Kurşun (Pb) ve Bakır (Cu) Ağır Metal Stresi Uygulanan Enginar (Cynara scolymus L.) Tohumlarının Fidelerinde Oluşan DNA Değişikliklerinin Belirlenmesi Muhammet Burak Batır YÜKSEK LİSANS TEZİ Biyoloji Anabilim Dalı Ocak 2014 Determination of DNA Changes in Seedlings of Artichoke (Cynara scolymus L.) seeds exposed to Copper (Cu) and Lead (Pb) Heavy Metal Stress Muhammet Burak Batır MASTER OF SCIENCE THESIS Department of Biology January 2014 Kurşun (Pb) ve Bakır (Cu) Ağır Metal Stresi Uygulanan Enginar (Cynara scolymus L.) Tohumlarının Fidelerinde Oluşan DNA Değişikliklerinin Belirlenmesi Muhammet Burak Batır Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Lisansüstü Yönetmeliği Uyarınca Biyoloji Anabilim Dalı Moleküler Biyoloji Bilim Dalında YÜKSEK LİSANS TEZİ Olarak Hazırlanmıştır Danışman: Doç. Dr. A. Pınar VATAN ÖZTOPCU OCAK 2014 ONAY Biyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans öğrencisi Muhammet Burak BATIR’ın YÜKSEK LİSANS tezi olarak hazırladığı “Kurşun (Pb) ve Bakır (Cu) Ağır Metal Stresi Uygulanan Enginar (Cynara scolymus L.) Tohumlarının Fidelerinde Oluşan DNA Değişikliklerinin Belirlenmesi” başlıklı bu çalışma, jürimizce lisansüstü yönetmeliğin ilgili maddeleri uyarınca değerlendirilerek kabul edilmiştir. Danışman : Doç. Dr. A. Pınar ÖZTOPCU VATAN İkinci Danışman : Doç. Dr. Feyza CANDAN Yüksek Lisans Tez Savunma Jürisi: Üye : Doç. Dr. Mediha CANBEK Üye : Doç. Dr. A. Pınar ÖZTOPCU VATAN Üye : Doç. Dr. Mustafa UYANOĞLU Üye : Doç. Dr. Feyza CANDAN Üye : Yrd. Doç. Dr. Gökhan KUŞ Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu’nun ............................. tarih ve ........................ sayılı kararıyla onaylanmıştır. Prof. Dr. Nimetullah BURNAK Enstitü Müdürü v ÖZET Toprakların ağır metaller ile kontaminasyonu ve burada gelişimlerini sürdürmek zorunda olan bitkilerde yüksek konsantrasyonlar da ağır metal birikimi görülür. Bu durum kontaminasyona sahip bölgelerde yetişen bitkilerin hücre ve dokularında toksik hasarlara neden olur. Ayrıca, bitkilerde ağır metal kontaminasyonu genotoksik etki göstererek DNA profilinde mutasyon benzeri değişimlere yol açar. Bu çalışmada, kurşun (Pb) ve bakır (Cu) kontaminasyonunun enginar (Cynara scolymus L.) fideleri üzerindeki etkisi fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler parametreler yardımıyla belirlenmesi amaçlamıştır. Kurşun ve bakır etkisi belirli konsantrasyonlarda enginar fidelerinin kök bölgelerinin uzunluğunda ve toplam çözünür protein miktarında düşüşe neden olmuştur. Moleküler parametrelerden biri olan PCR tabanlı RAPD parmak izi tarama yöntemi, ağır metal stresinin fideler üzerindeki genotoksik etkisinin incelenmesi için kullanılmıştır. Ekolojik ve genotoksik çalışmalarda RAPD yöntemi uygun bir biyobelirteç olarak bitkilerde kullanılmaktadır. RAPD analizi için, 17 farklı RAPD primerinin özgün polimorfik bant paternlerinden yararlanılmıştır. Farklı kurşun ve bakır konsantrasyonlarının kontaminasyonundan sonra kontrol fidelerine göre ağır metal stresi uygulanmış fidelerin RAPD profillerinde bant kazancı ve/veya kaybı gibi çeşitli değişiklikler gözlemlenmiştir. Sonuç olarak; kurşun ve bakır stresine maruz kalan enginar fidelerinin RAPD profillelerine göre yapılan değerlendirmede genomik kalıp stabilitesinin değiştiği görülmüştür. Anahtar Kelimeler : Enginar (Cynara scolymus L.), ağır metal, RAPD, genotoksisite. vi SUMMARY Contamination of the soil with heavy metals and the plants which have to maintain their development in this contaminated area shows accumulation of heavy metals with high dose. This situtation causes toxic damage of plant cells and tissues, which is growth on contaminated area. On the other hand, contamination of plants with heavy metals could be shown genotoxic effect on DNA profile and cause damages like mutation. In this study, the effects of lead (Pb) and copper (Cu) contamination on artichoke (Cynara scolymus L.) seedlings determined by physiological, biochemical and molecular parameters. Reduction of root growth and total soluble protein content in root of artichoke seedlings were observed with the under certain concentrations