Investigati o n o f A n tibacter ia l P r operties dur in g H a rden in g o f D e n t a l C e ments Xiyu a n Ji a n g Degr e e p r oje c t i n a p pli e d b i o technolo g y , M a st e r o f S c ien c e ( 2 y e ar s ) , 2 0 11 Examensarbe t e i t i l l ämp a d b i o tekn i k 3 0 h p t i l l m a sterexame n , 2 0 11 Biolo g y E d ucati o n C e nt r e a n d B io lo g y E d ucati o n C e nt r e a n d D e partme n t o f E n gineeri n g S c iences, Upps a l a U n iversi t y , U p ps a l a U n iversity Superviso r : H å k a n E n gqvist Contents   Summary ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 2  1.  Introduction ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 3  1.1.  The formation of dental plaque ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 3  1.2.  Dental cements studied in investigation ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 4  1.3.  Effects on antibacterial properties of dental cements ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 6  1.4.  Popular assays for evaluating antibacterial properties of dental cements ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 6  1.5.  Aim of the study ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 7  2.  Materials and methods ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 8  2.1.  Specimens preparation ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 8  2.2.  Bacterial strain and growth conditions ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 9  2.3.  Agar diffusion test ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 9  2.4.  Resazurin test ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 9  2.5.  Antibacterial effects of pH∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 10  2.6.  Antibacterial effects of fluoride ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 10  2.7.  Statistical analysis ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 11  3.  Results ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 12  3.1.  Antibacterial properties of six dental cements ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 12  3.2.  Antibacterial effects of pH∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 15  3.3.  Antibacterial effects of fluoride ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 17  4.  Discussion ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 18  5.  Acknowledgement ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 21  6.  References ∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 22                              1 Summary    Secondary  caries  is  a  major  cause  of  revision  and  replacements  of  dental  materials. There are several species of bacteria which are involved in the formation  of secondary caries, where Streptococcus mutans is one of the most frequent. Thus,  it is quite practical to evaluate the effect on antibacterial activity of dental cements  using Streptococcus mutans. In this investigation, six different dental cements were  evaluated:  RelyXTM  Unicem  self‐adhesive  universal  resin  cement,  KetacTM  Cem  AplicapTM glass ionomer luting cement, Harvard zinc phosphate cement, Ceramir®  Crown & Bridge, Calcium Aluminate and Glass Ionomer cement. Agar Diffusion Test  (ADT)  and  Resazurin  Test  were  used  in  this  study  to  evaluate  the  degree  of  antibacterial properties of the dental cements.    Compared with the control group, the Calcium Aluminate and Ceramir cements  demonstrated  strongest  antibacterial  properties  in  a  long  period  time  with  the  resazurin test (P ≤ 0.05), while the Glass Ionomer Cement exhibited no antibacterial  properties. Zinc phosphate and RelyX Unicem show little antibacterial properties. In  the agar diffusion test, no antibacterial activity was observed for any of the tested  cements, and resazurin test may be a more suitable test than agar diffusion test to  evaluate antibacterial properties of dental cements.  The antibacterial properties of dental materials may be attributed to the pH during  setting and after maturation, and release of ions, such as fluoride ions. During this  study, antibacterial effects of different pH and different concentration of fluoride  were also investigated. The changing of pH value during and after setting of dental  cements  and  the  release  of  fluoride  ions  from  cements  contribute  to  the  antibacterial properties, and these effects are used to try to explain antibacterial  properties of each dental material.                      