Állatorvostudományi Egyetem Állatorvostudományi Doktori Iskola A Schistosoma turkestanicum Skrjabin, 1913 diagnosztizálása vadakban és hazai elterjedtségének vizsgálata PhD értekezés Dr. Juhász Alexandra 2018 Témavezető és témabizottsági tagok: ..................................... Dr. Majoros Gábor Állatorvostudományi Egyetem, Parazitológiai és Állattani Tanszék témavezető Dr. Földvári Gábor Állatorvostudományi Egyetem, Parazitológiai és Állattani Tanszék témabizottság tagja Dr. Székely Csaba Magyar Tudományos Akadémia Állatorvos-tudományi Kutatóintézet Témabizottság tagja Készült 8 példányban. Ez a n. …. sz. példány. …………………………………. dr. Juhász Alexandra 2 Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék 3 Az alkalmazott rövidítések és feloldásuk 5 1. ÖSSZEFOGLALÁS 6 2. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK 9 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 11 3.1. A Schistosoma turkestanicum vérmétely 11 3.1.1. A parazita felfedezése és előfordulása 11 3.1.2. Rendszertani helyének és rokonsági viszonyainak vizsgálata 13 3.1.3. A parazita morfológiája 16 3.1.4. A parazita életciklusa és gazdái 20 3.1.4.1. A S. turkestanicum fejlődésmenete 20 3.1.4.2. A S. turkestanicum köztigazdái 22 3.1.4.3. A S. turkestanicum végleges gazdái 28 3.2. A S. turkestanicum okozta fertőzés jellemzői 33 3.2.1. Klinikai tünetek 33 3.2.2. Kóros elváltozások 35 3.2.3. Szerológiai vizsgálattal kimutatható változások 36 3.2.4. Gazdasági kártétele 37 3.3. A S. turkestanicum fertőzés diagnosztikája 37 3.3.1. Morfológiai vizsgálatok 37 3.3.2. Kórbonctani vizsgálatok 38 3.3.3. Immunológiai módszerek és molekuláris módszerek 39 3.4. A schistosomosis elleni védekezés, megelőzés lehetőségei 39 3.4.1. Általános védekezési intézkedések 39 3.4.2. Gyógyszeres védekezés 40 3.4.3. Köztigazda csigák elleni küzdelem 42 4. ANYAG ÉS MÓDSZER 46 4.1. A lőtt vadak vizsgálata 46 4.1.1. A parazita hazai előfordulásának helyszíne és a vizsgált területek 46 4.1.2. A máj minták gyűjtése 48 4.1.2.1. A paraziták és petéik kimutatása a májból 50 4.1.2.2. Májdarabokból kigyűjtött paraziták azonosítása 52 4.1.2.3. Molekuláris biológiai vizsgálatok 53 4.2. A bélsár vizsgálata 56 4.2.1. A béltartalom és a hullaték gyűjtése 56 4.2.2. Petekimutatás a béltartalomból és a hullatékból 58 4.3. A köztigazda csigák vizsgálata 59 4.3.1. Az élőhelyen talált csigafajok vizsgálata 59 4.3.2. Az élő Radix példányok vizsgálata 60 4.3.2.1. A R. auricularia csigák akváriumi nevelése 61 4.3.2.2. A R. auricularia magyarországi elterjedésének vizsgálata 61 4.4. A cerkáriák vizsgálata 64 3 4.4.1. A cerkáriák csapdázása attraktáns anyagokkal 64 4.4.1.1. Csapdázás vontatott csapdával 64 4.4.1.2. Csapdázás vízben álló csapdával 65 4.4.1.3. Csapdázás vízben sodródó csapdákkal 65 4.4.2. A cerkáriák gyűjtése szűréssel 66 4.4.2.1. A víz szűrése kézi sziták segítségével 66 4.4.2.2. A víz szűrése vontatott szűrőeszköz segítségével 66 4.4.3. A cerkáriák fertőzőképességének vizsgálata 67 5. EREDMÉNYEK 69 5.1. A S. turkestanicum a májban 69 5.2. A S. turkestanicum peték kimutatása a májból 71 5.3. A petekimutatás a gyűjtött hullaték mintákból 72 5.4. A S. turkestanicum köztigazdájának elkülönítése a hozzá hasonló