of lead and copper. For molecular research, PCR (Polymerase Chain Reaction) based RAPD fingerprinting techniques was used for investigate the genotoxic effects of metal stress on seedlings. İn ecologic and genotoxic study, RAPD method was used as a proper biomarker for plants. Unique polymorphic band patterns of 17 different RAPD primers was used for the RAPD analysis. After the contamination of various concentrations of lead and copper, there was a change in RAPD profiles observed as variations like increment and/or loss of bands of seedlings which is implemented to heavy metal stress compared to control seedlings. Consequently, genomic template stability had changed according to the RAPD profiles of seedlings under heavy metal stress. Key Words : Artichoke (Cynara scolymus L.), heavy metal, RAPD, genotoxicity. vii TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca benden bilgilerini ve hoşgörülerini esirgemeyen değerli hocalarım Doç. Dr. A. Pınar VATAN ÖZTOPÇU, Doç. Dr. Feyza CANDAN ve Doç. Dr. Mediha CANBEK’e içtenlikle teşekkür ederim. Tez çalışmalarım sırasında laboratuvarındaki imkânlardan yararlanmamı sağlayan Prof. Dr. E. Sümer ARAS hocama ve çalışmalarım sırasında benden yardımlarını esirgemeyen arkadaşım Öğr. Gör. İlker BÜYÜK’e teşekkür ederim. Ayrıca bu süreç boyunca destekleriyle ve sevgileriyle bana moral veren aileme teşekkür ederim. viii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET ..........................................................................................................................v SUMMARY .............................................................................................................. vi TEŞEKKÜR ............................................................................................................ vii ŞEKİLLER DİZİNİ ...................................................................................................x ÇİZELGELER DİZİNİ ........................................................................................... xii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ .......................................................... xiii 1. GİRİŞ ......................................................................................................................1 2. GENEL BİLGİLER ...............................................................................................2 2.1. Ağır Metaller .....................................................................................................2 2.1.1. Ağır metallerin bitkilerdeki işlevi ................................................................2 2.1.2. Ağır metal kirliliği ve etkileri .......................................................................3 2.2. Ağır Metaller ile Yapılan Çalışmalar ................................................................ 13 2.3. Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA-Random Amplified Polymorphic DNA .... (RAPD) Yöntemi ve Kullanım Alanları .................................................................. 15 2.4. Enginar (Cynara scolymus L.) .......................................................................... 16 3. MATERYAL ve METOD .................................................................................... 18 3.1. Materyal ........................................................................................................... 18 3.2. Metod .............................................................................................................. 18 3.2.1. Tohum yüzey sterilizasyonu ...................................................................... 18 3.2.2. Çimlendirme yöntemi ................................................................................ 18 3.2.3. Bitki kök uzunluğu belirlenmesi ................................................................ 19 3.2.4. DNA izolasyonu ........................................................................................ 19 3.2.5. RAPD protokolü ........................................................................................ 