2 1. Introduction  Prosthetic dentistry is the dental specialty including restoration or replacement of  teeth, such as crowns, bridges and dentures. Due to the rapidly growing amount of  elderly people in the world, prosthetic dentistry is increasing in importance. Thus  dental cements are widely used in dental and orthodontic applications to cement  materials and obtain a functional unit in the mouth. For ideal dental cements, several  properties are desired, such as low solubility, low viscosity, high bond strength to  various  dental  materials,  high  compressive  and  tensile  strength,  anticariogenic  activity, etc (1). The present dental cements originate from resins, hybrids and the  ceramic classes of materials. One main design difficulty with dental cements is their  environment as a bond between two rigid materials or one prosthetic material and  dentine. A bond should last for many years under high loads, moist and attacked by  bacteria.    1.1. The formation of dental plaque  The bacterial pressure in the oral cavity is high and the risk of plaque formation  and  subsequent  caries  is  constantly  a risk  for  patients. With  dental  treatments,  secondary caries is a major cause of revision and replacements of dental materials.  The environment of the oral cavity is quite complicated, and there are numerous  species of micro‐organisms that co‐exist in the oral cavity, which provides a condition  for micro‐organisms to survive and proliferate (2). The bacteria in the oral cavity are  involved in the development of many oral diseases such as demineralization process  of marginal enamel and dentin and secondary caries (3). Secondary caries is one of  the most important factors to affect the longevity of dental cements (4). There are  several  species  of  bacteria  isolated  from  dental  plaque,  such  as  Lactobacilli,  Streptococcus  mutans,  Streptococcus  sobrinus,  etc  (5),  which  may  induce  the  formation of secondary caries. Streptococcus mutans is one of the most frequent  bacteria  involved  in  dental  caries  (4).  These  cariogenic  bacteria  could  degrade  fermentable carbohydrates to acids to demineralise tooth tissue (6). Thus, it is quite  practical to evaluate the antibacterial activity of dental cements with these bacteria,  and the ability of dental cements to inhibit the formation of secondary caries (4).    In general the starting points for bacterial colonization are irregularities on dental  surfaces. These irregular surfaces give high resistance to shear forces and bacteria  can proliferate (2). After placement of a dental material on or in a tooth, depending  on application there is always a risk of microleakage to occur between material and  tooth substance. This is a common clinical phenomenon and happens more or less  with all materials (6). For instance, the polymerization shrinkage of dental cements  based  on  resins  during  hardening  may  lead  to  gap  formation  between  the  tooth‐cement interface, and oral fluids, ions, some molecules and bacteria could  penetrate into this gap (6) (7). The gaps between the material and teeth are easy for  3 oral micro‐organisms to colonize and the shortage of mechanical disturbance and  oxygen favors the growth of anaerobic Streptococcus mutans (8). Then dental plaque  is formed, and followed by secondary caries. Thus antibacterial properties may be a  very important characteristic of dental cement.  1.2. Dental cements studied in investigation  There are several different cements used in the clinical practice such as resins,  glass  ionomers,  zinc  phosphates,  ceramics,  and  hybrids.  In  this  investigation,  antibacterial properties of 6 different dental cements has been evaluated; RelyXTM  Unicem self‐adhesive universal resin cement (manufactured by 3M ESPE), KetacTM  Cem AplicapTM glass ionomer luting cement (manufactured by 3M ESPE), Harvard  zinc phosphate cement (manufactured by HARVARD Dental International GmbH),  Ceramir® Crown & Bridge (manufactured by Doxa Dental AB), Calcium Aluminate and  Glass Ionomer cement (supplied by Doxa Dental AB), see Table 1.                                  