A vastagbéldaganatok kialakulása során megváltozó expressziójú gének és szabályozó folyamataik vizsgálata Doktori értekezés Kalmár Alexandra Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Molnár Béla, az MTA doktora, tudományos tanácsadó Programvezető: Prof. Dr. Tulassay Zsolt, az MTA rendes tagja, egyetemi tanár Hivatalos bírálók: Dr. Kiss András, Ph.D., egyetemi docens Dr. Ponyi Tamás, Ph.D., tudományos és applikációs munkatárs Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Tóth Sára, Ph.D. habil. egyetemi docens Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Tóth Erika, Ph.D., osztályvezető főorvos Dr. Sebestyén Anna, Ph.D., tudományos főmunkatárs Budapest 2015 TARTALOMJEGYZÉK 1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ................................................................................... 3 2 BEVEZETÉS ............................................................................................................ 6 2.1 A vastagbél szövettani szerkezete .......................................................................... 6 2.2 Vastagbéldaganatok (CRC) .................................................................................... 7 2.2.1 A vastagbéldaganatok epidemiológiája ........................................................... 7 2.2.2 A vastagbéldaganatok kialakulása ................................................................... 8 2.2.3 A vastagbéldaganatok diagnózisa, klinikai stádiumbesorolása ..................... 14 2.2.4 A vastagbéldaganatok szűrőmódszerei .......................................................... 16 2.2.5 A vastagbéldaganatok molekuláris markerei ................................................. 17 2.3 Szöveti minták expressziós és epigenetikai eltéréseinek vizsgálatára alkalmazott molekuláris biológiai módszerek ................................................................................ 25 2.3.1 Szövetminták típusai és vizsgálati lehetőségeik ............................................ 25 2.3.2 Génexpressziós vizsgálatok ........................................................................... 27 2.3.3 DNS metilációs vizsgálatok........................................................................... 29 2.3.4 Fehérjék kimutatása ....................................................................................... 34 3 CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................... 36 4 MINTÁK ÉS MÓDSZEREK ................................................................................. 37 4.1 A vizsgált szövetminták........................................................................................ 37 4.1.1 A vizsgált szövetminták összefoglalása ........................................................ 37 4.1.2 A vizsgált szövetminták feldolgozása ........................................................... 38 4.2 Vastagbélrákra jellemző mRNS markerek vizsgálata automatizáltan izolált friss fagyasztott biopsziás és FFPE mintákon .................................................................... 39 4.2.1 Automatizált RNS izolálás alkalmazhatóságának vizsgálata ........................ 39 4.2.2 Vastagbélrákra jellemző RNS markerek vizsgálata FFPE mintákon ............ 40 4.3 DNS metilációs markerek azonosítása vastagbél szövetminták vizsgálata során 45 4.3.1 Automatizált DNS izolálás alkalmazhatóságának vizsgálata ........................ 45 4.3.2 Markerek kiválasztása DNS metilációs vizsgálatokra................................... 48 4.4 A SEPT9 gén DNS metilációs vizsgálata lézer mikrodisszektált hám és stromális sejtekben ..................................................................................................................... 55 4.4.1 Mintagyűjtés .................................................................................................. 55 4.4.2 Lézer mikrodisszekció ................................................................................... 56 4.4.3 Lézer mikrodisszektált sejtek előkezelése ..................................................... 57 4.4.4 DNS metilációs vizsgálat............................................................................... 57 4.4.5 Immunhisztokémiai vizsgálat ........................................................................ 60 5 EREDMÉNYEK ..................................................................................................... 61 5.1 A vastagbélrákra jellemző RNS markerek vizsgálata automatizáltan izolált friss fagyasztott biopsziás és FFPE mintákon .................................................................... 