ADVERTIMENT. Lʼaccés als continguts dʼaquesta tesi queda condicionat a lʼacceptació de les condicions dʼús establertesperlasegüentllicènciaCreativeCommons: http://cat.creativecommons.org/?page_id=184 ADVERTENCIA.Elaccesoaloscontenidosdeestatesisquedacondicionadoalaaceptacióndelascondicionesdeuso establecidasporlasiguientelicenciaCreativeCommons: http://es.creativecommons.org/blog/licencias/ WARNING.Theaccesstothecontentsofthisdoctoralthesisitislimitedtotheacceptanceoftheuseconditionsset bythefollowingCreativeCommonslicense: https://creativecommons.org/licenses/?lang=en Universidad Autónoma de Barcelona Facultad de Biociencias Departamento de Biología Animal, Biología Vegetal y Ecología TESIS DOCTORAL Implicación de los genes de la familia RAV en el desarrollo floral Memoria presentada por Andrea Elizabeth Aguilar Jaramillo para optar al grado de Doctor en Biología y Biotecnología Vegetal por la Universidad Autónoma de Barcelona Trabajo realizado en el Programa de desarrollo y transducción de señales del Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG), Campus UAB Bellaterra, bajo la dirección de las Doctoras Soraya Pelaz Herrero y Paula Suárez López Directoras Tutor Dra. Soraya Pelaz Herrero Dra. Paula Suárez López Dr. Juan Barceló Coll Doctoranda Andrea Aguilar Jaramillo BARCELONA, 2016 ÍNDICE GENERAL ÍNDICE GENERAL i                                        ABREVIATURAS Y SIGLAS 3                                   ABSTRACT                                                                                                                                       7                              RESUMEN                              9  INTRODUCCIÓN GENERAL                                                                                                        11 1. Arabidopsis thaliana, UN MODELO DE ESTUDIO DEL DESARROLLO VEGETAL 11 2. TRANSICIONES ENTRE LAS ETAPAS DEL DESARROLLO DE UNA PLANTA 11 2.1 La transición de la fase juvenil a la adulta 12 2.2 La floración está controlada por diferentes rutas genéticas 13 2.2.1 Ruta dependiente de la edad de la planta 14 2.2.2 Ruta genética que responde al incremento de la longitud del día o fotoperiodo 15 2.2.3 Ruta genética que responde a cambios en la temperatura ambiental 17 2.2.4 Relación entre las rutas de señalización molecular 18 3. LA FAMILIA RAV DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN 19 3.1 Genes TEMPRANILLO: TEM1 y TEM2 19 4. TRICOMAS 21 4.1 Importancia de los tricomas y beneficios comerciales 21 4.2 Complejo de proteínas encargado de la formación de los tricomas 22 4.3 Las hormonas en la iniciación de los tricomas 22 BIBLIOGRAFÍA INTRODUCIÓN 25 OBJETIVOS GENERALES 31 CAPÍTULO I: Regulation of Developmental Timing by TEMPRANILLO through miR156 and SPL genes ii CAPÍTULO II: SHORT VEGETATIVE PHASE Up-Regulates TEMPRANILLO2 Floral Repressor at Low Ambient Temperatures. CAPÍTULO III: TEMPRANILLO reveals the mesophyll as crucial for epidermal trichome formation CONCLUSIONES GENERALES 35 OTRAS PUBLICACIONES iii ABREVIATURAS Y SIGLAS °C Grados centígrados AP1 APETALA1 AP2 APETALA 2 CAL CAULIFLOWER cDNA Ácido desoxirribonucleico complementario ChIP Inmunoprecipitación de cromatina ChIP-qPCR Inmunoprecipitación de cromatina seguida de PCR cuantitativa en tiempo real CK Citoquininas CO CONSTANS Col – 0 Arabidopsis thaliana ecotipo silvestre Columbia-0. DNA Ácido desoxirribonucleico dNTP desoxinucleótido trifosfato DS desviación estándar EGL3 ENHACER OF GLABRA3 EtBr bromuro de etidio EtOH Etanol FD FLOWERING LOCUS D FLC FLOWERING LOCUS C FLM FLOWERING LOCUS M FT FLOWERING LOCUS T g Gramos GA Giberelina GA Giberelina 3 3 GA3OX Giberelina 3-beta-dioxygenasa GFP Proteína fluorescente verde 4 GIS GLABROUS INFLORESCENCE STEMS GIS2 