MEMOIRE L Presepnatre Philippe AUDIOT Tituldaui rDeE LA 1 (Diplome d'Etat de Laboranvt�idni cdl':A-n1aLliyos1e1s Medicates) en vuc tie l:4 de folram atipoons t-BTS MBoilo'lcougdliiaesi preean usL eyec t· e chnique SL Luui,; � Bordeaux • INITIATIAOUXN T ECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES A LAP ATHOLOGIE VIRALE DES INVERTEBRES MARINS Unite de Recherche en Pathologic, lmmunoJogie et Genetique Moleculairc 17 390 La Tremblacle ,Janvier lf)H2 1 MEMOIRE Pl'ésenté par Philippe AUDIOT Titulaire du DELAM (Diplome d'Etat de Laborantin d'Analyses Médicales) en vue de la validation de la formation post-BTS Biologie Moléculaire dispensée au Lycée technique Sl Leuis il Bordeaux INITIATION AUX TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES A LA PATHOLOGIE VIRALE DES INVERTEBRES MARINS Unité de Recherche en Pathologie, Immunologie et Génétique Moléculaire 17390 La Tremblade Janvie,' 1992 1 REMERCIEMENTS Je tiens à remercier Evelyne BACHERE, responsable de l'unité URPIGM qui a bien voulu m'accueillir dans son laboratoire. C'est avec plaisir que je remercie Marc OHRESSER et Rose Marie LE DEUFT pour m'Moir encadré tout au long de ce stage et conseillé pour la rédaction de ce mémoire. ainsi que pour leur amitié. Enfin, je m'adresse à toute l'equipe de l'unité URPGIM pour pour sa ge11lillesse CL son aidc généreuse. 1 SOMMAIRE SOMMAIRE INTRODUCTION p 1 MATERIELS ET METHODES p3 1- MATERIELS BIOLOGIQUES p3 1.1- Les Baculovirus 1.2- Les Lymphocystivirus. 2- EXTRACTION D'ADN p3 2.1- ADN génomique * ADN de crevettes infectées par du Baculovirus * Purification d'ADN par gradient de chlorure de césium en présence du colorant de Hoechst 2.2- ADN plasmidique * Minipréparation : "boiling method" modifiée de Sambrool, et al. (1989) * Maxipréparation 2.3- Quantification de l'ADN * Par spectrophotomètrie • Méthode de "Saran-Wrap" 3- CLONAGE p 6 3.1- Souche bactérienne et vecteur de clonage * Souche bactérienne * Vecteur de clonage 3.2- Préparation de l'insert 3.3- Construction des plasmides recombinants 3.4- Mise en compétence des bactéries * Détermination de la DO correspondant à la densité bactérienne optimale * Préparation des cellules compétentes 3.5- Transformation 4- MARQUAGE DES SONDES ET HYBRIDATIONS p 9 4.1- Transfert d'ADN (Southern, 1975) 4.2- Préparation des sondes 4.3- Hybridation des membranes avec des sondes marquées 5- AMPLIFICATION DES SEQUENCES PAR P.C.R. (POLYMERASE CHAIN REACTION) p JO 5.1- Préparation de l'ADN cible 5.2- Amorces 5.3- Réaction d'amplification par P.C.R. 6- UTILISATION DU SYSTEME D'EXPLOITATION BISANCE pl! RESULTATS 1- PURIFICATION D'ADN DE BACULOVIRUS p 13 1.1- Essais de purification d'ADN viral AcMNPV à partir de cellules SF9 (Spodoptera frugiperda) infectées 1.2- Purification d'ADN viral à partir de crevettes (Penaeus vannamei) infectées 2- PREPARATION DE SONDE VIRALE D'AcMNPV SPECIFIQUE DU GENE DNA POLY MERASE p 14 2.1- Préparation des cellules compétentes 2.2- Contrôle de ligation 2.3- Clonage du fragment Psti-H de AcMNPV 2.4- Etude des colonies recombinantes 3- SOUTHERN BLOT: LOCALISATION DU GENE DE LA POLYHEDRINE SUR L'ADN DE BACULOVIRUS p 16 4- DIAGNOSTIC VIRAL PAR P.C.R. p 17 4.1- Choix des amorces 4.2- Amplification 5- RECHERCHE DE SEQUENCES CONSERVEES DANS LE GENE DE LA DNA POLYMERASE DES HERPESVIRIDAE p 18 DISCUSSION p 20 BIBLIOGRAPHIE ANNEXES 1 LISTE DES ABREVIATIONS AcMNPC : Autographa californica nuclear polyhedrosis virus ADN : acide désoxyribonucléique ATP :adénosine 5'triphosphate bp : paire de bases BrEt : bromure d'éthidium CsCI : chlorure de césium dATP : désoxyadénosine triphosphate dCTP : désoxycytidine triphosphate dGTP : désoxguanidine triphosphate DO : densité optique dTIP : désoxythymidine triphosphate ETDA :acide éthylène diamine tétracétique kb : kilobase LDV : Lymphocystis Disease Virus PCR : Polymerase chain reaction RNase : ribonucléase SDS : sodium dodécyl sulfate TE : Tris-HCl EDTA UV : ultraviolet X-Gal : 5- bromo4-chloro3-indolyl -0-galactopyranoside 1 INTRODUCTION 1 L'importance économique à l'échelle mondiale des mollusques et des crustacés en aquaculture a conduit au développement de recherches en pathologie infectieuse, qui représente