originalni znanstveni rad / original sCientiFiC PaPer Kvantifikacija kloramfenikola u hrani za životinje Nina Bilandžić, M. Mitak, Božica Solomun Kolanović, Ivana Varenina, Đurđica Božić i Manuela Zadravec Uvod kloramfenikol se kao antibiotik nalazi ostataka lijeka u posljednjih širokog spektra djelovanja oralno (baza nekoliko godina u prehrambenim ili palmitat) i parenteralno (baza ili proizvodima. tako su preko sustava sukcinat) koristio u liječenju mastitisa, brzog uzbunjivanja za hranu i hranu za pijelonefritisa, prostatitisa, meningitisa, životinje RASFF (engl. Rapid Alert System salmoneloze, infekcija oka, infekcija for Food and Feed) prijavljene povišene vanjskog uha te drugih infekcija koncentracije u mesu peradi i ostalih prouzročenih anaerobnim bakterijama životinja, ribi i ribljim proizvodima, (Dowling, 2006.). rakovima, medu i matičnoj mliječi, Brojne su studije o oralnoj i mlijeku i mliječnim proizvodima te parenteralnoj primjeni u ljudi potvrdile hrani za životinje (RASSAF, 2002.–2008.). da je najznačajniji toksični učinak Stoga je potreban učinkovit nadzor i kloramfenikola na funkciju koštane praćenje kloramfenikola u proizvodima srži (WHO, 2004.). U životinja je pri životinjskog podrijetla, ali i u hrani za primjeni velikih doza ili dugoročene životinje. terapije utvrđena reverzibilna depresija Veliki broj nesukladnih rezultata aktivnosti koštane srži u svim vrstama, kloramfenikola (više od 50%) zabilježen je a ostali efekti u životinja su diarea, u proizvodima uvezenih iz Azije, odnosno povraćanje, anoreksija i depresija kine, Vijetnama i Indije (RASSAF, 2002.– (WHO, 2004.). S obzirom da je utvrđeno 2008.). tome mogu biti različiti uzroci kao da ima citotoksični, genotoksični i što su ilegalno korištenje lijeka u stočarskoj hematotoksični utjecaj na ljudsko zdravlje proizvodnji, ingestija kloramfenikola zabranjen je za uporabu u životinja koji potječe iz okoline ili kontaminacija namijenjenih za hranu u Europskoj sudjelovanjem radnika u proizvodnji, a uniji (EC, 1994.) te u mnogim drugim koji je koristio kloramfenikol (Berendsen zemljama, uključujući: SAD, kanadu, i sur., 2010.). Jedno od objašnjenja je i Australiju, Japan i kinu. Unatoč zabrani, kontaminacija usljed prirodne pojave kloramfenikol se i dalje nezakonito kloramfenikola u tlu jer ga biosintetiziraju koristi pri uzgoju životinja zbog svoje mikroorganizmi iz tla Streptomyces učinkovitost i niske cijene, što pokazuju venezuelae i nekoliko drugih Actynomycetea Dr. sc. Nina BILANDŽIĆ, dipl. ing. biotehnol., znanstvena savjetnica, dr. sc. Mario MItAk dr. med. vet., znanstveni savjetnik, Božica SOLOMUN kOLANOVIĆ, dipl. ing. preh. biotehnol., Ivana VARENINA, dipl. ing. biotehnol., Đurđica BOŽIĆ, dipl. ing. preh. biotehnol., dr. sc. Manuela ZADRAVEC, dr. med. vet., Odjel za veterinarsko javno zdravstvo, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb VETERINARSKA STANICA 46 (4), 2015. 257 NINA BIlANdžIć, M. MITAK, BožICA SoloMuN KolANoVIć, IVANA VARENINA, ĐuRĐICA BožIć i MANuElA ZAdRAVEC (EMEA, 1994.). Pretpostavljeno je da trava hrane za životinje farmi diljem Hrvatske. i bilje mogu apsorbirati i akumulirati S obzirom na vrstu uzoraka hrane za kloramfenikol te ako se koriste za ispašu ili životinje broj uzoraka je bio namijenjen se dodaju hrani za životinje ili kao krmno za: 56 perad (konzumne nesilice, pilići, bilje mogu posljedično kontaminirati purići), 50 goveda (muzne krave, proizvode životinjskog podrijetla junad), 50 svinje (tovljenici, odojci). (Berendsen i sur., 2010.). Nakon prikupljanja, uzorci su usitnjeni, kontrola kloramfenikol u Europskoj pohranjeni u polietilenske vrećice, se Uniji provodi primjenom kriterija označeni te čuvani na tamnom i suhom granice najmanje zahtjevane učinkovitosti mjestu do analize. izvedbe metode (MRPL, engl. minimum required performance limit) od 0,3 