The role of inter- island gene-flow during colonization and speciation processes on D archipelagos: analysis of the Micromeria Benth. (Lamiaceae) on the Canary Islands Manuel António Cardoso Curto Biodiversidade, genética e evolução Departamento de Biologia 2017 Orientador Harald Meimberg, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna Nota prévia Na elaboração desta dissertação, e nos termos do número 2 do Artigo 4º do Regulamento Geral dos Terceiros Ciclos de Estudos da Universidade do Porto e do Artigo 31º do D.L. 74/2006, de 24 de Março, com a nova redação introduzida pelo D.L. 230/2009, de 14 de Setembro, foi efetuado o aproveitamento total de um conjunto coerente de trabalhos de investigação já publicados ou submetidos para publicação em revistas internacionais indexadas e com arbitragem científica, os quais integram alguns dos capítulos da presente tese. Tendo em conta que os referidos trabalhos foram realizados com a colaboração de outros autores, o candidato esclarece que, em todos eles, participou ativamente na sua conceção, na obtenção, análise e discussão de resultados, bem como na elaboração da sua forma publicada. O candidato também gostaria de acrescentar que estes artigos só foram incluídos nesta dissertação. Os artigos aqui apresentados que foram publicados estão representados de forma integral com alterações de formatação. Este trabalho foi apoiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) através da atribuição da bolsa de doutoramento (SFRH/BD/79010/2011). Acknowledgments First I would like to thank my advisor Harald Meimberg for providing me with the opportunity to work on this project. He has broadened my horizons by encouraging and enabling me to work outside of Portugal, and his concern and advice since I started working with him has proved invaluable. I also thank Pamela Puppo for all her contributions and hard work. This thesis would have not been possible without her significant contributions to the sampling, laboratory work, and her co-authorship of several papers. But above all, I would like to thank her for her advice and friendship. I wish to thank everyone from CIBIO for providing me with an environment where I could develop myself as scientist. I would like to thank the people from CTM for all the help and support during the time I spent doing my lab work there. In particular, I would like to thank Susana Lopes for her availability in helping me with all protocol optimizations. I would like to thank the people from the Technical University of Munich that helped me during the time I spent there. I would like to thank Christina Schachtler, Maximiliane Schuemann and Sarah Sturm for contributing their work concerning the preparation of RAD-sequencing and for making me feel welcome. I also would like to thank Saurabh Dilip for introducing me to a lot of the bioinformatics analyses that I used in this thesis. I would also like to thank Christian Bräuchler and Pedro Luis Perez-de-Paz for providing some of the samples used in this thesis and Andreas Brachmann for helping with all Illumina sequencing. Warmest thanks go to everyone from Colorado State University for welcoming me there. In particular I would like to thank Mark Simmons for advising me and for sharing his knowledge and wisdom with me. Additional thanks go to everyone from his laboratory for their friendship while I was there. I thank Peter Sykacek for hosting and advising me during my first year in BOKU. I would like to thank the people from INF for providing help when it was needed. Finally, I would like to thank my parents for their love, advice and support. FCUP i The role of inter island gene-flow in Micromeria evolution in the Canary Islands Resumo A maioria da diversidade encontrada em ilhas oceânicas operou-se através de radiações adaptativas. Este processo é promovido pela grande quantidade de nichos vazios disponíveis neste tipo de sistemas. “Hybrid swarms” são populações que resultam da hibridação de diferentes linhagens. Este processo potencia probabilidade de ocorrência de radiações adaptativas porque a combinação de novos genótipos pode aumentar a capacidade de adaptação das populações envolvidas. Desde o ano 2000 vários estudos descreveram uma diversidade genética superior ao esperado nas Ilhas Canárias o que levou à formulação da hipótese sobre a existência de “surfing syngameon”. Segundo esta hipótese, tal observação resultou da criação de “hybrid swarms ” através de múltiplos eventos de colonização do arquipélago. As populações daí resultantes divergem em espécies que estão ligadas por fluxo génico e evolvem dependentes umas das outras. Este tipo de