20 3.2.6. RAPD-PCR bileşenleri ve koşulları ........................................................... 21 ix İÇİNDEKİLER (devam) Sayfa 3.2.7. Elektroforez ............................................................................................... 22 3.2.8. Toplam çözünür protein içeriği .................................................................. 23 3.2.9. İstatistiksel analizler .................................................................................. 24 3.2.10. Genomik kalıp stabilitesi (GKS) .............................................................. 24 4. BULGULAR ......................................................................................................... 25 4.1. Kurşun (Pb) ve Bakır (Cu) Stresinin Enginar Tohumlarının Çimlenmesi ............. Üzerine Etkisi .......................................................................................................... 25 4.2. Kurşun (Pb) ve Bakır (Cu) Stresinin Enginar Fidelerinin Kök Uzunluğu ............. Üzerine Etkisi ......................................................................................................... 25 4.3. Kurşun (Pb) ve Bakır (Cu) Stresinin Enginar Fideleri Kök Bölgesinde Toplam ... Çözünür Protein Miktarı Üzerine Etkisi .................................................................. 27 4.4. Kurşun (Pb) ve Bakır (Cu) Stresinin Enginar Fidelerinde RAPD Profili ve........... Genomik Kalıp Stabilitesi (GKS) Üzerine Etkisi ..................................................... 28 5. TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER ................................................................ 41 KAYNAKLAR DİZİNİ ............................................................................................ 47 x ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa 2.1 Haber-Weiss ve Fenton reaksiyonu ................................................................ 6 2.2 8-OHdGua, 8-oxodGua ve 8-oxodAde oluşum yolu ..................................... 9 2.3 OH•’in DNA şeker iskeletinden bir hidrojen atomu çalması sonucu DNA’da tek iplik kırığının meydana gelmesi ................................................. 10 2.4 5’,8-Siklo-2’-deoksinükleozid’ler: (5’S)-5’,8-cdAdo(1), (5’R)-5’,8-cdAdo (2), 5(5’S)-5’,8-cdGua (3), (5’R)-5’,8-cdGua (4) ........................................... 11 2.5 a) Hidrojen bağlarıyla bağlanmış çift iplikli heliks yapı, b) Hidrojen bağları, bakır iyonları (Cu2+, açık renk) ve civa iyonları (Hg+2, koyu renk) ile bağlanmış çift iplikli heliks yapı .................................................................... 12 2.4 RAPD çalışma prensibi ................................................................................... 16 4.1 14 gün farklı kurşun ve bakır konsantrasyonlarında gelişen enginar fidelerine ait kök uzunlukları (cm/fide) .......................................................... 26 4.2 14 gün farklı kurşun ve bakır konsantrasyonlarında gelişen enginar fidelerinde kurşun ve bakır metallerinin kök uzunluğuna etki oranları (%) ... 26 4.3 4 gün farklı kurşun ve bakır konsantrasyonlarında gelişen enginar fide köklerine ait toplam çözünür protein miktarları (mg/L) ................................. 27 4.4 14 gün farklı kurşun ve bakır konsantrasyonlarında gelişen enginar fidelerinde kurşun ve bakır metallerinin kök toplam çözünür protein miktarına etki oranları (%) .............................................................................. 28 4.5 14 gün farklı kurşun ve bakır konsantrasyonlarında gelişen enginar fide köklerine ait DNA’lardan RAPD çalışmaları sonucu elde edilen polimorfizm oranları (%) ................................................................................. 29 4.6 14 gün farklı kurşun ve bakır konsantrasyonlarında gelişen enginar fide örneklerine ait genomik kalıp stabilitesinin (GKS), kontrol fidesine göre karşılaştırılması ................................................................................................ 30 4.7 OP C02 primeriyle yapılan PCR’a ait jel görüntüsü ....................................... 32 4.8 OP C03 primeriyle yapılan PCR’a ait jel görüntüsü ....................................... 32