µg/kg reagensi i standardi koja predstavlja minimalnu koncentraciju koncentracije kloramfenikola kloramfenikola u uzorku koju metoda određivane su primjenom ELISA mora detektirati (EC, 2003.). to je ujedno kita proizvođača EuroProxima B.V. i referentna točka postupanja koja se (Arnhem, Nizozemska). kit se sastoji koristi u ocjeni ispravnosti svih vrsta od: mikrotitarska ploča (96 jažica), hrane. Za kvantifikaciju koncentracija standardna otopina kloramfenikola 100 kloramfenikola danas se koriste ppb (spremno za uporabu), otopine orijentacijski imunoenzimski testovi standarda kloramfenikola (2, 0,5, 0,2, (ELISA) te plinska kromatografija s ECD 0,1, 0,05, 0,025 i 0 ng/mL), pufer za detekcijom, GC-ECD (ECD, engl. Electro razrijeđivanje (4x koncentriran), pufer Capture Detector) (Cerkvenik-Flajs, 2006.), za ispiranje (20x koncentriran), pufer za odnosno za potvrdne analize metode rekonstituciju konjugata i protutijela/ plinske i tekućinske kromatografije- zero standard (spremno za uporabu), tandemske spektrometrije masa (GC-MS/ otopin supstrat/kromogen (spremno MS, LC-MS/MS) (Stolker i Brinkman, za uporabu), stop otopine (spremno 2005., Peng i sur., 2006., Rønning i sur., za uporabu), konjugat (liofilizirani), 2006., Berendsen i sur., 2010., Douny i protutijela (liofilizirano). sur., 2013.). Standard kloramfenikola nabavljen je Ova je studija nastala na temelju literaturnih podataka koji sugeriraju od proizvođača Sigma (St. Louis, SAD). da se kloramfenikol može prirodno Metanol, kloroform i amonij acetat nabavljeni nalaziti u biljkama i travi koje se koriste su od J. t. Baker (Deventer, Nizozemska). za hranidbu, odnosno ispašu životinja Etil acetat je nabavljen od Carlo Erba koje se koriste u proizvodnji namirnica (Milano, Italija). Izooktan je nabavljen životinjskog podrijetla. Stoga je glavni cilj od kemike (Zagreb, Hrvatska). Dušik 5,0 ovog istraživanja bio provesti određivanje i 5,5 za uparavnje uzoraka nabavljen je od kloramfenikola u različitim vrstama SOL spa (Monza, Italija). Ultra čista voda je hrane za životinje. Za kvantifikaciju je pripremljena koristeći sustav Direct Q 5UV primijenjena orijentacijska ELISA metoda (Merck Millipore, Darmstadt, Njemačka). koja je validirana prema Odluci komisije Bazne otopine standarda pripremljene 2002/657/EC (EC, 2002.). su otapanjem analita u metanolu. Radne otopine upotrebljavane za obogaćivanje slijepih uzoraka dobivene su daljnjim Materijali i metode razrjeđivanjem, koristeći isto otapalo do Prikupljanje uzoraka koncentracije od 1 µg/mL. Bazne i radne tijekom 2013. i 2014. godine ukupno otopine standarda su pohranjene na +2 do je prikupljeno ukupno 156 uzoraka +8 oC. VETERINARSKA STANICA 46 (4), 257-263, 2015. 258 Kvantifikacija kloramfenikola u hrani za životinje / Quantification of Chloramphenicol Residues in Feed instrumenti granica kvantifikacije LOQ izračunati U pripremi uzorka korišteni su su nakon analiziranja 20 negativnih sljedeći instrumenti: homogenizator uzoraka, odnosno tako da se srednjoj Ultra-turrax® model t25IkA®, Vortex vrijednosti ponavljanih uzoraka model VWR, VX-2500 (IkA® -WERkE pribroji 3 (LOD), odnosno 10 (LOQ) GMBH & CO.kG, Njemačka), centrifuga standardnih devijacija uzoraka. Granična ROtANtA 460 R (Hettich Zentrifugen, koncentracija CCα određena je kao tuttlingen, Njemačka), uparivač dušikom zbroj srednje vrijednosti koncentracije N-EVAP model 111 (Orgamonation slijepih uzoraka i standardne devijacije Associates Inc., Berlin, Njemačka). odgovora slijepih uzoraka pomnožene Vrijednosti apsorbance za ELISA metodu s 2. Sposobnost dokazivanja CCβ mjerene su na mikročitaču tecan model (β=5%) je dobivena kao zbroj granične Sunrise (tecan, Austria GmbH, Salzburg, koncentracije i odgovarajuće standardne Austrija). devijacije pomnožene s 1,64. Iskorištenje je određeno obogaćivanjem slijepih Priprema uzorka uzoraka