PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (MICROBIOLOGIA APLICADA) ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LINHAGEM DE LEVEDURA QUANTO AO CRESCIMENTO E FERMENTAÇÃO UTILIZANDO MEIOS SINTÉTICOS COM PENTOSES E HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR CRISTINA MARTINI Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Microbiologia Aplicada ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LINHAGEM DE LEVEDURA QUANTO AO CRESCIMENTO E FERMENTAÇÃO UTILIZANDO MEIOS SINTÉTICOS COM PENTOSES E HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR CRISTINA MARTINI Orientadora: Profa. Dra. Sâmia Maria Tauk-Tornisielo C o-Orientadora: Profa. Dra. Sandra Regina Ceccato Antonini Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Microbiologia Aplicada. 547.29 Martini, Cristina M386i Isolamento, identificação e caracterização de linhagem de levedura quanto ao crescimento e fermentação utilizando meios sintéticos com pentoses e hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar / Cristina Martini. - Rio Claro, 2014 121 f. : il., figs., gráfs., tabs., fots. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: sâmia maria tauk-tornisielo Coorientador: sandra regina ceccato antonini 1. Fermentação. 2. Meyerozyma guilliermondii. 3. Pentoses. 4. Hidrolisado. Título. (cid:9) Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP Dedico este trabalho Aos meus três amores, meus pais Antonio F. Martini e Ida Maria Ferrazzo Martini e a minha doce e amada irmã Beatriz Martini, por estarem ao meu lado constantemente, com um amor infinito, sem igual, sempre transmitindo energias positivas, e não medindo esforços para a realização desse sonho. À minha Co-orientadora Profa. Dra. Sandra Regina Ceccato Antonini, pelo voto de confiança, apoio e muita compreensão no decorrer desses quatro anos e principalmente por sua fundamental dedicação para o desenvolvimento deste trabalho. AGRADECIMENTOS À Deus pelo dom da vida, por estar sempre presente em meu caminho, o grande autor e consumador da minha fé, me dando forças para vencer as barreiras encontradas e me fazendo acreditar a cada dia que minhas fronteiras estão muito além do que meus olhos possam enxergar. À minha Orientadora Profa. Dra. Sâmia Maria Tauk-Tornisielo, pela orientação e oportunidade de poder compartilhar de seus conhecimentos, pela confiança, dedicação, amizade e carinho durante toda trajetória. Sou muito grata à senhora, por ter depositado toda sua confiança em sua última orientada (que honra!) e na sua ex- orientada, hoje minha Co-orientadora, Profa. Dra. Sandra Regina Ceccato Antonini. Agradeço em especial à minha Co-Orientadora Profa. Dra. Sandra Regina Ceccato Antonini, pela amizade, confiança, paciência, apoio e dedicação, pelos conhecimentos repassados durante todo o desenvolvimento do trabalho, e principalmente pela sua orientação, não apenas no doutorado, mas desde 2006, quando iniciei o mestrado sob sua orientação. Professora, muito obrigada pela oportunidade concedida a mim de fazer parte do seu grupo de trabalho e por proporcionar a concretização deste sonho. Aos meus pais Antonio Francisco Martini (DKV) e Ida Maria Ferrazzo Martini (LELA) por todo amor, carinho e apoio incondicional. Literalmente presentes em todos os momentos do doutorado, acordando de madrugada para me acompanhar em algumas análises, ajudando a anotar resultados, embrulhando placas, esterilizando material, enfim, se propuseram a aprender inúmeras coisas para poder me ajudar sempre com carinho e bom humor, foi muito divertido e engraçado os momentos vividos no laboratório. AMO MUITO VOCÊS!! À minha querida irmã Beatriz Martini, por estar sempre presente em minha vida, me dando força, carinho e sempre vendo o lado bom da vida, me fazendo rir nos momentos difíceis e ajudando a vencer os obstáculos. Muito obrigada de coração por inúmeras vezes ter me ajudado no laboratório. Aos meus avós maternos Carmem e Giovanni Ferrazzo (in memorian), que mesmo distantes, porém presentes em meus pensamentos me fortalecem, com a energia da paz, amor e coragem. Aos meus avós paternos João e Domingas Martini (in memorian), que me protegem, iluminam, transmitem esperança, coragem e amor. A minha tia Neca e a prima Bete, sempre presentes nos momentos importantes, comemorando a formatura de Engenharia Agronômica, assistindo a defesa da Dissertação de Mestrado e acompanhando a trajetória do Doutorado. Às tias “corujas” Neca, Iraídes e Ivanilde e aos primos Bete, Luizinho, Berto, Alexandre, Débora e Sandra, pelo apoio e torcida constante. À minha querida amiga Vania Taís Chieregatto (in memorian), pelos meus melhores momentos de descontração, amizade, bagunça e carinho. Saudades eternas! Aos meus queridos médicos Dr. Dalton José Balloni e Dr. José Eduardo Decico, que por meio dos tratamentos, me proporcionaram uma vida melhor e me ensinaram a conviver e superar as dores da artrite psoriática. Ao Thiago Trevisan, pelo carinho, amizade, apoio, e muita paciência nos momentos finais e tensos. À professora e amiga Profa. Dra. Márcia Maria Rosa Magri, por todas as conversas, conselhos e prestatividade ímpares. À Profa. Dra. Silvana Perissatto Meneghin, pelo apoio, respeito e amizade. À amiga e parceira de todas as horas Carolina Brito Codato, pela paciência, atenção e carinho, que desde o meu mestrado, esteve presente e conseguiu