fajoktól 75 5.5. A magyarországi R. auricularia populációk eredete 81 5.6. A R. auricularia magyarországi elterjedése 83 5.7. S. turkestanicum cerkáriáinak viselkedése 86 5.8. A S. turkestanicum cerkáriák kimutatása vízből 88 5.9. A cerkáriák bőrbe hatoló képességének vizsgálata egéren 90 5.10. A cerkáriák bőrbe hatoló képességének vizsgálata emberben 90 5.11. A cerkáriák fertőzőképességének vizsgálata egéren 91 6. MEGBESZÉLÉS 94 6.1. A S. turkestanicum kimutatása és elterjedése a végleges gazdában 94 6.2. A R. auricularia magyarországi státusza és elkülönítése 98 6.3. S. turkestanicum cerkáriáinak kimutatása vízből 101 6.4. A S. turkestanicum dermatitiszt előidéző képességének vizsgálata 101 7. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 103 8. IRODALOMJEGYZÉK 104 9. A KUTATÁSI EREDMÉNYEK KÖZLÉSEI 117 9.1. A TÉMÁBAN MEGJELENT TUDOMÁNYOS PUBLIKÁCIÓK 117 9.2. A TÉMÁBAN TARTOTT ELŐADÁSOK 117 9.3. EGYÉB KÖZLEMÉNYEK REFERÁLT FOLYÓIRATOKBAN 118 10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 119 4 Az alkalmazott rövidítések és feloldásuk ATP adenozin-trifoszfát BALB/c egy beltenyésztett laboratóriumi fehéregér-törzs neve cox citokróm-oxidáz enzim DEET N, N-Dietil-meta-toluamid DNS dezoxiribonukleinsav dNTP nukleotidok ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) enzimhez kötött immunoszorbens teszt IgA, IgE, IgG, IgM immunglobulin-A, E, G, M ITS (internal transcribed spacer) ITS régió a riboszóma alegységeit kódoló gének közé ékelődő, nem funkcionáló szakasz mtDNS mitokondriális dezoxiribonukleinsav NÉBIH Nemzeti Élelmiszerbiztonsági Hivatal PCR (polymerase chain reaction) polimeráz láncreakció PPG grammonkénti peteszám SEM scanning (pásztázó) elektronmikroszkóp Th1, Th2 1-es és 2-es típusú segítő T-limfocita TI terápiás index UV ultraibolya WHO World Health Organisation Az alkalmazott mértékegység-rövidítések: cm3 (köbcentiméter), l (liter), μl (mikroliter), ml (milliliter), μm (mikrométer), g (gramm) 5 1. ÖSSZEFOGLALÁS Noha Európában többször is kimutattak emberi és állati vérmételyeket, az emlős vérmételyeknek a kontinensen való őshonosságát korábban egy faj esetében sem lehetett bizonyítani. A gemenci szarvasokban először 2002-ben megtalált Schistosoma turkestanicum vérmétely a későbbi vizsgálatok során őshonosnak bizonyult, így jelenlegi tudásunk szerint ez a faj Magyarország és egyben Európa egyetlen, nem behurcolt emlős vérmételye. Bár a S. turkestanicum Ázsia keleti feléből származik, ahol többféle vadon élő és háziasított állatban is él, a természetes életterükben élő gímszarvasban egyedül csak hazánkban található. Közeli rokona az emberi schistosomáknak, s ezért nem meglepő, hogy az ember bőrébe hatol a vízben úszó lárvája, de maga a métely nem tud kifejlődni benne. Ez a tulajdonsága teszi érdekessé a tudományos kutatás számára, mivel feltételezhető, hogy jobb megismerése által a trópusi schistosomák viselkedését is jobban megérthetjük, és hatékonyabban tudunk védekezni azok ellen. A S. turkestanicum vizsgálatának Magyarországon ezért nem elsősorban állategészségügyi jelentősége van, hanem mint zoonózist okozó ágens és emberi fertőzést okozó paraziták biztonságosan tanulmányozható modelljeként érdemes a figyelemre. A