RENORBIO Universidade Federal Rural de Pernambuco Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia DESENVOLVIMENTO DE QUEIJO PETIT-SUISSE ADICIONADO DE CULTURA COM POTENCIAL PROBIÓTICO A PARTIR DO LEITE DESNATADO DE BÚFALAS Josué de Souza Oliveira RECIFE – PE 2018 RENORBIO Universidade Federal Rural de Pernambuco Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia DESENVOLVIMENTO DE QUEIJO PETIT-SUISSE ADICIONADO DE CULTURA COM POTENCIAL PROBIÓTICO A PARTIR DO LEITE DESNATADO DE BÚFALAS Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia – RENORBIO como requisito para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Ponto Focal: Universidade Federal Rural de Pernambuco. Área de concentração: Biotecnologia Industrial. Linha de Pesquisa: Tecnologia de Alimentos Josué de Souza Oliveira Orientadora: Ana Lucia Figueiredo Porto Co-Orientadora: Ana Paula Trovatti Uetanabaro Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Sistema Integrado de Bibliotecas da UFRPE Biblioteca Central, Recife-PE, Brasil O48d Oliveira, Josué de Souza. Desenvolvimento de queijo Petit-Suisse adicionado de cultura com potencial probiótico a partir do leite desnatado de búfalas / Josué de Souza Oliveira. – Recife, 2018. 106 f. : il. Orientadora: Ana Lucia Figueiredo Porto. Coorientadora: Ana Paula Trovatti Uetanabaro. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia – RENORBIO, Recife, BR-PE, 2018. Ponto focal em Pernambuco – Universidade Federal Rural de Pernambuco. Inclui referências e anexos. 1. Leite bubalino 2. L. Fermentum 3.L. plantarum I. Porto, Ana Lucia Figueiredo, orient. II. Uetanabaro, Ana Paula Trovatti III. Título CDD 620.8 À minha esposa Luciana e minha filha Luiza que estiveram ao meu lado me motivando e apoiando na realização deste trabalho. A toda minha família que sempre apostou e acreditou no meu crescimento acadêmico, em especial minha mãe por ter sido a referencia de caráter e humanidade. Dedico AGRADECIMENTOS Ao Grande Arquiteto do Universo por me conceder saúde, serenidade, sabedoria, paz e força para superar as dificuldades. A toda minha família, minha esposa Luciana e minha filha Luiza, minha mãe Maria da Paz e meus irmãos por aceditar em meu potencial e sempre ter me apoiado durante toda a minha vida acadêmica. A todos (as) os (as) prefessores (as) que colaboraram com a minha vida acadêmica desde ao ensino fundamental ao doutorado. Á querida professora Ana Lucia Figueredo Porto, minha orientadora, que topou este desafio sem ter previamente me conhecido e esteve ao meu lado, me incentivando com otimismo durante este trabalho. Á minha querida co-orientadora e amiga, professora Ana Paula Trovatti Uetanabaro, grande incentivadora deste trabalho, pelo acompanhamento irrestrito e apoio para execução deste trabalho. Ao professor Jacques Robert Nicoli e a equipe Laboratório de Ecologia e Fisiologia de Micro-organismos da UFMG pela grande contribuição e apoio para a execução deste estudo. Ao Instituto Federal de educação, Ciência e Tecnologia Baiano – Campus Uruçuca, que financiou parte do experimento e me possibilitou o uso das instalações do Centro e Tecnologia de Alimentos para realização de parte do experimento. À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) pelo apoio de material para a realização deste experimento. Aos colegas e alunos do NUTEC/CTA, em especial a professora e amiga Cristiane Pereira de Lima que também contribuiu grandemente nesta trajetória. À Fazenda Diamantina (Ipiaú, Bahia, Brasil) pelo fornecimento do leite de búfalas. Enfim, a todos (as) os amigos (as) e colegas que torceram e colaboraram para concretização deste sonho. Muitíssimo Obrigado!!! “Nada no mundo se compara à persistência. Nem o talento; não há nada mais comum do que homens malsucedidos e com talento. Nem a genialidade; a existência de gênios não recompensados é quase um provérbio. Nem a educação; o mundo está cheio de negligenciados educados. A persistência e determinação são, por si sós, onipotentes. O slogan "não desista" já salvou e sempre salvará os problemas da raça humana”. Calvin Coolidge RESUMO A utilização do leite de búfalas e de micro-organismos obtidos da fermentação do cacau para a produção de alimentos probióticos é inédita. O presente trabalho objetivou desenvolver um queijo tipo petit-suisse utilizando como base o leite de búfalas desnatado e lactobacilos isolados da fermentação do cacau. Para avaliar os efeitos da utilização de edulcorantes sobre a qualidade do queijo petit-suisse, foram elaboradas quatro formulações com diferentes concentrações de edulcorantes, sendo avaliadas as características físico- químicas, a composição centesimal, a qualidade microbiológica e sensorial. Os efeitos da incubação, do uso de edulcorantes e lactobacilos sobre a qualidade do petit-suisse produzido por coagulação enzimática foram avaliados a partir do preparo de seis tratamentos, variando o tempo de incubação (0 e 12 horas), a concentração de edulcorantes (0 e 50%) e a adição de lactobacilos (sem lactobacilos, com o Lactobacillus fermentum TcUESC01, com o Lactobacillus plantarum TcUESC02 e simultaneamente esses dois lactobacilos), através da avaliação das características físico-químicas, da viabilidade dos lactobacilos e dos aspectos sensoriais durante a estocagem. A avaliação dos efeitos da utilização dos lactobacilos na qualidade do queijo petit-suisse foi obtida a partir da preparação quatro formulações: sem adição de lactobacilos (controle), adicionados de L. fermentum TcUESC01 (Lferm), L. plantarum TcUESC02 (Lplan) e