mlijeka na tri koncentracijska Homogenizira se 5 g usitnjenog nivoa: 0,15, 0,3 i 0,45 mg/kg. također uzorka s 20 mL destilirane vode te određena je i ponovljivost rezultata se odpipetira 5 mL ove mješavine u izračunom koeficijenta varijacije rezultata staklenu epruvetu. Doda se 10 mL etil CV%. acetata i miješa 30 minuta te centrifugira 10 minuta pri 2000 x g. Pipetira se 5 statistička analiza mL gornjeg sloja etil acetata u staklenu Statistička analiza je provedena epruvetu i upari u blagoj struji dušika računalnim programom Statistica 6,1 pri 50 °C. Masni se ostatak otopi u 0,5 mL (StatSoft® Inc., tulsa, SAD). koncentracije mješavine izooktan/kloroforma (2:3, v/v) kloramfenikola su izražene kao minimalna i doda 0,5 mL pufera za razrijeđivanje i maksimalna koncentracija, srednja uzoraka te miješa 1 minutu. Centrifugira vrijednost ± standardna devijacija (SD). se 10 minuta pri 2000 x g. Za analizu se koristi 50 µL gornjeg sloja. rezultati i rasprava Postupak elisa testa Prijašnja istraživanja potaknula su test je proveden prema uputama tezu da postoji realna mogućnost da proizvođača Euro-Proxima. Apsorbancija proizvodi životinjskog podrijetla mogu je mjerena pri 450 nm, uporabom sadržavati ostatke kloramfenikola koji spektrofotometra za ELISA mikrotitarske nisu podrijetlom od (ilegalne) uporabe pločice. lijeka, nego su posljedica prirodnih koncentracija iz biljaka (Berendsen i validacija metode sur., 2010., 2011., Stolker i sur., 2012.). Postupak validacije metode za RASFF sustavom je u 2002., 2003., 2004. određivanje kloramfenikola u uzorcima i 2008. zabilježeno 20, 3, 4 i 6 hrane za hrane za životinje proveden je sukladno životinje s povišenim koncentracijama zahtjevima Odluke komisije 2002/657/ kloramfenikola (RASFF, 2002.-2008.). Pri EC (EC, 2002.). Određeni su validacijski tome je najviša koncentracija od 33,5 ug/ pokazatelji: sposobnost dokazivanja kg utrđena u ribljoj smjesi podrijetlom s CCβ, granica detekcije LOD, granica Islanda (RASFF. 2004.). kvantifikacije LOQ, iskorištenje i U ovome su radu koncentracije ponovljivost. Granica detekcije LOD i kloramfenikola u hrani za životinje VETERINARSKA STANICA 46 (4), 257-263, 2015. 259 NINA BIlANdžIć, M. MITAK, BožICA SoloMuN KolANoVIć, IVANA VARENINA, ĐuRĐICA BožIć i MANuElA ZAdRAVEC Tabela 1. Karakteristike metode prema provedenoj validaciji za određivanje kloramfenikola u hrani za životinje. CCb LOD LOQ Dodana koncentracija Iskorištenje Ponovljivost (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (µg/kg) (%) CV (%) 0,15 63,3 17,0 0,15 0,032 0,084 0,3 77,3 24,1 0,45 101,9 12,4 Ukupno 80,8 17,8 određivane ELISA metodom čiji se mogli kvantificirati vrijednosti su se su parametri validacije prikazani u kretale u rasponu 0,035 - 0,1252 µg/kg, a tabeli 1. U postupku validacije je srednja vrijednost je 0,0698 µg/kg. utvrđeno da je metoda sposobna Prvotno istraživanje provedeno u detektirati koncentracije od 0,032 µg/kg Nizozemskoj uključivalo je uzorke biljnog kloramfenikola što je znatno manje od materijala prikupljenog u Mongoliji zahtjevane učinkovitosti izvedbe metode tijekom 2007. godine, zatim uzorke iz (MRPL) od 0,3 µg/kg. kloramfenikol se lokalnih trgovina u Nizozemskoj te uzorke detektira pri koncentracijama od 0,3 µg/ biljke Artemisia frigida iz države Utah, kg uz vrlo dobru ponovljivost. Najniža SAD (Berendsen i sur., 2010.). U biljnim koncentracija koju je metoda sposobna uzorcima iz Mongolije kloramfenikol je dokazati uz vjerojatnost pokazivanja određen do koncentracije od 450 µg/kg. lažno negativnog rezultata od 5% (CCβ) U jednoj biljnoj smjesi iz lokalne trgovine je 0,15 µg/kg. Određeno je ukupno u Nizozemskoj te uzorku A. frigida iskorištenje za ELISA metodu od 80,8% kloramfenikol je kvantificiran na niskoj te je unutar preporučenog raspona od razini. Rezultati ispitivanja pokazali su da 50% do 