GLABROUS INFLORESCENCE STEMS2 GL1 GLABROUS1 GL2 GLABROUS2 GL3 GLABRA3 GUS Beta –glucuronidasa Kb Kilobases LD Día largo (long day, 16 horas de luz) LFY LEAFY M Molar mg Miligramos min Minutos miRNA MicroRNA ml Militro mM Milimolar mRNA Ácido ribonucleico mensajero MS Medio de cultivo Murashige-Skoog NHC Número de hojas caulinares NHR Número de hojas de roseta nm Nanómetro nt Nucleótidos NTH Número total de hojas pb par de bases PCR reacción en cadena de la polimerasa RB Réplica biológica RNA Ácido Ribonucleico RNAi RNA de interferencia 5 rpm revoluciones por minuto RT-PCR Transcripción Reversa-seguida de PCR RT-qPCR Transcripción reversa seguida de PCR cuantitativa en tiempo real SAM Meristemo apical del tallo SD día corto (short day, 8 horas de luz) SMZ SCHLAFMÜTZE SNZ SCHNARCHZAPFEN SOC1 SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1 SPL SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE SVP SHORT VEGETATIVE PHASE T- DNA DNA de transferencia Taq Thermus aquaticus TEM TEMPRANILLO Tm Temperatura de fusión TOE TARGET OF EAT TSF TWIN SISTER OF FT TTG1 TRANSPARENT TESTA GLABRA1 μg Microgramo μl Microlitro UBQ10 UBIQUITINA 10 UTR Región no traducida vol/vol volumen/volumen w/v Peso / Volumen WT Tipo Silvestre (wild type) ZFP8 ZINC FINGER PROTEIN8 ZT Zeitgeber time 6 7 ABSTRACT Flowering is probably the most important process in plant development since the perpetuation of the species depends on it. In Arabidopsis thaliana, floral induction is controlled by several genetic pathways that respond to environmental and endogenous stimuli. In our laboratory we have identified the TEMPRANILLO (TEM) genes as flowering repressors under both inductive long-day (LD, 16 hours of light) and non- inductive short-day (SD, 8 hours of light) conditions. The TEM proteins belong to a family of transcription factors called RAV, characterized by the presence of two DNA binding domains, the APETALA2 (AP2) and B3 domains. In Arabidopsis this family is composed of 6 genes. Under LD the photoperiod pathway induces flowering mainly through activation of FLOWERING LOCUS T (FT), while under SD flowering depends mainly on the accumulation of gibberellins (GAs). TEM1 and TEM2 delay flowering under both conditions by directly repressing the expression of the FT, GA 3-OXIDASE 1 (GA3OX1) and GA3OX2 genes, the latter two genes being responsible for the biosynthesis of bioactive GA . Therefore, TEM1 and TEM2 control flowering time 4 through at least two of the genetic pathways that control floral induction: the photoperiod (Castillejo & Pelaz, 2008) and the GA pathway (Osnato et al, 2012). In this PhD thesis we aimed to deepen the role of TEM genes in other genetic pathways controlling flowering and other developmental processes in Arabidopsis thaliana. There is a genetic pathway that responds to the age of the plant and prevents flowering at the juvenile phase. First there is a transition from the juvenile to the adult vegetative stage and then floral induction occurs. The microRNAs miR156 and miR172 are involved in the regulation of these phase transitions of plant development (Huijser & Schmid, 2011). MiR156 maintains the juvenile phase and delays the floral transition (Wu & Poeting, 2006; Wu et al, 2009), while miR156-target SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) genes and miR172 promote the transition to adulthood and floral induction. Our results show that TEM genes are involved in regulating various stages of the age-dependent pathway as they positively regulate miR156 and negatively regulate several SPL genes and miR172, thus delaying flowering. Therefore, TEM genes play a key role in responding to the age of the plant (Chapter 1, Aguilar-Jaramillo et al., manuscript in preparation). 8