parkinson e l'Alzheimer. 50 LE SCIENZE 393 / maggio 2001 www.lescienze.it 51 Le encefalopatie spongiformi hanno, nell'uo- BRESCIA, MACELLO mo, un'incidenza inferiore a due casi per milio- COMUNALE. Un ne. Tra esse la malattia di Creutzfeldt-Jakob impiegato marchia (Ci) è responsabile di più del 90 per cento dei con vernice blu le casi. Essa non ha alcuna relazione dimostrata carcasse dei bovini con le forme animali di encefalopatia spon- diretti all'inceneritore. giforme e va quindi distinta dalla nuova va- L'operazione viene riante descritta da Robert Will, James Ironside e eseguita per colleghi nel 1996, causata dallo stesso ceppo di assicurarsi che la prione responsabile della BSE. Le malattie da carne non sia usata prioni nell'uomo sono classificate secondo la né per il consumo presunta origine della patologia, e sono le uni- umano né che malattie neurologiche note che possono es- per la produzione sere sia ereditarie sia infettive (si veda la tabella di mangimi. in basso nella pagina a fronte). Si distin- LA DEGENERAZIONE SPONGIFORME (sopra, a sinistra) è la lesione guono forme sporadi- più tipica e costante della malattia di CJ, anche se non che o idiopatiche, for- è specifica di questa malattia. Essa si manifesta sotto forma di vacuoli me genetiche, spesso (gli spazi bianchi nella fotografia). Con la tecnica a carattere familiare, immunoistochimica è possibile evidenziare intorno ai vacuoli depositi e forme acquisite. Tra di proteina prionica patologica, ossia PrP-res (sopra, a destra). queste, oltre al kuru e In questo caso i depositi si trovavano nella corteccia cerebrale alla nuova variante di di un paziente deceduto per malattia di CJ sporadica, il quale dal punto Ci, rari casi di CJ di vista molecolare era stato classificato come omozigote conseguenti a inter- per la metionina al codone 129 e con PrP-res di tipo?. Qui a fianco, venti medico-chirur- depositi di proteina prionica patologica a forma di placche, rinvenuti gici (si veda la tabella nel cervelletto di un paziente eterozigote a pagina 55). per la metionina/valina al codone 129 e con PrP-res di tipo?. IN PILLOLE mente, il prodotto del gene è un normale costituente dell'ospite, Breve storia delle encefalopatie Le due proteine una proteina ubiquitaria nei tessuti dei vertebrati. Si giunge così spongiformi trasmissibili • Negli ultimi anni i progressi della biologia molecolare, pur a riconoscere che esistono due forme di proteina prionica, la for- della Creutzfeldt-Jakob ma normale, o PrPC, e la forma proteasi-resistente, PrPSc o PrP- non avendo ancora risolto la controversia sulla natura Lo scrapie degli ovini, la malattia da prioni animale più diffu- res, specifica della malattia. biologica dei prioni, hanno migliorato notevolmente le nostre sa e nota da più tempo, compare già in pubblicazioni del XVIII conoscenze sulle malattie e hanno fornito metodiche di secolo, ma solo nel 1939 viene trasmesso sperimentalmente. Le n tutte le malattie da prioni umane - a eccezione di La proteina prionica cellulare indagine diagnostica sempre più sensibili. encefalopatie spongiformi entrano così definitivamente nel capi- Ialcune varianti di malattia di Gerstmann-Stdussler- tolo delle malattie infettive. Negli anni cinquanta l'interesse si III Si è ormai chiarito che la variabilità clinica e patologica Nell'uomo, il gene della PrPC, localizzato sul braccio corto del Scheinker - il test Western blot eseguito dopo trattamento sposta in Nuova Guinea, dove Vincent Zigas, un giovane ufficia- delle malattie da prioni sporadiche nell'uomo è cromosoma 20, codifica per un peptide che, in forma matura, ha con proteasi K evidenzia nella proteina prionica patologica le medico australiano, e Carlton Gajdusek, pediatra e virologo assimilabile a quella di forme animali come lo scrapie, 210 amminoacidi, un'ancora di glicolipidi a livello del terminale (PrP-res) tre bande principali. Esse rappresentano tre americano, descrivono il kuru, una malattia che si era diffusa in che sappiamo dipendere sia dal ceppo di prione infettante, carbossilico e, non sempre, una o due catene laterali oligosacca- forma epidemica tra i membri della tribù Fore, a Papua, in segui- isoforme della proteina con differente grado di ridiche. Un'altra caratteristica della proteina, che sembra impor- sia