4 Table 1. Compositions of all the dental cements used in this investigation    Powder  Liquid  Type   Supplier   P/L ratio1 RelyXTM Unicem  Alkaline fillers,  Methacrylate  Resin  3M ESPE  In  (RelyX)  silanated fillers,  monomers  cement  capsules  initiator  containing  components,  phosphoric acid  pigments  groups,  methacrylate  monomers, initiator  components,  stabilizers  KetacTM Cem  Glass powder,  Polycarboxylic acid,  Glass  3M ESPE  In  AplicapTM  pigments  tartaric acid, water,  ionomer  capsules  (Ketac)  conservation agents Harvard zinc  Zinc oxide,  o‐phosphoric acid  Zinc  Harvard  3/2  phosphate  magnesium  phosphate  Cement  cement  oxide  (Zinc)  Ceramir® Crown  Calcium  Water, accelerators  BioCeramic  Doxa  3.2/1  & Bridge  aluminate,  Dental  (Ceramir)  strontium  fluoride,  polyacrylic acid,  tartaric acid,  strontium  alumino  fluoride glass  Calcium  Calcium  Water, accelerators  BioCeramic  Doxa  2.5/1  Aluminate  Aluminate  Dental  (CA)  Glass Ionomer  Poly acrylic  Water   Glass  Doxa  3.2/1  cement  acid, tartaric  ionomer  Dental  (GIC)  acid, strontium  alumino  fluoride glass,  strontium  fluoride  1P/L ratio stands for the ratio of power and liquid when mixing.            5 1.3. Effects on antibacterial properties of dental cements  The antibacterial properties of dental materials may be attributed to the pH during  setting and after maturation and release of ions, such as fluoride ions (6). Fluoride is  well known as an anticariogenic agent used in drinking water and a variety of other  vehicles, and there are several mechanisms involved in this effect, such as reduction  of demineralization, enhancement of remineralization, and inhibition of microbial  growth and metabolism (9). Fluoride can influence the metabolism of bacteria in oral  cavity in multiple ways (10).    1.4. Popular  assays  for  evaluating  antibacterial  properties  of  dental cements  The agar diffusion test (ADT) and direct contact test (DCT) are two popular assays  for evaluating the antibacterial properties of dental cements used.            ADT  is  based  on  placing  dental  cement  specimens  on  agar  plates,  which  are  seeded with micro‐organisms, and then the degree of antibacterial activity of each  sample  is  evaluated  by  taking  gauge  of  inhibition  zone  around  specimens  after  incubation (6). However, this assay has several disadvantages, and there are some  acknowledged limitations in ADT. This assay just has ability to measure released  water‐soluble  components,  so  the  results  of  ADT  depend  on  the  solubility  and  diffusion properties of both dental cements and media. For dental cements, ideal  ones are expected to have low solubility and less diffusion, so at this time, ADT may  not detect the antibacterial activity. The results of ADT are usually semiquantitative.  It is also difficult to control the variables during testing, such as the density of  bacterial inocula, growth medium, storage conditions of agar plates, etc (6) (11) (12)  (13).    To  avoid  the  limitations  ADT  has,  DCT  has  been  developed  to  quantitatively  measure the effect of physical direct and close contact between the tested materials  and bacteria. Classic DCT was first described by Weiss et al (14). It is based on the  growth of bacteria in 96‐well microtiter plates after direct contact between materials  and bacteria. The growth of bacteria in each well was measured and recorded at  650nm  continuously  at  37  degrees  every  30  minutes,  by  using  a  temperature‐controlled  spectrophotometer  (13).  Compared  with  ADT,  DCT  is  independent  of  the  solubility  of  antibacterial  components  from  cements  and  diffusion properties. Also, the DCT simulates the clinical situation, so the results of  DCT are more convincing than ADT (11) (12) (13).    In this investigation, resazurin is used in the direct‐contact test. Resazurin is a  fluorescent blue dye used as an indicator of cell viability. Metabolically active cells  6 can reduce resazurin to resorufin and dihydroresorufin, from blue color to pink color.  Resazurin is nonfluorescent, and resorufin is fluorescent. The degree of fluorescence  can be measured colorimetrically or fluorometrically, and represents bacterial cell  viability after direct contact, and then the antibacterial properties of each dental  materials can be found out. One of the advantages of resazurin is that it is non‐toxic  to cells and stable in the culture medium. The resazurin test consumes less time, and  it is quite convenient to control, compared with the classic DCT (15) (16) (17).    1.5. Aim of the study  The objective of this study is to assess and compare the antibacterial properties of  six different dental cements on S. mutans during hardening by using the resazurin  test and agar diffusion test, and also test the effects of different pH and different  concentration of fluoride on the bacterial survival and attempt to explain the results  and mechanisms according to the characteristics of each dental cement.                            7 2. Materials and methods  2.1. Specimens preparation  Six types of dental cements were investigated. The brands, types, suppliers and  mixing radio used in this study are shown in Table 1.    