espécies são conhecidas por "syngameon". Apesar da hipótese das “surfing syngameon” ter sido só aplicada para explicar a colonização de arquipélagos esta também poderá ser aplicada na colonização de cada ilha. Na tese aqui apresentada, testei se a esta hipótese esta correta usando as espécies de Micromeria endémicas das Ilhas Canarias como sistema. Micromeria distribui-se por todas as ilhas e habitats das Ilhas Canárias e apresenta uma grande diversidade morfológica. Este género contem um grupo de espécies que são morfologicamente idênticas, sendo o exemplo mais relevante as espécies previamente descritas como M. varia s.l. De acordo com estudos de filogenia molecular elas têm origens independentes, o que é congruente com um processo de evolução convergente. No entanto, considerando os processos de evolução reticulada descritos em ilhas oceânicas, estes resultados também podem ser uma consequência de introgressão de outras espécies da mesma ilha impedindo a deteção de uma origem comum usando apenas alguns marcadores. Nesta tese, foquei-me nas hipóteses relacionadas com a extensão da “syngameon hypothesis” para a colonização de cada ilha; e uma possível origem única do fenótipo de M. varia s.l. A primeira hipótese foi testada através da análise de padrões de estruturação genética, diversidade genética e fluxo-genético, numa perspetiva abrangente (arquipélago completo) e local (ilha de Tenerife). Para testar a segunda hipótese, dados genómicos foram usados para avaliar relações filogenéticas das espécies previamente descritas como M. varia s.l. Os objetivos visados só foram só concretizados através do desenvolvimento de novos marcadores moleculares. Três tipos de marcadores moleculares foram desenvolvidos: “exon primed and intron ii FCUP Manuel Curto spanning sequencing markers” (EPIC), microssatélites, e RAD-sequencing. Aqui, discuto o tipo de informação e de enviesamentos associados com os diferentes tipos de marcadores. Os microssatélites mostraram uma diversidade genética mais elevada do que esperada em populações ocupando ilhas/regiões mais novas e a uma maior diferenciação genética em taxa ocupando ilhas mais antigas. Adicionalmente, foram detetados sinais de recente e histórico fluxo genético. Estes resultados são congruentes com um cenário onde cada ilha colonizada diversas vezes. Diversidade genética de diferentes origens e combinada em populações bastante variáveis através de hibridação. Este processo impede a perda de diversidade genética por efeito fundador criando condições ideais para a ocorrência de processo de radiação adaptativa. A especiação dessas populações resultam em syngameons. Em regiões mais antigas o fluxo genético não e ao eficiente na manutenção de conectividade entre espécies. Assim barreiras para o fluxo génico podem ser estabelecidas resultando na exclusão dessas espécies da syngameon. Os dados de RAD-sequencing confirmara origens múltiplas para a morfologia M. varia s.l. suportando a ideia de evolução convergente. Adicionalmente, o sinal filogenético foi congruente com as zonas ecológicas presentes no arquipélago. Estes resultados em conjunto que a prevalência de fluxo-génico inter-especifico detetado com os microssatélites, levaram à criação da hipótese que este fenótipo apareceu apenas uma vez. Introgressão com espécies da mesma ilha contribuiu para a perda da maioria do genoma ancestral de M. varia s.l. Os genes responsáveis por esta morfologia foram selecionados durante o processo de adaptação. Esta tese disponibiliza novos recursos moleculares que podem ser usados quer em Micromeria quer em géneros filogeneticamente próximos. Adicionalmente, o quadro teórico desenvolvido nesta tese pode ser aplicado não só em Micromeria ou em ilhas oceânicas mas também noutros sistemas onde hibridação promove radiação adaptativa ou adaptação local. Palavras-chave: Ilhas oceânicas, Ilhas Canarias, Micromeria, radiação adaptativa, syngameon de espécies, microssatélites, RAD-seq, introgressão, hibridação, filogeografia, filogenómica, marcadores moleculares. FCUP iii The role of inter island gene-flow in Micromeria evolution in the Canary Islands Abstract Most of the diversity found in oceanic islands is produced by adaptive radiation events. This process is promoted by the high availability of free niches and isolation from the mainland typical for these systems. Hybrid swarms, where different lineages are combined through hybridization, are more likely to result in adaptive radiation events because new combinations of genotypes increase the adaptive ability of populations. Since the year 2000 several studies suggested that genetic diversity was higher than