JÉSSICA BORDOTTI NOBRE ESPOSITO Influência do MnDFB na tolerância ao estresse oxidativo em plantas de Glycine max expostas ao ozônio e chuva ácida Dissertação apresentada ao Instituto de Botânica da Secreta- ria do Meio Ambiente, como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de MESTRE em BIODIVERSI- DADE VEGETAL E MEIO AMBIENTE, na Área de Con- centração de Plantas Vasculares em Análises Ambientais. SÃO PAULO 2012 JÉSSICA BORDOTTI NOBRE ESPOSITO Influência do MnDFB na tolerância ao estresse oxidativo em plantas de Glycine max expostas ao ozônio e chuva ácida Dissertação apresentada ao Instituto de Botânica da Secreta- ria do Meio Ambiente, como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de MESTRE em BIODIVERSI- DADE VEGETAL E MEIO AMBIENTE, na Área de Con- centração de Plantas Vasculares em Análises Ambientais. ORIENTADORA: DRA. SILVIA RIBEIRO DE SOUZA “The beauty of nature lies in detail; the message, in generality. Optimal appreciation demands both…” Stephen Jay Gould Wonderful Life AGRADECIMENTOS Ao Instituto de Botânica e à Pós-Graduação pelo aprimoramento contínuo do Programa. À minha orientadora Dra. Silvia Ribeiro de Souza por incentivar a novidade em projetos de pesquisa, onde o estudo árduo de temas complexos aumentou não só o conhecimento, mas a paixão pela Biologia. Agradeço também a paciência e amizade nos momentos de tensão. À CAPES/PNADB pela bolsa concedida e iniciativa em promover a troca de experiência e conhecimento entre instituições de pesquisa. À Prof. Luzimar Campos da Silva, pesquisadora da Universidade Federal de Viçosa, por acreditar no traba- lho, supervisioná-lo, sugerir experimentos e fornecer toda a estrutura para obtenção dos dados. À Nívea Viei- ra pela orientação com as técnicas anatômicas e ao Sr. Rogério, funcionário da UCP, pela disponibilização de equipamentos e manutenção do sistema de chuva. Ao aluno Talles Oliveira por dar prosseguimento ao estu- do anatômico. Às Mestras Talita Oliveira, Larisse Freitas e Jaqueline Vasconcelos por estarem presentes em todos momen- tos da estadia em Viçosa: no plantio, no cuidado com as plantas, na coleta de amostras até altas horas, com os protocolos de anatomia, pela hospitalidade, diversão e ensinar na prática o que é amizade. Ao Prof. Ricardo Antunes de Azevedo, chefe do Laboratório de Genética e Bioquímica de Plantas da E- SALQ-USP, pela cooperação nos experimentos de atividade enzimática e à Dra. Salete Gaziola pela recep- ção e auxílio no laboratório, e também pelas sugestões valiosas para aprimorar as análises. Ao Prof. Breno Pannia Esposito, do Instituto de Química da Universidade de São Paulo, por disponibilizar seu laboratório para a análise de metais, pelo fornecimento contínuo do complexo de manganês e acessibili- dade para discutir resultados. Agradeço ao seu aluno, Thiago Andrade por sintetizar o complexo sempre tão prontamente. Aos amigos químicos do IQ-USP, Lucas Vono, Marco Aurélio e Tiago Artur por ensinarem (muitas vezes), passo a passo, como operar o espectro de absorção atômica. Às pesquisadoras do Núcleo de Ecologia Marisa Domingos, Regina Moraes e Patricia Bulbovas pela contri- buição direta neste trabalho. Às funcionárias Amariles, Marli, Maria Auxiliadora e Valdenice por zelar e organizar o laboratório e tornar o trabalho mais prazeiroso. Aos amigos que sempre contribuíram ajudando nos experimentos, lavando vidraria, discutindo protocolos, abrindo e fechando as câmaras, carregando substrato e/ou alegrando o dia: Ricardo Nakazato, Daiane Teixei- ra, Ana Paula Dias, Marcelle Dafré, Jéssica Cassimiro, Marisia Esposito, Pedro Lembo, Patricia Giampaoli, Cristiane Aguiar, Andressa Ribeiro, Andrea Pedroso, Paula Carvalho e Leonardo Fujita. À Simone Ferreira por interromper a escrita de sua dissertação para realizar as medidas de fluorescência na soja e à Pryscilla Denise pelo auxílio com a estatística. Às novas ingressantes ao grupo de pesquisa Marina Zanella, Giselle Pedrosa e Daiana Oliveira por toda a ajuda no laboratório. Aos meus pais tão queridos, Paulo e Gizelda que sempre acreditaram em mim e incentivaram a vontade de aprender. Ao meu marido Breno por ajudar ativamente no experimento (muitas vezes durante os finais de semana), estimular as melhores discussões sobre Ciência e ser um amigo tão generoso. ÍNDICE Resumo i Abstract iii CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO 01 1.1.INTRODUÇÃO GERAL 02 1.2.REVISÃO DE LITERATURA 06 1.2.1. Soja e sua importância 06 1.2.2. Ocorrência de ozônio e chuva ácida nas regiões de cultivo de soja “Sambaíba” 07 1.2.3. Fatores de estresse oxidativo em plantas: ozônio e chuva ácida 08 1.2.4. Antioxidantes 