120%. testiranje ponovljivosti biljke različitih porodica mogu sadržavati pokazalo je da ponavljanje analiza kloramfenikol, a određen je i u biljkama uzoraka daje neznačajno rasipanje iz porodice Artemisia ili Thalictrum, rezultata, odnosno koeficijent varijacije ali i u travi. Zatim je u 2009. godini CV od 17,8% (manje od 25%). s Mongolijskih pašnjaka prikupljeno U ovome istraživanju je tijekom 2013. ukupno 192 uzoraka lišća, korijena, i 2014. godine prikupljeno i analizirano stabljika A. sieversiana i A. frigida i tla te je ukupno 156 uzoraka hrane za životinje. analizom reprezentativnih 87 uzoraka u 13 U samo 12 uzoraka koncentracije uzoraka utvrđena mjerljiva koncentracija kloramfenikola bile su iznad LOD kloramfenikola. U samo pet uzoraka od vrijednosti metode od 0,032 µg/kg dok 13 koncentracije su bile između 1 i 5 µg/ su u 144 uzorka koncentracije bile ispod kg, dok su u svim drugima bile manje od LOD (tabela 2). Za 12 uzoraka koji su 1 µg/kg. Nisu utvrđene specifične veze Tabela 2. Koncentracije kloramfenikola u hrani za životinje. Broj Srednja vrijednost ± Minimum Maksimum uzoraka SD (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) 12 0,0698 ± 0,0339 0,0350 0,1252 144 < LOD VETERINARSKA STANICA 46 (4), 257-263, 2015. 260 Kvantifikacija kloramfenikola u hrani za životinje / Quantification of Chloramphenicol Residues in Feed između koncentracija u tlu i u biljkama, može pojaviti kao posljedica proizvodnje odnosno koncentracije pronađene na bakterija u tlu, što ga ujedno svrstava u određenom mjestu. Čini se da su uzorci grupu ksenobiotika, a to otvara vrata koji sadrže kloramfenikol nasumično brojnim diskusijama i promjenama raspoređeni. Pretpostavlja se da razlike propisa koji reguliraju međunarodnu u koncentracijama biljnih uzoraka iz trgovinu i sigurnost potrošača. Mongolije između 2007. (suha godina) i 2009. (vrlo vlažna godina), mogu biti i sažetak posljedica razlike u klimatskim uvjetima koji imaju jak utjecaj na biosintezu kloramfenikol je antibiotik širokog kloramfenikola u mikroorganizmima u spektra te ima povijesni tijek u korištenju tlu i njegove apsorpcije u biljke. u veterinarskoj praksi u većini životinja Nakon ovog istraživanja u za proizvodnju hrane, u liječenju različitih Nizozemskoj je usljedilo prvo praćenje infekcija prouzročenih aerobnim i anaerobnim kloramfenikola u slami pri čemu je u 57% mikroorganizmima. Postoji zabrinutost zbog (od n=21) uzoraka utvrđena koncentracija potencijalne genotoksičnosti kloramfenikola uglavnom ispod 1 µg/kg, a maksimalna i njegovih metabolita na embrije i fetuse koncentracija bila je 11 µg/kg (Stolker te kancerogenog utjecaja i uzrokovanja i sur., 2012.). Opširnija studija (n=104) aplastične anemije u ljudi. Zbog potencijalnog pokazala je 37 pozitivnih uzoraka (36%), zdravstvenog rizika koji predstavlja i u svojim od kojih je sedam bilo iznad 0,3 µg/kg tragovima u hrani godine 1994. zabranjena dok je jedan rezultat bio iznad 1 µg/kg, je primjena kloramfenikola u životinja za odnosno iznosio je 6,8 µg/kg (Berendsen proizvodnju hrane u Europskoj uniji (EU). i sur., 2011.). Uspostavljena je obvezna kontrola ostataka Nedavna daljnja istraživanja istih kloramfenikola u hrani i postavljen je kriterij autora potvrdila su da Streptomyces granice najmanje zahtjevane učinkovitosti venezuelae može proizvoditi znatnu izvedbe metode (MRPL) od 0,3 µg/kg za količinu kloramfenikola u nesterilnom metode koje se koriste za kvantifikaciju. tlu (Berendsen i sur., 2013.). Istraživan je Ukupno 156 uzoraka hrane (56 za perad, i prijenos kloramfenikola iz tla uporabom 50 za goveda, 50 za svinje) je prikupljeno u pšenice i kukuruza na tri različita tla 2013. i 2014. godini i analizirano na ostatake koja su zalijevana vodom koja sadrži kloramfenikola. ELISA metoda korištena za kloramfenikol različitih koncentracija. kvantifikaciju