S. turkestanicum különleges, magyarországi jelenléte összetett problémarendszer, melynek sikeres vizsgálata csak úgy lehetséges, ha több oldalról közelítjük meg azt. A jelen értekezésben ismertetett munka során ökológiai, állattani, parazitológiai, orvosi és állatorvosi oldaláról is igyekeztem megvizsgálni a kérdéskört. A gemenci erdők területén a vérmétely természetes előfordulását terepi vizsgálatokkal kutattunk, ezen kívül igyekeztünk az ország más, potenciálisan fertőzött területeit is felkeresni. A terepen gyűjtött mintákat hazai és külföldi laboratóriumokban dolgoztuk fel. A szarvasok májából gyűjtöttük az adult vérmételyeket, majd a peték detektálását is megkíséreltük a szervből. Megállapítottuk, hogy a gazdaállatok májának néhány dekagrammnyi mennyiségéből is meg lehet állapítani a fertőzöttséget, ha a szervdarab a májkapu környékéről származik. Ez azért is fontos, mert a gyakorlatban általában nincs lehetőség arra, hogy a vérmételyek által benépesített egyéb szervek (pl.: bélfal, mesenterium) vizsgálatra kerüljenek. A S. turkestanicum mételyeket a Fascioloides magna vagy Dicrocoelium dendriticum mételyekkel való egyidejű fertőzés esetén is meg lehet 6 találni. A vérmétely petéit csak olyan májdarabokból lehetett kimutatni, amelyekben kifejlett mételyek is voltak. A vadak zsigereinek országos szintű vizsgálata megoldhatatlannak bizonyult, így a métely hazai elterjedése csak úgy volt vizsgálható, hogy, ha a vadak elhullatott bélsarából is igyekeztünk kimutatni a féreg petéit. A hullaték mintákból, a vadászati idénytől függetlenül, bármely időszakban tudtuk vizsgálni a métely előfordulását. A hagyományos parazitológiai eljárások és a molekuláris biológiai módszerek kombinálásával a bélsárból ki tudtuk mutatni a petéket. Többféle koprológiai vizsgálati módszert próbáltunk ki a peték vagy a belőlük kikelő lárvák kimutatására, illetve a mintákban való koncentrálására, azért, hogy a DNS kimutatási metodikák egyáltalán használhatóak legyenek a bélsár vizsgálatára. Festési eljárást is kidolgoztunk, aminek a segítségével a vérmétely-petéket egyszerűbben el tudjuk különíteni a bélsár egyéb alkotóelemeitől a mikroszkópos vizsgálat során. Ennek jelenősége abban van, hogy a vérmétely-peték nagyon kis mennyiségben találhatók az ürülékben, s míg ez a probléma az emberi vérmételykór diagnosztizálása esetén ismételt vizsgálatokkal áthidalható, a vadak esetében erre semmilyen esély sincs. A Gemenc melletti erdőkben élő szarvasok májának és hullatékának vizsgálatával kísérletet tettünk az endemikusan fertőzött terület határainak meghatározására. Eredményeink szerint nincs nyoma annak, hogy a S. turkestanicum fertőzöttség a Duna árterén túli területekre is kiterjedne. A métely potenciális hazai elterjedése a köztigazda csigák elterjedésétől függ, ezért megvizsgáltuk, hogy a természetes köztigazdája, a Radix auricularia vízicsiga hol fordul elő. Múzeumi és magángyűjteményekben őrzött példányok revíziója után, elsőként készítettünk el a csiga hazai előfordulási térképét. Felkerestünk néhány olyan helyet, ahol a szarvas állomány sűrű és a köztigazda egyaránt megtalálható. Ott hullatékokat gyűjtöttünk és megvizsgáltuk a S. turkestanicum peték jelenlétére. Mivel a R. auricularia