10 Enzimas superóxido dismutase (SOD) 12 Miméticos da SOD 14 1.3.JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS 15 1.4.REFERÊNCIAS 16 CAPÍTULO 2 - AVALIAÇÃO DO EFEITO DE DIFERENTES DOSES DE MnDFB NA SUPERÓXIDO DISMUTASE DE Glycine max ‘SAMBAÍBA’ 23 2.1. INTRODUÇÃO 24 2.2 MATERIAL E MÉTODOS 27 2.2.1. Síntese do complexo MnDFB 26 2.2.2. Cultivo e exposição da soja 27 2.2.3. Procedimentos e análises 29 Biometria 29 Ensaios bioquímicos 30 Extração da ascorbato peroxidase (APX) e SOD total 30 Atividade da APX 30 Atividade da SOD total 30 Atividade das isoenzimas de SOD 31 Peroxidação lipídica 32 Quantificação de metais nas folhas e raízes 33 Análise estatística 33 2.2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 35 2.2.5. CONCLUSÃO 42 2.2.6. REFERÊNCIAS 43 CAPÍTULO 3 – INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL DO MnDFB NO AUMENTO DA TOLERÂNCIA DE PLANTAS DE SOJA SOB ESTRESSE ABIÓTICO: OZÔNIO E CHUVA ÁCIDA 47 3.1. INTRODUÇÃO 48 3.2. MATERIAL E MÉTODOS 54 3.2.1. Exposição à atmosfera controlada: fumigação com ar filtrado e ozônio 54 Cultivo e exposição da soja 54 3.2.2. Exposição à chuva simulada 57 Cultivo e exposição da soja 57 3.2.3. Procedimento e análises 61 Avaliação dos danos visíveis e índice de injúria foliar (IIF) 61 Rendimento quântico do fotossistema II (Fv/Fm) 61 Biometria, ensaios enzimáticos, peroxidação lipídica e quantificação de metais 62 Análise anatômica 62 Análise estatística 63 3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 64 3.4 CONCLUSÃO 79 3.5 REFERÊNCIAS 80 CONSIDERAÇÕES FINAIS 85 ANEXOS 86 ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS Figura 1. Plântula de soja e principais estruturas. 06 Figura 2. Ciclo ascorbato-glutationa. 11 Figura 3. Molécula da desferrioxamina B composta por três hidroxamatos. 24 Figura 4. Estrutura do complexo Mn desferrioxamina-B. 25 Figura 5. Cultivo das plantas de Glycine max ‘Sambaíba’. 28 Figura 6. Taxa de crescimento relativo dos órgãos aéreos de Glycine max. 36 Figura 7. Concentração de malondialdeído (MDA) nas folhas. 36 Figura 8. Atividade da ascorbato peroxidase (APX) nas folhas. 37 Figura 9. Atividade total das superóxido dismutase (SOD) nas folhas. 37 Figura 10. Atividade de isoenzimas de superóxido dismutase (SOD) em gel de poliacrilamida. 39 Figura 11. Concentração de metais em folhas e raízes 41 Figura 12. Sistema de fumigação ou atmosfera controlada. 56 Figura 13. Casa de vegetação na Universidade Federal de Viçosa. 58 Figura 14. Sistema de simulação de chuva simulada. 59 Figura 15. Plantas de soja na câmara de chuva ácida após evento de chuva. 60 Figura 16. Variação dos indicadores de tolerância em folhas de soja tratadas com MnDFB ou MnSO e não-tratadas (controle), sob exposição ao ar filtrado e ozônio. 65 4 Figura 17. Taxa de crescimento relativo dos órgãos aéreos de Glycine max sob diferentes tratamentos e expostas à atmosfera controlada. 66 Figura 18. Atividade de isoenzimas superóxido dismutase em plantas de soja sob diferentes tratamentos e expostas à atmosfera controlada. 68 Figura 19. Concentração de metais em folhas e raízes de plantas de soja expostas à atmosfera controlada. 69 Figura 20. Variação dos indicadores de tolerância em folhas de soja tratadas com MnDFB ou MnSO e não-tratadas (controle), sob chuva neutra e chuva ácida. 71 4 Figura 21. Cortes transversais do mesofilo de plantas de soja sob tratamento controle e submetidas à exposição em câmara de chuva simulada. 73 Figura 22. Cortes transversais apresentando a espessura do mesofilo de plantas de soja submetidas a diferentes tratamentos e expostas à chuva simulada 73 Figura 24. Atividade de isoenzimas superóxido dismutase em plantas de soja submetidas à diferentes tratamentos e expostas à chuva simulada. 76 Figura 25. Concentração de metais em folhas e raízes de plantas de soja expostas à chuva simulada. 77 Figura 26. Revelação diferencial de isoenzimas. 87 Figura 27. Cortes transversais do mesofilo de plantas de soja tratadas com MnDFB e expostas à chuva simulada. 88 Tabela 1. Condições climáticas na casa de vegetação do Instituto de Botânica (nov/2010 a fev/ 2011). 28 Tabela 2. Condições ambientais na casa de vegetação do Instituto de Botânica (set/2011 a fev/2012). 54 Tabela 3. Condições ambientais na casa de vegetação da Universidade Federal de Viçosa (abr/2010 a jun/2010). 57 Tabela 4. Médias e desvio padrão dos parâmetros Fv/Fm, F e Fm medidos 0 nas folhas de soja nas exposições ao ar filtrado e ozônio. 62 Tabela 5. Valores médios das variáveis indicadoras de tolerância em plantas sob diferentes trata- mentos e expostas em câmaras de atmosfera controlada e chuva simulada 72