simultaneamente esses dois lactobacilos (Lplan+Lferm), avaliando as características físico-químicas, a viabilidade dos lactobacilos, a composição química, o perfil de textura instrumental, a qualidade microbiológica e sensorial. O potencial probiótico dos lactobacilos foi avaliado utilizando ensaios in vitro (antagonismo) e in vivo (mortalidade, translocação, morfometria, histopatologia, determinação de IgA e expressão de citocinas) realizado em camundongos desafiados com a Salmonella Typhimurium. As formulações com 50%, 75% e 100% de edulcorantes foram classificadas como “light” e a com 100% de edulcorantes, como “diet”. Na avaliação sensorial, os tratamentos com 25% e 50% foram os mais aceitos nos atributos sabor e impressão global, também mais preferidos, apresentando intenção de compra de 76% dos provadores. O queijo produzido com adição dos dois lactobacilos simultaneamente, sem a adição de edulcorantes e sem incubação apresentou o melhor resultado na avaliação sensorial durante o período de 42 dias de estocagem. As amostras de queijo com lactobacilos apresentaram viabilidade superior a 7,00 log UFC/g durante a estocagem. Todas as formulações foram denominadas como “Isentos de gorduras totais” e atenderam os limites preconizados na legislação brasileira na composição química, viabilidade de probióticos e avaliação microbiológica. As formulações Lplan e Lferm se destacaram como promissores para o desenvolvimento de um queijo tipo petit-suisse probiótico com leite de búfala isento de gorduras. O L. fermentum TcUESC01 e L. plantarum TcUESC02 mostraram ser probióticos potenciais com base em melhores resultados obtidos por avaliações in vitro (maior produção de compostos com atividade antimicrobiana), bem como experimentos in vivo (maior sobrevivência após o desafio do enteropatógeno e produção de IgA no íleo, menor translocação hepática e splênica do enteropatógeno, lesões histopatológicas mais baixas no fígado e melhor padrão anti-inflamatório demostrado atravéz da expressão de citocinas). Palavras chave: Leite Bubalino, L. Fermentum, L. plantarum. ABSTRACT The use of milk from buffaloes and microorganisms obtained from the fermentation of cocoa for the production of probiotic foods is still little known. The present work aimed to develop a petit-suisse type cheese using skimmed buffalo milk and lactobacillus isolated from the cocoa fermentation. To evaluate the effects of the use of sweeteners on the quality of petit-suisse cheese, four formulations with different concentrations of sweeteners were elaborated, being evaluated the physical-chemical characteristics, the centesimal composition, the microbiological and sensorial quality. The effects of incubation, the use of sweeteners and lactobacilli on the quality of petit-suisse produced by enzymatic coagulation were evaluated from the preparation of six treatments, varying the incubation time (0 and 12 hours), the concentration of sweeteners (0 and 50%) and the addition of lactobacilli (without lactobacilli, with Lactobacillus fermentum TcUESC01, with Lactobacillus plantarum TcUESC02 and simultaneously with these two lactobacilli), through the evaluation of physico-chemical characteristics, viability of lactobacilli and sensorial aspects during storage. The evaluation of the effects of the use of lactobacilli on the quality of petit suisse cheese was obtained from the preparation of four formulations: without addition of lactobacilli (control), added with L. fermentum TcUESC01 (Lferm), L. plantarum TcUESC02 (Lplan) and simultaneously, these two lactobacilli (Lplan + Lferm), evaluating the physico-chemical characteristics, lactobacilli viability, chemical composition, instrumental texture profile, microbiological and sensorial quality. The probiotic potential of lactobacilli was evaluated using in vitro (antagonistic) and in vivo (mortality, translocation, morphometry, histopathology, IgA determination and cytokine expression) assays performed in mice challenged with Salmonella Typhimurium. The formulations with 50%, 75% and 100% of sweeteners were classified as "light" and with 100% sweeteners, as "diet". In the sensory evaluation, the treatments with 25% and 50% were the most accepted in the flavor and overall impression attributes, also more preferred, with the intention of buying 76% of the tasters. The cheese produced with addition of the two lactobacilli simultaneously, without the addition of sweeteners and without incubation presented the best result in the sensorial evaluation during the period of 42 days of storage. Samples of cheese with lactobacilli showed viability greater than 7.00 log CFU / g during storage. All formulations were designated as "Free of total fats" and met the limits recommended in Brazilian legislation on chemical composition, probiotic viability and microbiological evaluation. The Lplan and Lferm formulations stand out as promising for the development of a probiotic petit-suisse type cheese with fat-free buffalo milk. L. fermentum TcUESC01 and L. plantarum TcUESC02 were potential probiotics based on better results obtained by in vitro evaluations (higher production of compounds with antimicrobial activity), as well as in vivo experiments (greater survival after challenge of enteropathogen and production of IgA in the ileum, lower hepatic and splenic enteropathogen translocation, lower histopathological lesions in the liver and better anti-inflammatory pattern demonstrated by cytokine expression). Key words: Bubalino milk, L. Fermentum, L. plantarum.