61 5.1.1 Automatizált RNS izolálás alkalmazásának vizsgálata ................................. 61 5.1.2 A vastagbélrákra jellemző RNS markerek vizsgálata FFPE mintákon ......... 63 5.2 DNS metilációs markerek vizsgálata vastagbéldaganatokban ............................. 69 5.2.1 Automatizált DNS izolálás alkalmazásának vizsgálata DNS metilációs elemzés során .......................................................................................................... 69 5.2.2 DNS metilációs markerek azonosítása vastagbél szövetmintákban .............. 76 5.3 A SEPT9 gén DNS metilációs vizsgálata lézer mikrodisszektált hám és stromális sejtekben ..................................................................................................................... 86 5.3.1 DNS metilációs standard minták vizsgálata .................................................. 86 5.3.2 A SEPT9 gén DNS metilációs szintje ........................................................... 87 1 5.3.3 Septin 9 immunhisztokémia .......................................................................... 90 6 MEGBESZÉLÉS .................................................................................................... 91 6.1 A vastagbélrákra jellemző RNS markerek vizsgálata automatizáltan izolált friss fagyasztott biopszia és FFPE mintákon ...................................................................... 92 6.1.1 Automatizált RNS izolálás alkalmazhatóságának vizsgálata ........................ 92 6.1.2 Vastagbélrákra jellemző RNS markerek vizsgálata FFPE mintákon ............ 93 6.2 DNS metilációs markerek azonosítása vastagbél szövetmintákból ...................... 98 6.2.1 Automatizált DNS izolálás alkalmazhatóságának vizsgálata ........................ 98 6.2.2 Markerek kiválasztása DNS metilációs vizsgálatokra................................. 100 6.3 A SEPT9 gén DNS metilációs szintje vastagbélszövetben ................................ 103 6.4 Az aberráns DNS metiláció okai és következményei ......................................... 106 7 KÖVETKEZTETÉSEK ....................................................................................... 109 8 LEGFONTOSABB ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK ÉS MEGFIGYELÉSEK ............ 110 9 ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................. 111 9.1 Magyar összefoglaló ........................................................................................... 111 9.2 Angol összefoglaló ............................................................................................. 112 10 IRODALOMJEGYZÉK ....................................................................................... 113 11 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE ................................................................. 130 11.1 A disszertáció témájában megjelent közlemények ........................................... 130 11.1.1 Nemzetközi folyóiratban megjelent közlemények .................................... 130 11.1.2 Magyar folyóiratban megjelent közlemények ........................................... 131 11.2. A disszertáció témájától eltérő témában megjelent közlemények ................... 132 11.2.1 Nemzetközi folyóiratban megjelent közlemények .................................... 132 11.2.2 Magyar folyóiratban megjelent közlemények ........................................... 132 12 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS .............................................................................. 133 2 1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 5-Aza - 5-aza-2’-dezoxicitidin 5-FU - 5-fluorouracil ACTB - béta aktin gén AD - adenoma ADP - adenozin-difoszfát ATP - adenozin-trifoszfát APC - adenomatous polyposis coli gén bcDNA - biszulfit konvertált DNS BCIP - 5-bróm-4-kloro-3’-indolil-foszfát BRAF - B-Raf gén BS-PCR - biszulfit-szekvenáló polimeráz láncreakció CA7 - karbon anhidráz gén (Carbonic anhydrase VII) CCD - töltéscsatolt készülék (Charge-coupled device) cDNS - komplementer DNS CGI - CpG sziget (CpG island) CHI3L1 - kitináz 3-szerű 1 gén (Chitinase 3-like 1) CIMP - CpG szigeteket érintő regionális hipermetiláció CIN - kromoszomális instabilitás COL12A1 - kollagén XII, alfa 1 gén COX-2 - ciklooxigenáz-2 gén Cp - áttörési pont (crossing point) CpG - C-G dinukleotid CpG-sziget - CG dinukleotidban gazdag szekvenciarégió CRC - vastagbéldaganat (colorectal cancer) CXCL1 - kemokin (C-X-C