da un fattore genetico dell'ospite, ossia dalla sequenza to a pratiche cannibalistiche. glicosilazione: la banda superiore ha entrambi i siti di tante ai fini della sua normale funzione, è la regione delle se- del gene PRNP. Nel 1959 William Hadlow, un patologo veterinario americano, glicosilazione occupati, quella intermedia uno dei due, quenze ripetute, un dominio funzionale conservato, costituito da rileva in una lettera a «The Lancet» somiglianze tra il kuru e lo mentre quella inferiore • I dati più recenti indicano che, nell'uomo, esistono almeno una sequenza di otto amminoacidi ripetuta cinque volte. La pro- scrapie, e suggerisce di studiare sperimentalmente la trasmissibi- quattro ceppi distinti di prione e che il genotipo nel codone teina matura si localizza soprattutto a livello della membrana non è glicosilata. Nei lità del kuru. Rientrato negli Stati Uniti, Gajdusek coglie il sugge- 129 del PRNP modula la maggiore o minore suscettibilità cellulare, dove si attacca tramite l'ancora glicolipidica, e dove, soggetti affetti da rimento e, con Joe Gibbs, riesce a trasmettere sia il kuru sia la verso questi ceppi. probabilmente, svolge la sua funzione fisiologica. Parte della malattia di Creutzfeldt- malattia di CJ (nota dal 1921) a primati non umani. Queste ricer- • Questi studi hanno posto le basi per studi epidemiologici proteina, però, dopo essere arrivata sulla superficie cellulare, tor- che fruttano a Gajdusek nel 1976 il Nobel per la medicina. Jakob, la PrP-res na ciclicamente dentro la cellula dove subisce un taglio. In segui- che, speriamo, risolveranno una volta per tutte, il quesito Gli anni sessanta vedono numerosi progressi anche nello stu- mostra due andamenti to, una parte della proteina troncata torna in superficie, mentre relativo all'origine e ai fattori di rischio della forma sporadica dio delle proprietà dell'agente causale dello scrapie. Si inizia a ca- distinti, che l'altra raggiunge gli endosomi e i lisosomi che la degradano. pire che esso è estremamente resistente ai trattamenti che inatti- differiscono per massa della malattia di Creutzfeldt-Jakob. La funzione fisiologica della PrPC è ignota. Finora le ricer- vano i virus e gli acidi nucleici, come la formalina, le nucleasi, le che hanno prodotto risultati frammentari e non conclusivi. Il molecolare relativa e radiazioni ionizzanti, mentre è inattivato da agenti che distrug- più importante è stato ottenuto dal gruppo di Charles Weis- che corrispondono a gono le proteine, come le proteasi, certi detergenti, gli acidi forti. smann, dell'Università di Zurigo, che ha dimostrato che i topi due peptidi di La classificazione delle encefalopatie umane Sulla base di questi dati, è un matematico, J. Griffith, che per transgenici che non esprimono la proteina prionica si svilup- primo nel 1967 elabora l'ipotesi che l'agente causale dello scrapie lunghezza diversa. La PrP-res di tipo 1 (a sinistra) ha una pano normalmente e non mostrano deficit comportamentali possa essere una proteina. Nel 1982, lavorando su preparazioni massa molecolare relativa di circa 21 chilodalton e include, IDIOPATICHE Malattia di Creutzfeldt-Jakob sporadica significativi. La proteina, quindi, o non è fondamentale per lo infettive di scrapie, Stanley Prusiner, dell'Università della Califor- per la maggior parte, il segmento 82-230 della proteina Insonnia fatale sporadica sviluppo e le funzioni del cervello o è, viceversa, così impor- nia, riesce a purificare una proteina parzialmente resistente alla prionica. La PrP-res di tipo 2 ha, invece, GENETICHE Malattia di Creutzfeldt-Jakob familiare tante che esistono altre proteine in grado di compensarne la Insonnia fatale familiare digestione con proteasi, e ipotizza che la proteina da lui isolata mancanza. Studiando l'elettrofisiologia dell'ippocampo in questi una massa molecolare relativa di circa 19 chilodalton Malattia di Gerstmann-Stràussler-Scheinker sia il costituente fondamentale, se non l'unico, dell'agente infet- animali, John Jefferys e John Collinge del St. Mary's Hospital di e contiene, prevalentemente, il frammento 9?