csigák sok esetben nehezen fedezhetők fel az élőhelyeiken, megpróbálkoztunk a S. turkestanicum vízben úszó cerkáriájának közvetlen kimutatásával. Különböző eszközöket dolgoztunk ki a cerkáriák gyűjtésére. A módszereket fertőzött, vagy potenciálisan fertőzöttnek vélt területeken teszteltük. Megállapítottuk, hogy a víz szitaszöveten keresztül való szűrésével a benne úszó cerkáriák megtalálhatók. Első alkalommal foglalkoztunk érdemben a Magyarországon ismerté vált, cerkária dermatitisz fertőzésekkel. Egyes állati vérmételyekről régóta ismert volt, hogy abortív fertőzést alakíthatnak ki az emberben. A fürdőzési viszketésnek nevezett bántalmat is állati vérmételyek lárvái okozzák. E bántalom magyarországi előfordulásának bizonyítása eddig nem történt meg, pedig rendszeresen előfordultak mételylárva fertőzésre utaló klinikai esetek. 7 Laboratóriumban fertőzött egerek szövettani és kórtani vizsgálata bizonyította, hogy a gemenci S. turkestanicum lárvája is képes nem adekvát gazdákba behatolni, s ez megerősítette azt a gyanúnkat, hogy ez a métely, felelős egy bizonyos típusú emberi dermatitisz kialakulásáért a gemenci ártéren. Végül egy akcidentális illetve egy szándékos S. turkestanicum fertőzésre adott humán immunválasz vizsgálata lehetőséget adott a kórokozóval való kontamináció kimutatására. Ezzel igazoltuk a métely lárvájának humán szervezetbe való behatolási képességét is. A megfigyelések és az elvégzett vizsgálatok tükrében bizonyítottnak látjuk, hogy a gemenci ártéren gyakori, vízzel való kontaktust követő emberi dermatitiszek okozója a szarvasokban élő S. turkestanicum. 8 2. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK Az általunk végzendő kutatásnak egy olyan különleges élősködő az alanya, amelyikről indokoltan feltételezhető, hogy évmilliók óta észrevétlenül él Magyarországon, miközben Ázsiában a mezőgazdasági munkát végző emberek súlyos bántalmát okozza. Az 1930-as években, Közép-Ázsiában felfedezett Schistosoma turkestanicum (Skrjabin, 1913), elsősorban a tülkös szarvú kérődzők véredényrendszerében élő endoparazita, amelynek csigában fejlődő lárvája az ember bőrébe behatolva bőrgyulladást okoz (Sahba és Malek, 1979; Skrjabin, 1951). A kutatások kiderítették, hogy ez a vérmétely-faj egy izolált populáció formájában a gemenci ártéren élő gímszarvasok fertőzöttségét okozza, és legalább a jégkorszak óta ott él (Lawton és Majoros, 2013; Majoros et al., 2010). Csak ezen az élőhelyen található gímszarvasban, noha szórványos előfordulását Ázsiában sok más kérődzőben és egyéb állatfajban is megállapították. Az emberi vérmételykór (bilharziosis vagy schistosomosis) a malária után a legtöbb áldozatot követelő parazitás betegség a világon (Bush et al., 2001). Legalább 200 millió emberre becsülik a fertőzöttek számát, amely jelenleg nemhogy csökkenne, de egyre emelkedik, például az emberek mozgásterének kiszélesedése következtében. Az ivóvízzel vagy fürdővízzel bárki fertőződhet a meleg égövi országokban, amit a rendszeres gyógykezelés sem tud visszaszorítani, mivel a patkányoknak több faja, ember hiányában is fenntartja a vérmételyt akár néptelen, akár sűrűn népesült területeken is. Európában és Észak-Amerikában csak azért nem képződik állandó