RelyX Unicem capsule was inserted in the AplicapTM Activator (manufactured by  3M ESPE), and the activator lever was pushed completely down and held down for  2‐4  seconds.  Then  the  RelyX  Unicem  capsule  was  triturated  in  high  speed  by  CapMixTM, manufactured by 3M ESPE, for 15 seconds. The capsule was inserted in  the Aplicap Applier after mixing, and the nozzle was opened as far as possible. Then  the cement was covered the entire mold evenly, and the surface of the filled mold  was placed over by a plastic film. The mold was 1.5 mm deep, and the diameter was  5mm. After exposing to the artificial visible blue light for 60 seconds, the cement was  cured. Then the plastic film was removed, and specimens were incubated in the 37°C  oven in a dry condition.  The  preparation  for  KetacTM  Cem  AplicapTM  was  similar  to  RelyX  Unicem  at  beginning. After mixing by CapMixTM for 10 seconds, the capsule was inserted in the  Aplicap Applier, and the cement was spread into the mold. Then the samples were  incubated in the 37°C oven in the moist condition for 10 min. After setting, the  specimens were removed out of mold, and incubated in the 37°C oven in the moist  condition.  The  Harvard  zinc  phosphate  cement  was  mixed  in  the  proportions  3/2  (powder/liquid). A spatula was used to mix the powder and liquid in 90 seconds, to  achieve a homogenous consistency. The mixed cement was transferred into mold and  incubated in the 37°C oven in the moist condition for 7 min. After setting, the  specimens were removed out of mold, and incubated in the 37°C oven in the moist  condition.  The P/L ratio of mixing for Ceramir, Calcium Aluminate, and GIC are shown in Table  1. The setting time for all of them was 10 min at 37°C and moist condition. Then all  the specimens were incubated in the 37°C oven in the moist condition.  All the specimens were allowed to age in the oven for 10 min, 1 day, and 7 days  before testing, and six repeats for the same experiment.      8 2.2. Bacterial strain and growth conditions     The  indicator bacterial strain which was used to determine the growth inhibition  activity of the 6 different dental materials was Streptococcus mutans, and the original  strain was supplied by Department of Engineering sciences, Nanotechnology and  Functional Materials group, which was isolated from dental plaque. This strain was  activated and grown in the brain‐heart infusion broth (BHI) medium for 24 hours at  37°C anaerobically (without shaking) from the plate of frozen‐stock cultures.  2.3. Agar diffusion test     For  agar diffusion test, 100 μl of bacterial suspension which was activated in the  BHI medium from frozen‐stock cultures were spread on 1% BHI agar plates evenly,  and the plates were dried for 1 hour at room temperature. Then the specimens with  different aging time (in sextuple) were inserted in the surface of BHI agar plates  previously inoculated with S. mutans vertically and were incubated anaerobically for  17 hours at 37°C. After incubation, the agar plates were examined for inhibition of  bacterial growth. Under these conditions, the semidiameter of inhibition zone was  measured  and  recorded.  Each  of  the  experiment  with  different  materials  and  different times were carried out in sextuple.  2.4. Resazurin test     For  the resazurin test, besides the six different materials with three different aging  time (in sextuple) as testing group, six specimens made of Poly (methyl methacrylate)  (PMMA) were used as control group, which is the same size as testing specimens, 1.5  mm  in  deep  and  5  mm  in  diameter.  A  microtiter  plate  (96‐well,  flat‐bottom  Transparent Polystyrol) was used, and all the specimens, both testing group and  control group were put into it, one specimen for one well. The original S. mutans  suspension of 5 μl which was activated in the BHI medium from frozen‐stock cultures  were added on the surface of each specimen to make sure directly and closely  contact between the testing micro‐organism and the testing materials. Then the  plate was incubated in 37°C for 1 hr (check dryness every 15 min). MH broth 135 μl  and 10×resazurin 15 μl was added to each well, and the plate was incubated in 37°C  for 100 min (check color from blue to pink every 15 min). The standard curve was  also done at the same time, and the dilution rate were 0.1×, 0.08×, 0.06×, 0.04×,  0.02×, 0.01×, 0.008×, 0.006×, 0.004×, 0.002×, 0.001×. Multimode microplate reader  (Infinite® 200 PRO, TECAN) was used to measure the degree of fluorescence for each  well.  9