kloramfenikola je validirana Utvrđeno je da je kloramfenikol u skladu s kriterijima propisanim Odlukom preuzet u biljke te da je razina u komisije 2002/657/EC te su utvrđeni sljedeći kulturama u korealaciji s primijenjenim parametri: LOD (granica određivanja) 0,032 koncentracijama. Prema tome je µg/kg, LOQ (granica kvantifikacije) 0,084 µg/ zaključeno da se ostatci kloramfenikola kg, CCβ (sposobnost dokazivanja) 0,15 µg/ mogu pojaviti u usjevima kao rezultat kg, iskorištenje 80,8%, preciznost izražena kao proizvodnje kloramfenikola bakterijama CV od 17,8%. Za 144 uzoraka hrane određene u tlu što prouzroči dospijevanje u usjeve. su koncentracije ispod LOD vrijednosti. Za Zaključno, u ovome istraživanju 12 kvantificiranih uzoraka koncentracije su u nisu utvrđene značajne koncentracije rasponu od 0,035 do 0,1252 µg/kg, a srednja kloramfenikola koje bi mogle upućivati vrijednost je 0,0698 µg/kg. Stoga su utvrđeni da su u sastojcima hrane za životinje rezultati koncentracija kloramfenikola prisutne količine kloramfenikola. ispod MRPL i može se zaključiti da ostatci Međutim, istraživanja u Nizozemskoj kloramfenikola nisu utvrđeni u analiziranim skreću pažnju na to da se kloramfenikol uzorcima hrane. VETERINARSKA STANICA 46 (4), 257-263, 2015. 261 NINA BIlANdžIć, M. MITAK, BožICA SoloMuN KolANoVIć, IVANA VARENINA, ĐuRĐICA BožIć i MANuElA ZAdRAVEC literatura EC as regards the setting of minimum required performance limits (MRPLs) for certain residues 1. BERENDSEN, B., L. StOLkER, J. DE JONG, M. in food of animal origin. Off. J. Eur. Commun. L71, NIELEN, E. tSERENDORJ, R. SODNOMDARJAA, 17-18. A. CANNAVAN and C. ELLIOtt (2010): Evidence 10. EMEA (1994): Chloramphenicol summary report. of natural occurrence of the banned antibiotic European Agency for the Evaluation of Medicinal chloramphenicol in herbs and grass. Anal. Bioanal. Products (EMEA). http://www.emea.europa.eu/ Chem. 397, 1955–1963. pdfs/vet/mrls/chloramphenicol.pdg. 2. BERENDSEN, B. J. A., t. ZUIDEMA, J. D. JONG, 11. PENG, L., Q. YUEMING, C. HUIXIA, k. A. A. M. StOLkER and M. W. F. NIELEN (2011): YING, t. YINGZHANG, W. DANING and X. Discrimination of eight chloramphenicol isomers by MENGXIA (2006): Simultaneous determination of liquid chromatography tandem massspectrometry chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol in order to investigate the natural occurrence of residues in animal tissues by gas chromatography/ chloramphenicol. Anal. Chim. Acta 700, 78−85. mass spectrometry. Chin. J. Chromatogr. 24, 14-18. 3. BERENDSEN, B., M. PIkkEMAAt, P. RÖMkENS, 12. RASFF (2003): Rapid alert system for food and feed R. WEGH, M. VAN SISSEREN, L. StOLkER and M. (RASFF): Annual report 2003, Publications Office of NIELEN (2013): Occurrence of Chloramphenicol in the European Union, Luxembourg, Belgium. Crops through Natural Production by Bacteria in 13. RASFF (2004): Rapid alert system for food and feed Soil. J. Agric. Food Chem. 61, 4004−4010. (RASFF): Annual report 2004, Publications Office of 4. CERkVENIk-FLAJS, V. (2006): Performance the European Union, Luxembourg, Belgium. characteristics of an analytical procedure for 14. RASFF (2008): Rapid alert system for food and feed determining chloramphenicol residues in muscle (RASFF): Annual report 2008, Publications Office of tissue by gas chromatography–electron capture the European Union, Luxembourg, Belgium. detection. Biomed. Chromatogr. 20, 985–992. 15. StOLkER, A. A. M. and U. A. th. BRINkMAN 5. DOUNY, C., J. WIDARt, E. DE PAUW, G. (2005): Analytical strategies for residue analysis of MAGHUIN-ROGIStER and M.