expected in the Canary Islands, which led to the creation of the surfing syngameon hypothesis. This hypothesis states that this pattern of high genetic diversity is a consequence of the creation of hybrid swarms after multiple colonization events of the archipelago. These populations diverge into species connected by gene-flow and evolve dependently from each other, also known as species syngameon. Although the surfing syngameon hypothesis was originally developed to explain the colonization of the entire archipelago, the same process might be applied to the colonization process of each individual island. In the present thesis I intend to test if this is the case by using the Micromeria species endemic to the Canary Islands as a system. Micromeria is distributed throughout all islands and ecological zones of the Canary Islands, and it has a high morphological variation. This genus contains groups of morphologically identical species, the most remarkable example being the species previously classified as M. varia s.l. Based on molecular phylogenetic analyses they show independent origins, and since they occupy similar habitats on different islands, a case of convergent evolution is indicated. Alternatively, in light of the reticulate patterns described on oceanic islands, these results can also be a consequence of introgression with other species from the same islands. In this situation, the detection of a single origin is prevented if only a few markers are used. In this thesis I focus on and compare the hypothesis regarding the extension of the surfing syngameon hypothesis to the colonization of each island and the possible single origin of the M. varia s.l. phenotype. The first hypothesis was tested by analyzing genetic structure, gene-flow, and diversity patterns in wider (entire archipelago) and local (Tenerife) scales, including all Micromeria species. To test the second hypothesis, a genomic dataset was used to evaluate the phylogenetic relationships of the species previously classified as M. varia. These objectives could only be addressed by developing new sets of molecular markers. Three marker sets were developed: exon primed and intron spanning sequencing markers (EPIC); microsatellites; and RAD iv FCUP Manuel Curto sequencing markers. The type of information they provide and the biases associated with different types of markers are discussed. Microsatellite loci showed a higher genetic diversity than expected in populations occupying younger areas/islands, whereas there was a higher genetic differentiation among taxa occupying older regions. Additionally, signs of current and historical gene- flow between species from the same and different islands were detected. These results are congruent with a scenario where each island is colonized multiple times. Genetic diversity from multiple sources is then combined into a highly diverse population through hybridization. This process prevents the loss of genetic diversity through the founder effect by creating ideal conditions for adaptive radiation. When these populations speciate the resulting species remain connected by gene-flow contributing for the expansion of the species syngameon. In older regions gene-flow stops being as effective in the remaining connected species, resulting in the establishment of reproductive isolation and thereby excluding them from the syngameon. The RAD-sequencing dataset, confirmed multiple origins for the species showing the M. varia phenotype, supporting the idea of convergent evolution. Moreover, the first time phylogenetic analyses was congruent with the distribution of ecological zones in the archipelago. These results together with the high prevalence of inter-specific gene-flow detected with microsatellites, led to the creation of the hypothesis that this morphology appeared just once and was spread through the archipelago. Introgression with other species from the same archipelago contributed to the loss of most of the ancestral M. varia s. l. genome. The genes responsible for this morphology were selected during the adaptation process. This thesis provides new molecular resources that can be used both in Micromeria species and in some closely related genera. Theoretical framework developed here may not only be applied for research focusing in Micromeria or in oceanic islands, but also in other systems where adaptive radiation or local adaptation is promoted by hybridization. Key words: Oceanic islands, Canary Islands, Micromeria, adaptive radiations, species syngameon, microsatellites, RAD-seq., introgression, hybridization, phylogeographic, phylogenomics, molecular markers.