Influence des souches seules et associées de L. bulgaricus et Str. Thermophilus ainsi que des traitements du lait sur la production d’aldéhyde acétique dans le yaourt V. Bottazzi, B. Battistotti, G. Montescani To cite this version: V. Bottazzi, B. Battistotti, G. Montescani. Influence des souches seules et associées de L. bulgaricus et Str. Thermophilus ainsi que des traitements du lait sur la production d’aldéhyde acétique dans le yaourt. Le Lait, 1973, 53 (525_526), pp.295-308. ￿hal-00928624￿ HAL Id: hal-00928624 https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00928624 Submitted on 1 Jan 1973 HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. 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Les recherches de Grigoroff [1] et de Kuntze [2], conduites au début de ce siècle, ainsi que les recherches successives de Orla- Jensen [3], nous ont indiqué que les ferments lactiques de telles cultures étaient représentés par Lactobacillus jugurti et Lactobacillus bulgaricus. Cependant Metchnikoff indiqua que le produit original était principalement obtenu avec des lactobacilles du type bulgaricus. Depuis que le yaourt de production artisanale est devenu produit industriel, avec, en conséquence, une large diffusion dans tous les pays d'Europe, il a perdu diverses caractéristiques originelles pour devenir le résultat d'une combinaison microbienne différente et d'un processus industriel. La culture naturelle est généralement substituée par une associa- tion de bacilles et de streptocoques thermophiles et, ces derniers temps, de nombreuses recherches ont été réservées à l'explication du rôle que précisément L. bulgaricus et Str. thermophilus exercent dans la production et sur la qualité du yaourt actuel. Mais la nature chimique de la « saveur du yaourt» n'a certaine- ment pas encore été approfondie. Pette et Lolkema [4] ont démontré que l'aldéhyde acétique était le composant principal de la saveur du yaourt et, successivement, Bottazzi et Dellaglio [5] ont indiqué que L. bulgaricus était le responsable de sa production. 296 LELAIT / MAI-JUIN 1973 / N° 525-526 Tout ceci ne peut être considéré comme suffisant en ce qui concerne la diversité des « saveurs du yaourt » et, par conséquent, des types de lait utilisés et de la combinaison des cultures employées. En fait, on peut ainsi expliquer comment Schulz et Hingst [6] puis Schulz, Voss et Kley [7], dans le yaourt de lait de chèvre même de bonne qualité, n'ont pas rencontré une quantité appréciable d'aldéhydes acétiques et comment Turcic, Rasic et Canic [8] donnent de l'importance même aux acides gras volatils. Reste donc établi le fait que dans le yaourt de production indus- trielle obtenu avec L. bulgaricuset Str. thermophilus, l'aldéhyde acé- tique est l'unique substance volatile (Gomer, Palo et Bertan [9]) produite en quantité significative pendant sa préparation. Notre étude, conduite suivant la méthode « Head Space » et examens « chromatographies en phase gazeuse » de l'aldéhyde acéti- que, a pour but de fournir une contribution à la connaissance de l'influence des souches seules et associées composant la culture pour yaourt et aussi sur les traitements thermiques du lait dans la forma- tion de la « saveur du yaourt» ayant pour base l'aldéhyde acétique. METHODES a) Substrat pour l'isolement des souches - pour les formes bacillaires le milieu (MRS) [10] avec incuba- tion à 42°C pendant 48 h dans une ambiance d'azote (pour 90 p. 100) et de C02, - pour les formes streptocoques : le milieu agar-sérum de Politi [11] avec incubation à 42°C pendant 72h. b) Fermentation des sucres : l'essai fut effectué avec le substrat suivant: peptone la g, extrait de levure 5 g, MgSO. 0,05g, solution de bromo-cresol pourpre 2,8 ml (d'une solution alcoolisée à 1,6 p. 100), eau 1000ml, pH final 6,8. Les sucres furent