-L. SCIPPO veterinary drugs and growth-promoting agents in (2013): Determination of Chloramphenicol in food-producing animals - a review. J. Chromatogr. Honey, Shrimp, and Poultry Meat with Liquid A 1067, 15–53. Chromatography–Mass Spectrometry: Validation 16. StOLkER, A. A. M., G. JEHOEL, M. BAAk VAN, R. of the Method According to Commission Decision S. WEGH and B. J. A. BERENDSEN (2012): Natural 2002/657/EC. Food Anal. Methods 6, 1458–1465. occurrence of chloramphenicol in straw. Poster 6. DOWLING, P. M. (2006): Chloramphenicol, on EuroResidue VII conference, May 14−16, 2012; thiamphenicol, and Florfenicol. In: Antimicrobial Egmond aan Zee: the Netherlands, 2012. http:// therapy in veterinary medicine. 4th Edition, www.euroresidue.nl/images/stories/posters2012/ Blackwell Publishing, pp. 241-247. Poster_205.pdf (pristupljeno 25.05.2015). 7. EC (1994): Commission Regulation (EC) No 2701/94 17. RØNNING, H. t., k. EINARSEN and t. N. ASP amending Annexes I, II, III and IV to Council (2006): Determination of chloramphenicol residues Regulation (EEC) no. 2377/90. Off . J. Eur. Commun. in meat, seafood, egg, honey, milk, plasma and L287, 7. urine with liquid chromatography-tandem mass 8. EC (2002): Commission Decision 2002/657/EC of spectrometry, and the validation of the method 12 August 2002 implementing Council Directive based on 2002/657/EC. J. Chromatogr. A 1118, 226– 96/23/EC concerning the performance of analytical 233. methods and the interpretation of results. Off. J. 18. WHO (2004): Food Additives series: 53, Eur. Commun. L221, 8-28. toxicological evaluation of certain veterinary drug 9. EC (2003): Commission Decision 2003/181/EC residues in food, World Health Organization, of 13 March 2003 amending Decision 2002/657/ Geneva, pp. 7-84. VETERINARSKA STANICA 46 (4), 257-263, 2015. 262 Kvantifikacija kloramfenikola u hrani za životinje / Quantification of Chloramphenicol Residues in Feed Quantification of Chloramphenicol residues in Feed Nina BILANDŽIĆ, BSc, PhD, Scientific Advisor, Mario MItAk, DVM, PhD, Scientific Advisor, Božica SOLOMUN kOLANOVIĆ, BSc, Ivana VARENINA, BSc, Đurđica BOŽIĆ, BSc, Manuela ZADRAVEC, DVM, PhD, Department for Veterinary Public Health, Croatian Veterinary Institute, Zagreb Chloramphenicol is a broad-spectrum pigs) were collected in 2013 and 2014 and antibiotic with historical veterinary uses analyzed for chloramphenicol residues. the in most food-producing animals for the ELISA method used for chloramphenicol treatment of a variety of infections caused by quantification was validated according to the aerobic and anaerobic microorganisms. there criteria laid down by Commission Decision is concern about the potential genotoxicity 2002/657/EC and the following parameters of chloramphenicol and its metabolites were set: LOD (limit of detection) 0.032 µg/kg, and of its embryo-and foetotoxicity, its LOQ (limit of quantification) 0.084 µg/kg, CCß carcinogenic potential in humans and as a (detection capability) 0.15 µg/kg, recovery cause of aplastic anaemia. Due to the potential 80.8%, precision expressed as CV of 17.8%. health risk posed by its traces in food, the For 144 feed samples, levels were below the use of chloramphenicol was banned in food- LOD value. For 12 quantified feed samples, producing animals by the European Union concentrations ranged from 0.035 to 0.1252 (EU) in 1994. the EU established mandatory µg/kg and the mean value was 0.0698 µg/kg. controls of chloramphenicol residues in therefore, the presented results were below food and also has set a minimum required the MRPL for chloramphenicol and it may performance limit (MRPL) of 0.3 µg/kg for be concluded that chloramphenicol residues quantification methods. A total of 156 feed were not found in analyzed feed samples. samples (56 for poultry, 50 for bovine, 50 for VETERINARSKA STANICA 46 (4), 257-263, 2015. 