motívum) ligand 1 CXCL2 - kemokin (C-X-C motívum) ligand 2 DAB - diaminobenzidin DNS - dezoxiribonukleinsav DNMT - DNS metiltranszferáz 3 ELISA - enzim kapcsolt immunabszorpciós vizsgálat (enzyme-linked immunosorbent assay) emPCR - emulziós polimeráz láncreakció EtOH - etanol GAPDH - glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz gén (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) GEO - Gene Expression Omnibus adatbázis GREM1 - gremlin 1 gén HRP - torma peroxidáz (horseradish peroxidase) FAM - 6-karboxi-fluoreszcein FAP - familiáris adenomatosus polyposis FFPE - formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövet FIT - immunalapú széklet vértartalom meghatározás (Fecal Immunochemical Test) FOBT - széklet vértartalom meghatározás (Fecal Occult Blood test) HNPCC - herediter nem-poliposis kolorektális karcinoma IL1B - interleukin 1 béta gén IL1RN - interleukin 1 receptor antagonista gén IL8 - interleukin 8 gén IVT - in vitro transzkripció K-ras - Kirsten rat sarcoma gén LNA - lakatolt nukleinsav (Locked Nucleic Acid) lncRNS – hosszú nem-kódoló RNS (long non-coding RNA) LCM - lézer mikrodisszekció (Laser Captured Microdissection) MBD1 - metil-CpG-kötő domain fehérje 1 (methyl CpG-binding domain protein 1) MeDIP - metilált DNS immunprecipitáció MeCP2 - metil-CpG-kötő fehérje (methyl CpG binding protein 2) MgCl - magnézium-klorid 2 miRNS - mikroRNS MMP3 - mátrix metallopeptidáz 3 gén MMR - DNS hibajavító rendszer (mismatch repair) MS-HRM - metiláció-specifikus olvadáspont elemzés (MS-High Resolution Melting) MSI - mikroszatellita instabilitás 4 MSP - metiláció specifikus polimeráz láncreakció MSS – mikroszatellita stabilitás NAT - tumor melletti ép szövet (normal tissue adjacent to tumor) NaOH - nátrium-hidroxid NBT - 4-nitro-blue tetrazolium OCT - fagyasztott beágyazó anyag (Optimum Cutting Temperature) p21WAF1 - ciklin-függő kináz inhibitor 1 PAM - Prediction Analysis for Microarrays statisztikai elemző módszer PCNA - proliferating cell nuclear antigen PBS - foszfát puffer (Phosphate Buffer Saline) PCR - polimeráz láncreakció (Polimerase Chain Reaction) PPi - pirofoszfát RIN - RNS integritási szám (RNA Integrity Number) RN18S1 - 18S riboszomális RNS RNS - ribonukleinsav ROC - Receiver Operating Characteristic görbe rpm – percenkénti fordulatszám (round per minute) RT-PCR - valós idejű polimeráz láncreakció (Real-Time PCR) SAM - Significance Analysis of Microarray statisztikai elemző módszer SAM - S-adenozil-metionin SLC7A5 - SLC 7 géncsalád 5. tagja (Solute carrier family 7, member 5) Tm - olvadáspont (melting temperature) TMA - szöveti microarray módszer (Tissue Microarray) TNM - daganat stádium beosztás UC - colitis ulcerosa 5 2 BEVEZETÉS 2.1 A vastagbél szövettani szerkezete A vastagbél feladata a víz és ásványi sók felszívása a bélcsatornából és az emészthetetlen salakanyag külvilágra juttatása. A humán vastagbél hossza megközelítőleg 1,5 m, a bélcsatorna átmérője átlagosan 6-8 cm. A vastagbél vakbélre (coecum), felszálló (colon ascendens), haránt (colon transversum) és leszálló (colon descendens) vastagbélre, szigma-bélre (colon sigmideum) és végbélre (rectum) osztható [1]. A vastagbélfal három szövettani rétegre különíthető el, ezek a bél lumene felől haladva: 1. tunica mucosa (nyálkahártya), amely tovább bontható a lamina epithelialis mucosa (hámréteg), lamina propria mucosae (kötőszövetes réteg) és a lamina muscularis mucosae (mirigyekhez tartozó izomszövet) rétegekre, 2. tunica submucosa (mucosa alatti kötőszövetes réteg) és a 3. tunica muscularis (a bélcső körkörös és hosszanti izomrétege) [1]. Az egészséges vastagbélre jellemző, hogy nyálkahártya hámrétege kesztyűujj-szerűen a bél falába, a lamina propria mucosae rétegbe tűrődik, az így létrejövő mélyedést Lieberkühn-kriptáknak nevezzük. A bél kötőszövetes rétege laza rostos kötőszövet, amelyet a kripták körül fibroblaszt/miofibroblaszt sejtek, továbbá immunsejtek (granulociták, makrofágok, B- és T- limfociták) alkotnak. A bél hámrétegét a kriptákon belül bazálisan elhelyezkedő osztódó őssejtek alakítják ki, amelyek differenciálódásukkal párhuzamosan a kripták lumináris felszíne felé vándorolnak, ahol érett abszorpciós hengerhámsejtekké és nyáktermelő kehelysejtekké differenciálódnak, majd átlagosan 5-6 nap múlva leválnak. A sejtosztódás és a migráció egészséges állapotban dinamikus egyensúlyban van a nyálkahártya felületéről leváló és elhaló sejtek mennyiségével. Azonban ha ez az egyensúly a sejtosztódás felé eltolódik, úgy lokális sejtszaporulatok, kitüremkedések, más néven polipok képződnek. Az így kialakult polipok a daganatképződés kiindulási állapotai lehetnek [2]. 