ajoutés à raison de 1p. 100. c) Composition de DNA : les différentes souches après développe- ment sur bouillon MRS, furent traitées pour l'extraction du DNA, suivant la technique de Marmur [12]. De l'allure de la courbe de dénaturation thermique du DNA et de l'application de la formule de De Ley [13] on estime le pourcentage de guanine et de cétosine présentes. d) Test sérologique on a suivi la technique indiquée par Sharpe [14] employant le lapin. e) Evaluation de l'aldéhyde acétique: l'évaluation de ce composé monocarbonilique fut faite directement par chromatographie selon la technique « Head Space » basée sur l'indication de Jennings, Viljhalmsson et Dunkley [15] et de Bassette, Ozeris et Whitnah [16]. MÉMOIRES ORIGINAUX 297 On a fait développer les cultures dans 400ml de lait UHT ou lait autoclavé ou encore de lait UHT traité à 90°Cpendant 30mn, partagé en bouteilles de 500ml, fermées après inoculation, avec des bouchons de caoutchouc et incubées à la température de 42° C. La période d'incubation terminée, on a procédé à la cassure du caillot par agitation et on a mis les bouteilles au bain-marie à 55°C pendant 30mn. Après réchauffement, on procède à une nouvelle agitation des échantillons et avec une seringue spéciale Hamilton on prélève 2 ml des gaz « Head Space » qui sont immédiatement injectés dans l'appa- reil ; la seringue, à chaque prélèvement de gaz, fut néanmoins mainte- nue à 55°Cpar circulation d'eau chaude afin de réduire la condensa- tion des composants volatils dans la seringue. Pour la séparation des composants volatils on a employé une colonne 1,2,3, TRIS (2 cianoetossipropane) sur Chromosorb W (SO-100 mesh) ayant 2 m de long et 4 mm de diamètre, température de la colonne SO° C,injecteur lS0° C,gaz de transport N2(25 ml/mn). Les cultures ont enfin été jugées sur la base des mesures effec- tuées au planimètre des surfaces des pics des résultantes chromato- graphiques. RESULTATS ET DISCUSSION Des divers échantillons de yaourt naturel communément trouvés dans le commerce, on a isolé diverses souches de bacilles et de strep- tocoques et, pour le développement de travail en question, après une première série d'essais préliminaires, on en a choisi 10 de celles-ci, dont précisément 7 de forme bacillaire et 3 streptocoques. Les caractéristiques générales de ces souches sont réunies dans le tableau 1 dont il apparaît clairement que toutes celles de morpho- logie bacillaire appartiennent pour leur capacité à fermenter les sucres, par sérologie et pour leur contenu de guanine et cétosine du DNA p. 100(G + C) à L. bulgaricus et les streptocoques à Str. thermophilus ,.les souches de L. bulgaricus, prises en considération, sont suffisamment constantes dans leur capacité à fermenter les + sucres et dans le p. 100(C G) présentent des variations parfaite- ment normales, pour cela, on peut dire qu'elles représentent un groupe homogène et répondant certainement au but de notre recher- che. A) Caractéristiques de la souche et influence de milieu sur la capacité à produire l'aldéhyde acétique La capacité de la part des souches isolées de produire de l'aldé- hyde acétique a été essayée aussi dans le lait re-stérilisé en autoclave. N '0 00 TABLEAU 1.- Caractéristiques générales des souches Fermentation de '5II1I III o Ill§. o..~ Souches .'.0e<:: ~~ 1 ~~ S~III B~ ~~ .~S ~~III ~~III 1 ~8III 1 .~I9II ,;0..:..,lb0-/2) Tm (pG.l+00C) Classification o E E ~ ~ 'Ill ~ ~ ] ~ u ~ .~ g ~ ~ ~ ---on I--~- j " ~ ~ ~ ~ ~~!