263 Za uporabu u veterinarskoj medicini JednIM potezoM u suštInu enrofloksacin Injekcijska otopina, 100 mg/ml antibakterijski lijek za sustavne infekcije fluorokinolon, enrofloksacin za goveda i svinje Unaprijeđeni tretman za MAXimalni učinak MP. Hrvaška, 3/2010, 2010-11702, NGZ/ SkKmkSSInvtaaaarudiddsernlietaaptjkaoan takkvoc:c clli:ciiid LinnjJojaaieeiijcčč:e,d: c kk MHčuaGooeinses on ii sstssmvjouokkeepi uul sdi h o ssdjoieitt tliB:vvosuš oootLnspiri ,,viij sdhppneeoe čeoo mtieiz e nzmmnnnlaflaujieoo e ii ktnggb rcMjiiruuenciojyććekafncennc: cokooGishjpcussvoiilttsi javEniiae seppnp jmaddoort oioiattcškxkk:a n oisrr1,liii p®j4jjhkeee pM a dpp.oo,uaall rjjtzineexge rl nnaa isojl.ooanei kjSd čeaunnverč jaaižugnenlla naaojjveazzbjva e:ooM ea 1 1mmdkm0M0ta ea0daa Ars nn(ami-tnjnsttietiipigabbn isr. ii.dM eaoo Mrn kggykolorcrrirmojaamoaeflmmvpakpoal oaaaulk e u, sk s ukkmuazrkrsarkcmaa ovaienz kazaunhao:uč j.zy4vajeoeo8a i dpo n dsonatiaashs et jktj eiuaeb.e ml e aiehbnkon rtrnirooenoirflnafflieojehoak,ko mkcspPsiajaaanac cs eEičtinunseij cum lili hisjrjeeeouekrln kliu ac iiizjzh zebrmib oaotoč uercrnalloata.iol.cdic i iiio /dKjsualje,ne btaAlsdjciievit)lii ln anko oapb jneaeenc uiurlomlzuflrsooo nkkpiusalejaeuuc.: ri EnoMn.p Eranonnexruniolmh®xe ioMli®mn aMiiaxae a p,xh r aHipmearmijememonjleojyuntpjijhceua ijlse,u e sPs uaeps ugate orsuavvrseieundliljsaaa, Detaljnije informacije možete dobiti od proizvođača: KRKA - FARMA d.o.o., Radnička cesta 48/II, p.p. 205, Zagreb 10002 www.krka-farma.hr 2010-11702_ENROXIL-MAX_ad-B5_HR.indd 1 18.3.2010 12:05:23 originalni znanstveni rad / original sCientiFiC PaPer Promjene koncentracije kolesterola i triglicerida u serumu pasa tijekom umjerenog treninga Biljana Knežević, Maja Belić i Zoran Vrbanac Uvod Poznato je da vježbanje uzrokuje glukoze, odnosno glikolizom kojom predvidljive promjene u perifernoj nastaje visoko energetski spoj adenozin krvi mnogih životinjskih vrsta. te trifosfat (AtP). Glukoza je u mišićima promjene odražavaju u prvom redu skladištena u obliku glikogena koji se u odgovarajuće fiziološke prilagodbe na slučaju potrebe za energijom razgrađuje na zahtjeve koje postavlja samo vježbanje glukozu-6-fosfat procesom glikogenolize. (kingston, 2004., Davis i sur., 2008.), ali i Enzim glukoza-6-fosfataza koja se nalazi patofiziološka događanja koja proizlaze u jetri, bubrezima i crijevima defosforilira od stresa prouzročenog vježbom glukoza-6-fosfat i time omogućuje (Ricketts, 2004., Davis i sur., 2008.). izlazak glukoze iz stanice. Međutim, Vježbanje također uzrokuje i fiziološke stanice mozga i mišića nemaju glukoza- promjene u broju otkucaja srca, disanju 6-fosfatazu pa zbog toga glukoza u tim i rektalnoj temperaturi. Broj otkucaja tkivima ne može izaći van iz stanice nego srca se smatra indikatorom relativnog se koristi kao izvor energije isključivo za kardiovaskularnog opterećenja i stoga je stanicu u kojoj se nalazi (kronfeld,1982., praćenje broja otkucaja srca vrlo korisno Wilmore i Costill, 1994.) za nadziranje intenziteta treninga kao i za Osim glukoze, izvor energije su i otkrivanje subkliničkih bolesti (Foreman slobodne masne kiseline (SMk). SMk i sur., 1990., Munoz i sur., 1999., Rovira i mogu biti oksidirane u stanicama mnogih sur., 2008.). tkiva, posebice jetre i mišića kako bi se Vrsta napora koju pas izvršava na taj način osigurala dovoljna količina tijekom vježbanja određena je energije. U slučaju kada je organizmu intenzitetom i dužinom trajanja vježbi. potrebna energija, a potrošene su Hormonske promjene koje se zbivaju zalihe glukoze, odnosno glikogena, tijekom vježbanja utječu na metabolizam dolazi do mobilizacije masti iz masnog i sposobnost prilagodbe organizma tkiva. trigliceridi iz masnog tkiva se povećanim energetskim zahtjevima. hidroliziraju na masne kiseline i glicerol. Energija potrebna za kontrakciju mišića SMk se u mitohondrijima oksidiraju dobiva se u prvom redu razgradnjom procesom beta oksidacije do acetil- Biljana kNEŽEVIĆ, dr. med. vet.; dr. sc. Maja BELIĆ, dr. med. vet., docentica, dr. sc. Zoran VRBANAC, dr. med. vet., viši asistent, Veterinarski fakultet, Zagreb VETERINARSKA STANICA 46 (4), 2015. 