fertőzést fenntartó góc, mivel az emberi vérmételyek köztigazda csigái itt nem élnek. A globális felmelegedés következtében terjedő alacsonyrendű szervezetektől tartva azonban figyelem irányult a vérmétely terjesztő csigák eredeti élőhelyüktől távol történő megtelepedésének lehetőségére is. E félelem nem alaptalan, hiszen éppen kutatócsoportunknak volt alkalma először felismerni a dél-amerikai vérmétely- kórt terjesztő Biomphalaria tenagophila első, mérsékelt övi (európai) előfordulását (Majoros et al., 2008). Az ellene való védekezés csekély sikerének következtében a schistosomosist az utóbbi években világszerte intenzíven kutatják. Az emberi és állati fertőzés dokumentált eseteinek epidemiológiai elemzésének, valamint a fertőződési kockázatot befolyásoló tényezők vizsgálatának egyaránt széles az irodalma. A S. turkestanicum részletesebb hazai vizsgálata a fentiek ismeretében indokolt, mert a faj behatóbb megismerésének elsősorban a nemzetközi kutatásokhoz kapcsolódó jelentősége van. A hazai szarvas-állományt amúgy nem veszélyeztető élősködő az emberi schistosomosis elleni küzdelem egyik fontos modellje lehet. A métely-cerkáriák szerológiai 9 áthangolódást, esetenként bőrgyulladást előidéző szerepét is jobban megismerhetjük általa, és többet tudhatunk meg a Duna mentén előforduló „fürdőzési viszketést” (swimmer’s itch) előidéző ágensek valódi természetéről. A métely laboratóriumi körülmények közötti fenntartása nagy előrelépés lenne a schistosomosis veszélytelen körülmények közötti tanulmányozásához. A tervezett PhD munka célja, hogy minél több adatot tudjunk meg a S. turkestanicum természetes előfordulási körülményeiről, és megvalósítsuk a laboratóriumi körülmények között való fenntartását. A 3 éven keresztül tartó felmérő vizsgálat során a célkitűzéseink az alábbiak voltak: 1. Kimutatható-e a S. turkestanicum petéje vagy az abból kikelő lárva a szarvasok hullatékából? Ennek jelentősége abban van, hogy akkor is vizsgálható lenne valamely terület fertőzöttsége, ha a vad szerveiből nem adódik mód a mételyek kimutatására. 2. A szarvasokkal benépesült területeken hol fordul elő a Radix auricularia csiga Magyarországon? Az ilyen területek felismerése elősegítené a mételynek olyan helyeken való megtalálását, ahol még nem fedezték fel azt. 3. A gemenci Duna-ártéren kívül van-e más hazai élőhely, ahol a S. turkestanicum előfordul? A S. turkestanicum ázsiai élőhelyeitől ilyen távol eső élőhely óhatatlanul felveti annak a lehetőségét, hogy a métely több stációban érte el Magyarországot, ezért nemcsak egy helyen élhet. 4. Fenntartható-e ez a métely laboratóriumi körülmények között? A féreg részletesebb tanulmányozásához elengedhetetlen laboratóriumi vizsgálathoz kívánatos volna, ha nem csak kérődzőben, hanem rágcsálóban is fenntartható volna. Nehézséget jelent, hogy európai köztigazdáját, a Radix auricularia csigát eddig még nem tenyésztették laboratóriumi viszonyok között. 5. Okoz-e szerológiai áthangolódást és bármilyen tünetet az emberben a métely cerkáriáival történő kontamináció, ha azok behatolnak a bőrbe? Ennek jelentősége abban van, hogy a S. turkestanicum okozta reakciókat el kell különíteni az emberi schistosomák okozta tünetektől és immunreakcióktól. 10