UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI VERONA Dottorato di Ricerca in BIOTECNOLOGIE INDUSTRIALI ED AMBIENTALI 17° ciclo - III ciclo nuova serie Ruolo diagnostico della tipizzazione delle proteine 14-3-3 liquorali nella Malattia di Creutzfeldt-Jakob Coordinatore: Ch.mo Prof. Hugo Luis Monaco Tutore: Ch.mo Prof. Salvatore Monaco Dottorando: Michele Fiorini Ai miei genitori INDICE ABSTRACT........................................................................................................................1 RIASSUNTO.......................................................................................................................3 INTRODUZIONE.................................................................................................................5 LE ENCEFALOPATIE SPONGIFORMI TRASMISSIBILI...........................................................5 Introduzione.............................................................................................................................5 L’agente patogeno...................................................................................................................5 Eziologia delle malattie da prioni umane................................................................................8 Genetica...................................................................................................................................9 Biochimica.............................................................................................................................10 Caratteristiche cliniche della sCJD.......................................................................................11 Basi molecolari della sCJD...................................................................................................12 Diagnosi della sCJD..............................................................................................................14 Criteri diagnostici per la sCJD)............................................................................................16 LIQUIDO CEREBROSPINALE (CSF).......................................................................................17 Introduzione...........................................................................................................................17 LE PROTEINE 14-3-3...............................................................................................................19 Introduzione..........................................................................................................................19 Struttura................................................................................................................................21 Struttura e funzione ..............................................................................................................23 Fosforilazione.......................................................................................................................25 Comunicazione intracellulare, divisione e differenziazione cellulare..................................26 Funzione nei canali ionici ....................................................................................................27 Apoptosi................................................................................................................................28 Le proteine 14-3-3 nelle malattie neurologiche....................................................................31 Le proteine 14-3-3 nella malattia di Creutzfeldt-Jakob sporadica.......................................32 PROTEINA TAU........................................................................................................................35 Proteina Tau nella sCJD ......................................................................................................37 SCOPO DELLA TESI ......................................................................................................38 PAZIENTI E METODI .......................................................................................................40 PAZIENTI...................................................................................................................................40 STUDI GENETICI......................................................................................................................40 ELETTROFORESI SU GEL POLIACRILAMIDE IN PRESENZA DI SODIO-DODECIL-SOLFATO (SDS-PAGE)............................................................................41 ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE (2D-PAGE) ...............................................................42 WESTERN BLOT.......................................................................................................................43 DOSAGGIO DELLA PROTEINA TAU .....................................................................................44 ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DELLA PROTEINA UMANA RICOMBINANTE 14-3-3 ζ.......................................................................................................45 DEFOSFORILAZIONE CON FOSFATASI ALCALINA............................................................46 RISULTATI.......................................................................................................................47 STUDIO RETROSPETTIVO DI CAMPIONI DI CSF DI SOGGETTI CON SCJD DEFINITA.......................................................................................................................47 