6 1. ábra: A vastagbél szövettani szerkezete 2.2 Vastagbéldaganatok (CRC) 2.2.1 A vastagbéldaganatok epidemiológiája Magyarország világviszonylatban vezető az újonnan felfedezett daganatos megbetegedések és a daganatos halálozás számát tekintve. Európában a daganatos megbetegedések számát tekintve a magyar férfiak az első, a magyar nők a második helyen állnak. [3, 4]. Egy 2012-ben készült felmérés szerint a gasztrointesztinális daganatok előfordulása Európában eltérő területi megoszlást mutat, például a vastagbéldaganat gyakorisága a balkáni országokban viszonylag alacsony (pl. Albániában 100.000 főre vetítve 13 férfi és 11 nő), míg a közép európai országokban, hazánkkal az élen relatív magas előfordulási arány tapasztalható (Magyarországon 100.000 főre vetítve 87 férfi és 45 nő) (2. ábra). A magyar populációban, férfiakban és nőkben egyaránt a tüdőrák után a vastagbéldaganat a leggyakoribb daganatos megbetegedés [3]. Hazánkban az újonnan felismert vastagbéldaganatok száma és a mortalitás egyaránt növekvő tendenciát mutat. 2001-ben a magyar lakosság körében 7600 vastagbéldaganatos esetet diagnosztizáltak és 4910 haláleset történt, 2010- ben már az újonnan diagnosztizált CRC-k száma 9000 nőtt és 5000 halálesetet regisztráltak [5, 6]. 7 2. ábra: A vastagbéldaganatok incidenciája (A) és mortalitása (B) a 2012. évi európai felmérés adatai alapján. Az ábra Ferlay és munkatársai alapján, módosítva készült [3]. 2.2.2 A vastagbéldaganatok kialakulása A vastagbéldaganatok kialakulása az egészséges vastagbélhámban végbemenő, folyamatosan felhalmozódó molekuláris változások indukálta folyamat, amely intenzív kutatás tárgya. A klasszikus, Fearon és Vogelstein által 1990-ben leírt modell szerint az ép vastagbélhámból kiindulva mutációk és egyéb molekuláris változások következtében korai, majd késői adenoma rákmegelőző állapotokon át a daganat végül adenokarcinomává alakul [7] (3. ábra). 3. ábra: Vogelstein modell. Az ábra Mudassar és munkatársai alapján, módosítva készült [8] 8 Az eredeti modell számos további tanulmánynak adott alapot, és időközben a Vogelstein-modellről alkotott elképzelés is formálódott. Az egyik módosítás, hogy a vastagbél adenokarcinoma nem csak a tubuláris és a tubulovillózus polipokból, hanem egyéb rákmegelőző állapotokból (pl. szesszilis fogazott polipokból) is kifejlődhet [9]. A vastagbélhám normális homeosztázisát és a megújuló hám sejtosztódási folyamatait különböző genetikai és az epigenetikai folyamatok szigorúan kontrollált folyamata tartja fent. A szabályozási folyamatok megváltozása ennek értelmében jelentős változást tud előidézni, amely a kontrollálatlan sejtosztódás és a sejthalál zavarai miatt kóros sejtszaporulatot eredményez. A vastagbéldaganat kialakulását különböző molekuláris változások okozhatják, ezek alapján különböző tumorképződés felé vezető genetikai és epigenetikai instabilitással rendelkező állapotokat különböztetünk meg: előbbi kategóriában a kromoszóma instabilitást (CIN) és a mikroszatellita instabilitást (MSI), utóbbiban a DNS metilációs szabályozó rendszer hibáit. 2.2.2.1 Genetikai instabilitás 2.2.2.1.1 Kromoszóma instabilitás (CIN) A kromoszóma instabil daganattípusokra jellemző, hogy sejtjei a normálistól eltérő kromoszómakészlettel rendelkeznek (aneuploidia), a tumoros sejtek gyakran megsokszorozódott kromoszóma szerelvényt hordoznak (poliploidia). A megszűnő vagy többszörösen jelenlévő kromoszómaszakaszok genomi instabilitást eredményeznek, bizonyos gének alul- illetve felülregulálódását okozzák. A tumorszuppresszor gének közül az APC, a p53 és a SMAD4 gének elvesztését is gyakran ez a folyamat okozza [10]. Az APC gén mutációja vastagbéldaganatokban a leggyakrabban kimutatható mutáció. Az APC fehérje egészséges sejtekben a β-katenin és a GSK-3β fehérjékkel képez komplexet, amely a β-katenin degradációjához vezet. Az APC fehérje hiányával a β-katenin fehérje negatív regulációja megszűnik, a sejtosztódást szabályozó Wnt útvonal kontrollálatlanul működhet. Ezáltal a β-katenin fehérje mennyisége megnő, majd a sejtmagba transzlokálódik és olyan gének transzkripcióját indukálja, amelyek az angiogenezist (pl.VEGF) és a sejtproliferációt (pl. ciklin-D) serkentik [11]. A gén csírasejtes mutációja a familiáris adenomatózus polipózus (FAP) szindrómát okozza, az érintett betegeknél életük során több száz polip megjelenése jellemző [12]. A p53 apoptózisban szerepet játszó gén leggyakrabban egy 9