-230 tivo, che denomina prione. Nel 1985, partendo da pezzi di se- ACQUISITE Malattia di Creutzfeldt-Jakob iatrogena Londra hanno però scoperto che essi presentano un deficit della quenza amminoacidica della proteina, si riesce a risalire alla se- della proteina prionica. Nuova variante della Creutzfeldt-Jakob trasmissione sinaptica mediata da recettori per il neurotrasmet- Kuru quenza del gene codificante, che viene donato. Sorprendente- titore GABA. Quest'ultimo risultato, tuttavia, rimane contro- 5 2 LE SCIENZE 393 / maggio 2001 www.lescienze.it 5 3 verso in quanto altri ricercatori non sono riusciti a riprodurlo. Genotipo e frequenza relativa della malattia L'AUTORE Nel 1996 Irene Tobler, dell'Università di Zurigo, ha fatto un'al- tra osservazione potenzialmente interessante. Studiando il sonno PIERO PARCHI, medico neurologo, è ri- e i ritmi circadiani in topi transgenici e in controlli normali, ha Codone 129 MM MV cercatore presso il Dipartimento di trovato una differenza nella durata del periodo di attività moto- scienze neurologiche dell'Università di ria giornaliera e nell'adattamento alla privazione di sonno. Un Popolazione caucasica 37% 51% 12', Bologna, dove ha avviato un laborato- normale (n=544) anno dopo David Brown, del gruppo di Hans Kretzschmar all'U- rio di diagnostica e ricerca sulle malat- niversità di Gottingen, ha dimostrato che la PrPC potrebbe avere Casi deceduti per CJ 1? tie da prioni. Ha lavorato per sei anni sporadica (n=300) un ruolo come trasportatore del rame all'interno della cellula, nel gruppo diretto da Pierluigi Gambet- mentre lo stesso Brown e altri hanno notato che la proteina è Ce aPsriP c-orens C tiJp os p1o (rnad=i2c1a4) 95% 4% 1% ti, presso la Division of Neuropatho- espressa in alte concentrazioni nelle sinapsi, e che le cellule che logy della Case Western Reserve Uni- ne sono prive sono più sensibili a vari tipi di stress. Casi con CJ sporadica e PrP-res tipo 2 (n=86) 14% 31% 55% versity, a Cleveland (USA), studiando la variabilità fenotipica nelle malattie La biologia dei prioni da prioni e soprattutto nella malattia iVarianti molecolari e andamento della malattia di Creutzfeldt-Jakob sporadica. Dal Quanto alla natura biologica dei prioni, sono tre le teorie in 1997 al 1999 è stato responsabile del- gioco. La prima - e la più seguita - ha fruttato a Stanley Prusiner la diagnostica molecolare per il Centro il premio Nobel per la medicina nel 1997, ed è la cosiddetta ipo- Gruppi CJ MM1 VV1 MM2 MM2 MV2 W2 di sorveglianza sulle malattie da prioni sporadica MV1 corticale talamico tesi della «sola proteina»: il prione non avrebbe acidi nucleici e il degli Stati Uniti, diretto da Gambetti. suo costituente fondamentale sarebbe una proteina, la PrP-res o una forma simile. Di recente, tuttavia, lo stesso Prusiner ha ipo- Età media d'esordio 66 39 64 52 59 61 tizzato l'esistenza di una seconda proteina, o proteina X, con un ERIC EBOLI tiene tra le ruolo nella patogenesi della malattia. In alternativa ci sono la (anni) braccia il figlio Le form sicuramente acquisite diZattia da prioni nell'uomo teoria virale e la teoria del virino. Entrambe postulano l'esistenza D(muerastia) 15 16 16 17 7 Arnaud, affetto dalla di una molecola informazionale in grado di replicarsi, probabil- variante della Modalità di trasmissione Esempi [numero dicasi] Incubazione (anni) mente un acido nucleico. Nella prima ipotesi sarebbe l'acido nu- malattia di CJ cleico di un piccolo virus con caratteristiche non convenzionali, IL GENE PER LA PROTEINA PRIONICA, presente in tutta la popolazione, associata alla BSE. Trapianto Dura madre (114) 1,3-18 per la seconda un acido nucleico o un'altra molecola legata a ha un polimorfismo al codone 129, che è correlato alla malattia Dopo una lunga Io inoculazione intracranica Elettrodi stereotassici (2) 1,3-1,8 una molecola protettiva dell'ospite, in questo caso la PrP. La di Creutzfeldt-Jakob sporadica [in alto]. Gli omozigoti, soprattutto sofferenza, il ragazzo Trapianti extracranici Cornea [2') mancanza di modelli che riproducano spontaneamente la malat- quelli MM, sono più suscettibili a sviluppare la malattia rispetto è mancato all'inizio di it, Inoculazione extracranica Ormone della crescita (139) 4-30 tia naturale e di una spiegazione del fenomeno dei «ceppi» - che agli eterozigoti. La frequenza osservata è relativa ai 300 casi quest'anno. In basso, Embolizzazione arteriosa 3,5-7,5 descriveremo più avanti - rimangono i principali ostacoli per la