~I- I~ - 1- CHL 12 B (*) + + - - - - - - E '89,15 48,20 L. bulgaricus CHL 21 B + + - + - - - - 11 -- - E 90,35 51,10 « « SH 37 B + + - + - - - - E 90,30 51,00 « « PRA 10 BB + + + += - - - - 1 -- - EE 91,00 52,70 « « PRA 55 + + - + - - - - - 1 -- 90,00 50,30 « « MOR 72 B + + - += - - - - - 1 - E 90,45 51,40 ({ « MOR 77 B + + - + - - - - - E 90,40 51,30 STR 45 S + + + + - + - 1 - 1 sr (**) Str. thermophilus 1 STR 63 S ++ ++ ++ ++ -- ++1-1- 1l sr « « ZOL 29 « « S sr (*) B morphologie bacillaire. S morphologie à streptocoques. (**) sr sans réaction. MÉMOIRES ORIGINAUX 299 ---------------- --------------- Dans le lait URT les souches de L. bulgaricus PRA 10, PRA 55, MOR 72 et MOR 77 se sont révélées faiblement productrices d'aldé- hyde acétique tandis que les souches CRL 12, SR 37 et CHL 21 ont démontré leur pouvoir d'en accumuler des quantités vraiment élevées. Il faut noter que, semblables aux premières, celles que nous avons isolées, des divers échantillons de yaourt, sont pour la plupart produites par des maisons commerciales différentes prises en considération. De même, les souches de Str. thermophilus dans le lait URT se sont révélées faiblement productrices d'aldéhyde acétique, un exem- ple de ces différences est clairement visible dans la figure 1où on a reporté les chromatogrammes de quelques souches. 4 3 2 fig. 1 Production d'aldéhyde acétique enlait UHTpar chaque souche 1 test-lait UHT; 2 PRA 55 (L. bulgaricus) ; 3 = STR 45 (Str. thermophilus); 4 = CHL 12(L. bulgaricus); a = pas identifié; b = aldéhyde acétique; c = éthanol et acétone; d = pas identifié. (sensibilité2x). 300 LE LAIT / MAI-JUIN 1973 / N° 525-526 La comparaison entre les souches CRL 12et PRA 55est certaine- ment significative, pour toutes les deux de l'espèce L. bulgaricus la production d'aldéhyde acétique, bien que vraiment différente, est obtenue avec le même substrat et dans les mêmes conditions de développement. Quand on passe à une opération avec le lait URT re-stérilisé en autoclave pendant 20 mn à 1110C on note pour quelques-unes de ces souches un comportement sensiblement différent. On a constaté en effet qu'il y a des souches comme PRA 10 et PRA 55 qui, dans le lait UHT autoclavé sont capables, à la différence de ce qui a lieu dans le lait URT, d'accumuler de grandes quantités d'aldéhyde acétique tandis que les autres, comme CRL 12,qui étaient déjà fortement productrices dans le lait URT ne montrent pas de différences significatives. 3 2 fig. 2 Production d'aldéhyde acétique en lait URT et lait URT autoclavé par la souche PRA10(L. bulgaricus) 1 = test-lait URT autoclavé 2 = PRA 10en lait URT 3 = PRA 10en lait URT autoclavé (sensibilité 2x) TABLEAU 2. - Production d'aldéhyde acétique par chaq ue souche dans le lait UHT et dans le lait UHT autoclavé Souches CHL 12 CHL21 SH37 PRA 10 PRA55 MOR 72 MOR 77 STR45 STR63 ZOL29 pH après 24h à42°Cen : a) lait UHT 4,22 4,25 4,42 4,38 4,38 4,15 4,22 4,40 4,30 4,30 b) lait UHT autoclavé 3,70 3,72 3,80 3,75 3,85 3,87 3,82 4,35 4,28 4,12 Surface en mm' du pic de l'aldéhyde acétique produit en : a) lait UHT 2080 1760 1540 472 330 356 229 110 144 151 b) lait UHT autoclavé 2150 1810 1550 1200 1240 475 418 368 272 261 Classification L.b.(*) L.b. L.b. L.b. L.b. L.b. L.b. S.t ("*) S.t. S.t. 1 (*) L.b. = L. bulgaricus (**) S.t. = Str. thermophilus 302 LELAIT/ MAI-JUIN 1973 / N° 525-526 Il Ya aussi une augmentation avec les autres souches L. bulgaricus comme il y a aussi une légère amélioration en ce qui concerne les trois souches de Str. thermophilus (STR 45, STR 63 et ZOL 29 du tableau 1). La figure 2 illustre clairement le comportement de la souche PRA 10. En même temps, on a noté, comme il est reporté dans le tableau 2 que toutes les souches de L. bulgaricus et non celles de Str. thermo- philus présentent dans le lait UHT autoclavé un développement beau- coup plus intense avec, par conséquent, une acidification plus grande de la couche sous-jacente en ce qui concerne le lait UHT. De l'ensemble des révélations faites, on peut donc observer que dans le domaine de l'espèce L. bulgaricus on relève des souches qui manifestent dans le lait UHT une capacité diverse pour la production de l'aldéhyde acétique. A