265 BIljANA KNEžEVIć, MAjA BElIć i ZoRAN VRBANAC koenzima A (acetil-CoA) koji vezanjem najveće sinteze kolesterola u organizmu s oksalacetatom ulazi u ciklus limunske je jetra. U izobilju ga ima u središnjem kiseline kojim se stvara energija u obliku živčanom sustavu, gdje je njegova uloga AtP-a. Iz acetil-CoA sintetizira se još i kao sastavne komponente membrana kolesterol te ketonska tijela (kronfeld, osobito značajna. Prekursor je žučnih 1982.) kiselina koje se sintetiziraju u jetri i Masne kiseline su sastavni dijelovi prijeko su potrebne za apsorpciju masti u većine masti, koje u tijelu služe kao tankom crijevu. Prekursor je i steroidnih rezerva energije. Molekula masne hormona nadbubrežne žlijezde (kortizola kiseline sastoji se od polarne karboksilne i aldosterona) te spolnih hormona skupine (-COOH) koja je topiva u vodi i (estrogena i androgena) (Brown i nepolarnog lanca ugljikovodika koji je Goldstein, 1986., Grundy, 1990., Pavković, topiv u uobičajenim organskim otapalima 2003.). (Rastogi, 2007.). U plazmi se više od 90% Molekule triglicerida i gotovo sve masnih kiselina nalazi u obliku estera molekule kolesterola cirkuliraju u (primarno triglicerola, estera kolesterola plazmi u lipoproteinima. Lipoproteini i fosfolipida) sadržanih u cirkulirajućim predstavljaju transportni oblik lipida lipoproteinskim česticama, dok se ostalih u organizmu. Sastoje se od jezgre 10% masnih kiselina u plazmi nalazi hidrofobnih lipida (trigliceridi i esteri neesterificirano, odnosno slobodno. kolesterola) koji su okruženi hidrofilnim Neesterificirane masne kiseline (slobodne slojem fosfolipida, apolipoproteina i masne kiseline) se transportiraju kolesterola (Stocham i Dolce, 2004.). u cirkulaciji vezane za albumine Prema gustoći lipoproteini se klasificiraju (Harvey i Ferrier, 2010.). Esterificirane u pet skupina: hilomikroni–lipoproteini masne kiseline u obliku triglicerola su bogati trigliceridima iz hrane, lipoproteini pohranjene u masnim stanicama i služe vrlo male gustoće (engl. very low density kao važna rezerva energije za tijelo. lipoprotein–VLDL) koji sadrže uglavnom Oslobađanje triglicerida iz masnih endogene trigliceride, lipoproteini stanica je regulirano hormonima kako srednje gustoće (engl. intermediate density bi se osigurala energija za tijelo između lipoprotein–IDL), lipoproteini niske obroka (Barret, 2013.). Masti u aktivnijim gustoće (engl. low density lipoprotein– dijelovima organizma imaju nižu točku LDL) i lipoproteini visoke gustoće (engl. topljenja i sadrže više nezasićenih masnih high density lipoprotein–HDL) u kojima je kiselina u svom sastavu te se mogu glavni lipid kolesterol (Williams i sur., lakše oksidirati i stalno upotrebljavati za 1993., Pavković, 2003.). razliku od onih koji su pohranjeni kao LDL prenosi kolesterol iz jetre do masno tkivo u drugim, manje aktivnim ostalih stanica u organizmu. Višak se tkivima (Rastogi, 2007.). kolesterola može taložiti na stjenkama kolesterol je karakteristični steroidni arterija i tamo zajedno s još nekim alkohol životinjskih tkiva i obavlja niz tvarima iz krvi stvarati plak koji s esencijalnih funkcija u tkivu (Harvey i vremenom može prouzročiti začepljenje Ferrier, 2010.). Nalazi se u sastavu većine krvnih žila. Zbog toga se LDL-kolesterol staničnih membrana kao čimbenik koji je naziva i “lošim kolesterolom”. HDL ima važan za njihovu stabilnost. Istodobno, ulogu povratnog prijenosa kolesterola kolesterol omogućuje prijenos tvari iz tkiva u jetru. Na taj način smanjuju u stanicu i iz nje (transmembranski vjerojatnost nagomilavanja kolesterola transport). Iako se kolesterol stvara na stjenkama krvnih žila i vjerojatnost u raznim organima i tkivima, mjesto razvoja kardiovaskularnih bolesti. Iz VETERINARSKA STANICA 46 (4), 265-272, 2015. 266