che sono stati studiati in cinque anni. La tabella inferiore evidenzia un'équipe di con dura madre liofilizzata (2) dimostrazione definitiva dell'ipotesi sostenuta da Prusiner. le varianti di CJ sporadica, definite dalla combinazione veterinari ispeziona Inoculazione extracranica Esposizione alla BSE [>90] [10 o più?) La ragione fondamentale per cui, a mio avviso, conviene tra genotipo al codone 129 e il tipo di PrP-res, correlate a differenti le stalle di un o ingestione Trasmissione del kuru attraverso 4-40 cannibalismo (qualche migliaio) mantenere una mente aperta sulla natura biologica dei prioni è decorsi della malattia. allevamento italiano. che molti dati scientifici a sostegno delle varie teorie o non sono conclusivi o si prestano a più interpretazioni. Per esempio, il fat- ceppi distinti, e il profilo genetico dell'animale che sviluppa l'in- to che la PrP-res sia l'unica molecola finora purificata dalle fra- fezione. I ricercatori di Edimburgo hanno dimostrato l'esistenza zioni infette e che in queste compaiano piccole quantità di acidi di almeno 10 ceppi dell'agente dello scrapie, ciascuno in grado di nucleici non esclude l'esistenza di un'altra molecola informazio- trasmettere una malattia con caratteristiche specifiche dopo ino- nale, dato che nuove molecole, acidi nucleici inclusi, possono es- culazione in animali dotati dello stesso patrimonio genetico. Le sere molto difficili da trovare. E così il fatto che i topi che non proprietà che distinguono i ceppi includono il tempo di incuba- esprimono la proteina prionica non si ammalano né lasciano re- zione, il tipo e la distribuzione delle lesioni e le modalità di distri- plicare l'agente è compatibile sia con l'ipotesi che la PrP-res sia buzione intracerebrale della proteina prionica patologica. È stato l'agente stesso, sia che la PrPC sia un cofattore o un recettore inoltre individuato un gene che oggi sappiamo essere il gene che coinvolto nella patogenesi di un'infezione esogena. codifica la PrP (PRNP), le cui variazioni di sequenza appaiono correlate a forme diverse della malattia. Negli ovini sono noti al- Malattie misteriose meno tre polimorfismi del PRNP in grado di influire sia sulla sin- tomatologia dello scrapie, sia sulla suscettibilità alla malattia. Una delle caratteristiche più misteriose e affascinanti delle ma- Mentre la determinazione del genotipo PRNP è relativamente lattie da prioni è la loro eterogeneità di sintomi e segni clinici. semplice, molto più complesso è il riconoscimento dei ceppi. Fi- Nelle sue espressioni estreme, nell'uomo la malattia può mimare no a pochi anni fa l'unico mezzo di indagine era la trasmissione un ictus o un'encefalite acuta e portare al decesso in poche setti- ad animali singenici, un sistema che richiedeva, in media, alcuni mane, ma anche provocare un deterioramento intellettivo croni- anni. Tra il 1992 e il 1994 si è concretizzata una nuova possibi- co simile a quello causato dalla malattia di Alzheimer. Questa lità di analisi. Richard Bessen e Richard Marsh, che studiavano eterogeneità è ancora più evidente quando si esamina il cervello l'encefalopatia spongiforrne dei visoni nel Wisconsin, osservaro- dopo l'autopsia. Benché la degenerazione spongiforme sia una no differenze nelle proprietà fisico-chimiche della PrP-res isolata delle lesioni fondamentali, esistono casi in cui essa è assente o da due ceppi di prione e suggerirono che esse potevano costituire circoscritta ad alcune aree del cervello. Rari casi sono caratteriz- le basi molecolari della diversità tra ceppi. zati dalla presenza di depositi di sostanza amiloide simili alle placche senili della malattia di Alzheimer, mentre nella maggio- La malattia di Creutzfeldt-Jakob sporadica ranza di essi i depositi sono assenti. Studi sullo scrapie sperimentale, per lo più condotti all'Institu- Fin dagli inizi del secolo si conosceva l'eterogeneità di questa te for Animai Health di Edimburgo dagli anni settanta, avevano malattia. Nel 1929 Heidenhain, un medico tedesco, aveva osser- dimostrato che l'eterogeneità fenotipica di questa e altre malattie vato tre pazienti con disturbi visivi presenti dall'esordio della animali è legata a due variabili: il prione, che esiste in natura in malattia e dovuti, come dimostrò l'autopsia, a gravi lesioni nelle 55