me aguentar nas mais inusitadas situações, sempre me aconselhando e dando força. A sua colaboração neste trabalho, nunca vou esquecer. À AMIGA Afra Vital, pelo apoio, atenção e conselhos. A sua amizade é muito especial. Manifesto a minha gratidão à todos os amigos do Laboratório de Microbiologia Agrícola e Molecular (LAMAM) – UFSCar, que contribuíram de forma direta ou indiretamente para realização deste trabalho, Ângelo (Técnico), Ana Paula, Ana Silvia, Anna Lívia, Ariane, Carol Zica, Gabriele, Gisele Rocha, Guilherme, João (Técnico), Letícia, Michel, Renato Corrêa, Rodolfo, Vanda, Vitória Gattis e Yubis. Em especial à nossa querida e amada Técnica Lúcia Piccolo (Lucinha), sempre atenciosa e solícita em toda minha trajetória. Aos técnicos do Laboratório de Simulação Tecnológica (LAST) - UFSCar, Cidinho e Renato, ao estagiário Rafael, a Zilda e à professora Teca, pela colaboração nas barulhentas horas de separação do bagaço de cana e nos momentos de extração do caldo do hidrolisado. Ao pessoal do Laboratório de Microbiologia Aplicada (LABMAC) - UFSCar, Prof. Dr. Reinaldo Bastos e aos orientados Daniela e Luiz Felipe, pela atenção e por serem tão solícitos. Ao pessoal da EEL – USP, Lorena-SP, Profa. Dra. Inês Conceição Roberto, aos seus orientados Túlio Lima, Rafael Cunha de Assis Castro, em especial ao Bruno Guedes, que não mediu esforços para me ajudar, obrigada pela atenção e por serem tão caprichosos com as amostras do HPLC. Aos professores do curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia Aplicada) – UNESP, que contribuíram para a ampliação dos meus conhecimentos. Ao INCT-Bioetanol FAPESP (2008/5798-6) / CNPq (574002/2008-1) e à Capes, pelo apoio financeiro à pesquisa e concessão de bolsas. “Quero a liberdade de andar pelo mundo E seguir sem destino feito um andarilho E buscar respostas e encontrar o rumo Que me tire ou me leve para o desatino Quero a liberdade de pássaros voando Mas a segurança de um vagão no trilho Quero emoções sublimes aflorando E sensações que só eu poderei sentir Quero a liberdade de amantes insanos E envelhecer sem ver passar os anos Não ter hora para comer nem para dormir Quero ir a praia e me sentar na areia Ouvir o barulho do mar, contar estrelas Jogar os pesos fora e depois sorrir Olhar para o céu e desvendar a incrível teia Do que foi, será e está por vir Quero encontrar, desencontrar minha raiz Quero adormecer em seu ombro quente E acordar brincando de ser feliz.” (Grande Amiga De Infância & Escritora Piracicabana, Profa. Dra. Célia Regina Ferrari Faganello – Universidade Federal Do Sul Da Bahia). RESUMO A procura por novas espécies de leveduras capazes de fermentar pentoses é um dos desafios frente às dificuldades na tecnologia da produção de etanol de segunda geração. Além disso, a utilização de resíduos lignocelulósicos para tal fim requer uma etapa de hidrólise para a despolimerização da fração hemicelulósica. O emprego de ácidos tem sido utilizado frequentemente devido ao baixo custo e alta eficiência. Inibidores, no entanto podem também ser liberados juntamente com os açúcares, ocasionando inibição da atividade fermentativa das leveduras. Neste contexto, este estudo teve por objetivo realizar o isolamento de linhagens de leveduras de fontes naturais (caldo, bagaço e rizosfera de cana-de-açúcar, e palha de milho), a avaliação presuntiva da capacidade de fermentação de pentoses (D- xilose e L-arabinose) e a identificação da linhagem selecionada, a qual foi avaliada quanto à habilidade de crescimento e fermentação de pentoses utilizando meio sintéticos em diferentes condições ambientais assim como hidrolisados ácidos de bagaço de cana-de-açúcar. Dentre 350 isolados, 39 apresentaram atividade fermentativa de arabinose (56,4%) ou xilose (38,5%) ou ambas (5,1%). Uma das linhagens que apresentou fermentação tanto de arabinose quanto de xilose (código 311), isolada de caldo de cana-de-açúcar, foi identificada por meio da amplificação da região D1/D2 do gene 26S e da região ITS do DNA ribossomal como sendo da espécie Meyerozyma guilliermondii. Esta linhagem foi avaliada quanto à influência da fonte de carbono (glicose, xilose ou arabinose), pH (3,5; 4,5; 5,5) e temperatura (30 oC, 35 oC, 40 oC) sobre o crescimento, e à influência do pH (4,5; 5,5) e temperatura (30 oC, 35 oC) sobre a fermentação de xilose em concentrações variando de 40 g/L a 100 g/L em meios sintéticos. A variação nos valores de pH e temperatura não resultou em diferenças na velocidade específica de crescimento de M. guilliermondii quando crescida em 20 g/L de arabinose, xilose ou glicose. Nos ensaios fermentativos, o aumento na concentração de glicose não contribuiu para o aumento na produção de álcool. Um máximo de 1,5 g/L de álcool foi produzido a partir de 40 g/L de xilose a 30 oC, pH 5,5, em 96 horas de fermentação. Os resultados também revelaram que a linhagem de levedura utilizada foi capaz de crescer em temperaturas de 35 oC – 40 oC e pH de 3,5 – 4,5, o que a torna apropriada para aplicação industrial. O hidrolisado de bagaço de cana foi caracterizado quanto aos açúcares e inibidores presentes, analisando-se as amostras logo após a hidrólise ácida, após a concentração por evaporação para atingir 40 g/L de açúcares redutores, e após a detoxificação do hidrolisado concentrado. Os resultados mostraram que a xilose foi o açúcar liberado em maior