un aléa majeur pour les productions. En effet, quel que soit l'espèce élevée et le pays concerné, les élevages sont fréquemment perturbés par différents types d'agents pathogènes, protozoaires intracellulaires, bactéries et virus. Les maladies virales constituent le problème majeur pour l'aquaculture comme le montrent les chutes de production de crevettes dues à des Baculovirus, Picornavirus ou des Parvovirus (Lightner, 1983), ou l'épidémie de l'huître portugaise et des mortalités de l'huître japonaise dues à des Lymphocystivirus et des virus de type Herpesviridae. En effet, un J ridovirus a été décrit chez l'huître portugaise, Crassostrea angulata, (Comps et al., 1976) et impliqué dans la disparition de cette espèce d'huître des côtes françaises, entre 1969 et 1971. Cet 1r idovirus présente des similitudes extrêmes, d'un point de vue ultrastructural avec le Lymphocystivirus) LDV (Lyrnphocystis Disease Virus), agent pathogène connu chez un certain nombre de poissons marins. Par ailleurs, aux Etats Unis, un virus du même type (OWD, Oyster Velar Virus Disease) a été associé à des mortalités massives de larves d'huître japonaise, Crassostrea gigas, en éclos8rÎe (Elston et Wilkinson, 1985). Enfin, très récemment, des mortalités de larves et de naissains d'écloserie de cette même espèce d'huître ont été observées en Bretagne et l'agent infectieux) caractérisé en microscopie électronique, a été identifié comme un virus apparenté à la famille des Herpesviridae (Nicolas et Comps, communication personnelle). Dans ce contexte, il apparaît que la virologie constitue chez les invertébrés marins d'intérêt aquacole, un domaine de recherches prioritaire à développer. C'est pourquoi des t.ravaux ont été initiés à l'Unité de Recherches en Pathologie, Immunologie et Génétique Moléculaire des Invertébrés Marins (IFREMER, La Tremblade) d'une part, sur la mise au point de méthodes de diagnostic adaptées aux contrôles zoosanitaires et à des mesures de prophylaxie, et d'autre part., sur l'obtention de souches résistantes aux virus par l'inhibition de la réplication virale selon I~ stratégie anti-sens. Cette inhibition virale repose sur la fixation d'oligonucléotides ou d'ARN anti-sens dont les séquences sont complémentaires d'ARN messager, provoquant le blocag"e des ribosomes et donc l'arrêt des synthèses des proteines indispensables à la réplication virale. Compte tenu de l'absence de lignée cellulaire de mollusques et de crustacés, il n'existe pas de modèle viral spécifique de ces animaux. De ce fait, les recherches ont été entreprises sur un Baculovirus d'insecte, Autographa califomica, Multiple embeded Nuclear Polyhedrosis Virus (AcMNPV, produit sur lignée cellulaire Sf9 de Spodoptera frugiperda) et le Lymphocystivirus de poissons (LDV, produit sur lignée cellulaire de poisson, BF2). Les résultats acquis Sllr la caractérisation génétique de ces virus hétérologues pourront être extrapolés aux virus d'invertébrés marins. Ainsi, Sur la base d'homologie de séquences, des gènes cibles peuvent être recherchés sur les virus spéciriques de crustacés et. de mollusques, par techniques d'hybridation ou de PCR. En ce qui concerne les Baculovirus, deux gènes peuvent être retenus: - le gène de la polyédrine qui est une proteine majeure exprimée en phase tardive de réplication, présente un intérêt pour une application dans le diagnostic des virus. Il constitue le gène de référence pour l'orientation de la carte physique des baculovirus (Vlak et Smith, 1982). - le gène de la DNA polymerase virale nécessaire à la réplication virale constitue un gène cible dans le cadre de la stratégie anti-virale par anti-sens. 1 1 Par ailleurs ce gène de DNA polymerase, hautement conservée entre les virus a ADN double brin (Tomaski el al., 1988) pourra être également recherchée, sur la base d'homologies de séquences dans le génome des Herpesuiridae de l'huître. Dans le cadre de mon stage, je me suis initié aux différentes techniques de base de biologie moléculaire, s'inscrivant dans les deux axes de recherches développés à J'URPIGM sur la stratégie anti-virale et la mise au point de méthodes de diagnostic des maladies virales des invertébrés marins. 1 2