Pazienti.................................................................................................................................47 Ricerca della proteina 14-3-3...............................................................................................48 Dosaggio della proteina Tau................................................................................................49 STUDIO DI CAMPIONI DI CSF DI PAZIENTI IN TRATTAMENTO CON NEUROLETTICI ........................................................................................................................51 Pazienti.................................................................................................................................51 Ricerca della proteina 14-3-3...............................................................................................51 Dosaggio della proteina Tau................................................................................................53 CARATTERIZZAZIONE DELLE DIVERSE ISOFORME DI 14-3-3 NEL TESSUTO CEREBRALE NEI SOGGETTI CON SCJD DEFINITA E NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO CON NEUROLETTICI...........................................................54 Studio della specificità degli anticorpi utilizzati e caratterizzazione monodimensionale................................................................................................................54 CARATTERIZZAZIONE DELLE DIVERSE ISOFORME DI 14-3-3 NEL CSF DEI SOGGETTI CON SCJD DEFINITA E NEI PAZIENTI IN TRATTAMENTO CON NEUROLETTICI..................................................................................58 Caratterizzazione monodimesionale.....................................................................................58 Caratterizzazione bidimensionale..........................................................................................60 Defosforilazione enzimatica dei campioni di CSF................................................................61 Defosforilazione enzimatica dei campioni di CSF................................................................62 DISCUSSIONE ................................................................................................................64 BIBLIOGRAFIA ...............................................................................................................68 RINGRAZIAMENTI..........................................................................................................82 ABSTRACT The 14-3-3 proteins are a family of multifunctional polypeptides highly expressed in human brain. In several neurological disorders, characterized by rapid tissue destruction, these and other neuronal proteins, including Tau-protein, are released in the cerebrospinal fluid (CSF). Here were investigated 59 CSF samples of patients screened for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease (sCJD). Twelve patients were under treatment with typical and atypical antipsychotic drugs (NT patients). All samples except control specimens were 14-3-3 positive. High Tau-protein levels were found in CSF from sCJD subjects, whereas normal CSF Tau-protein levels were observed in the 12 NT patients. NT, sCJD and control CSF were studied by one- and two-dimensional immunoblots with 14-3-3-isotype-specific antibodies. All patients with “14- 3-3/Tau-protein dissociation” showed a marked increase of phosphorylated 14-3-3 ζ, while 14-3-3 γ, ε and unphosphorylated ζ were seen in Creutzfeldt-Jakob disease. These results show that characterization of CSF 14-3-3 isotypes greatly increases diagnostic sensitivity in patients under evaluation for sCJD. The novel detection of phosphorylated 14-3-3 ζ, an inactivated anti- apoptotic factor, in patients under treatment with neuroleptics raises the possibility that neuroleptic drugs may activate neuronal apoptotic mechanisms. 1 In addition, detection in the CSF of phosphorylated 14-3-3 ζ, may represent a real-time marker of ongoing cellular processes in the brain. 2 RIASSUNTO Le proteine 14-3-3 sono una famiglia di proteine multifunzionali altamente espresse nel cervello umano. In numerose malattie neurologiche, caratterizzate da una rapida distruzione tissutale, queste ed altre proteine, comprese la proteina Tau, sono rilasciate nel liquido cerebrospinale. In questa tesi sono stati studiati 59 campioni di CSF di pazienti con una diagnosi di malattia di Creutzfeldt-Jakob sporadica (sCJD), Dodici pazienti erano in trattamento con farmaci antipsicotici tipici e atipici (pazienti NT). Tutti i campioni, ad eccezione dei controlli erano 14-3-3 positivi, ma abbiamo rilevato alti livelli di Tau nei CSF poi attribuiti a pazienti sCJD confermati e livelli di proteina Tau liquorale normali nei 12 pazienti NT. I CSF di soggetti NT, sCJD e dei controlli sono stati analizzati con immunoblot con anticorpi anti-14-3-3 isoforma specifici dopo separazioni mono- e bi-dimensionali. Tutti i pazienti con “dissociazione 14-3-3/proteina Tau" hanno mostrato un marcato incremento di 14-3-3 ζ fosforilata, mentre nella sCJD sono stati osservate le 14-3-3 γ, ε e ζ non fosforilata. Questi risultati mostrano che la caratterizzazione degli isotipi di 14-3-3 nel CSF aumentano notevolmente la sensitività diagnostica nei pazienti in diagnosi per sCJD. La nuova identificazione della 14-3-3 ζ fosforilata, un fattore anti- apoptotico inattivato, nei pazienti in trattamento con neurolettici aumenta 3 la possibilità che i farmaci neurolettici possano attivare meccanismi apoptotici neuronali. Inoltre, la ricerca della 14-3-3 ζ fosforilata nel CSF può rappresentare un marker in tempo reale di processi cellulari in atto. 4