côté des souches faiblement productrices, et elles forment la majorité de celles que nous avons isolées, il en existe d'autres forte- ment productrices, mais différentes des premières, qui peuvent montrer des capacités similaires aux secondes quand on les fait se développer dans le lait UHT re-stérilisé en autoclave. Bottazzi, Battistotti et Vescovo [17] avaient déjà mis en évidence que l'intensité du traitement thermique subi par le lait conditionnait, dans les cultures continues, la stabilité du rapport « bacilles-coques» mais on signale maintenant qu'une telle influence s'étend aussi à la capacité de production de l'aldéhyde acétique de la part des souches séparées. Le fait que, dans le lait UHT, les éléments de L. bulgaricus mon- trent une capacité diverse à produire l'aldéhyde acétique, peut repré- senter un moyen utile chaque fois que l'on désire choisir les souches à utiliser dans une combinaison pour yaourt. Il va de soi que celles qui sont en état de produire une quantité élevée d'aldéhyde acétique dans le lait UHT sont certainement d'un plus grand intérêt pratique par rapport aux autres. B) Accumulation de l'aldéhyde acétique en cultures associées formées de souches faiblement productrices Avec la série présente d'essais on a voulu voir le comportement des cultures associées formées de bacilles seuls ou bien de bacilles et de coques des souches faiblement productrices dans le lait UHT, en ayant toujours pour référence la production d'aldéhyde acétique. Comme première combinaison on a choisi les souches MOR 72 et MOR 77 et en parallèle, les souches PRA 10 et PRA 55, toutes de l'espèce L. bulgaricus, enfin comme troisième combinaison les souches STR 45 et ZOL 27 ces dernières appartenant à l'espèce Str. thermophilus. MÉMOIRES ORIGINAUX 303 Ces trois combinaisons n'ont montré aucune amélioration dans la production de l'aldéhyde acétique en maintenant toujours de basses valeurs. Quand en revanche on ajoute à ces combinaisons données une souche de Str. thermophilus on a systématiquement une plus grande activité de la forme bacillaire, relevant aussi la valeur du pR final et une production nettement supérieure d'aldéhyde acétique. Ce résultat est nettement obtenu aussi avec une combinaison plus simple, soit une souche de L. bulgaricus peu productrice dans le lait URT et une souche de Str. thermophilus. Dans le tableau 3 on a voulu réunir les résultats tirés d'une série obtenue avec du lait URT à la température de 42°C. TABLEAU 3 Production d'aldéhyde acétique en cultures associées dans lelait UHT Indication de la pH dans le lait URT Surface en mm' du pic combination après 24h à42°C de l'aldéhyde acétique MOR72+ MOR77 4,12 472 MOR72+ MOR77+ STR 45(*) 3,80 832 MOR72+ STR 45 3,85 781 PRA10+ PRA55 4,15 415 PRA10+ PRA55+ STR 45 3,75 874 STR 45+ ZOL29 4,20 165 (*) Les souches avec l'indication STR et ZOL appartiennent à l'espèce Str. thermophilus, les autres à l'espèce L. bulgaricus. Les résultats notés sont hautement significatifs et suffisants pour attirer l'attention sur l'importance qu'assument les souches de Str. thermophilus dans la formation de l'association à employer pour la production du yaourt. Les formes coques non seulement contribuent, comme l'a rappelé récemment Martens [18], à caractériser le caillot au point de vue physique, à permettre un développement plus grand et plus rapide des formes bacillaires et cela afin d'être en mesure d'exercer une hydrolyse partielle des protéines du lait et de libérer de petites quantités d'acide formique, comme l'ont démontré Veringa, Galesloot et Davelar [19], mais encore concourent certainement à créer une ambiance favorable afin que, dans le lait URT, ces souches de L. bulgaricus faiblement productrices d'aldéhyde acétique deviennent bonnes productrices. Cela confirme les vastes relations symbiotiques