Aus dem Walther-Straub-Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Ludwig-Maximilians-Universität München Vorstand: Prof. Dr. T. Gudermann Humanes Biomonitoring: Nachweis von DNA-Addukten der aromatischen Amine ortho-Toluidin und 4-Aminobiphenyl in Harnblasengewebe Dissertation zum Erwerb des Doktorgrades der Humanbiologie an der Medizinischen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität zu München vorgelegt von Francine Böhm aus Freudenstadt 2012 Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität München Berichterstatter: Prof. Dr. Elmar Richter Mitberichterstatter: PD Dr. Michael Seitz PD Dr.Oliver Peschel Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. M. Reiser, FACR, FRCR Tag der mündlichen Prüfung: 14.11.2012 Sicher zu sein, dass man das glaubt, was man sagt und tut, ist der erste Schritt zur Weisheit. Pam Braun, geb. 1928 I Inhaltsverzeichnis Abkürzungen ........................................................................................................................... III 1 Einleitung ...................................................................................................................... 1 1.1 Krebserkrankungen in Deutschland ............................................................................ 1 1.1.1 Harnblasenkrebs ................................................................................................................ 3 1.1.2 Risikofaktoren für den Harnblasenkrebs ............................................................................ 4 1.2 Vorkommen aromatischer Amine ................................................................................ 7 1.2.1 o-Toluidin im Zigarettenrauch ..................................................................................... 7 1.2.2 Entstehung von o-Toluidin durch Spaltung von Azofarbstoffen ................................. 8 1.2.3 o-Toluidin aus Pharmazeutika ..................................................................................... 8 1.2.4 4-Aminobiphenyl ......................................................................................................... 8 1.3 Toxizität der aromatischen Amine ........................................................................... 9 1.4 Toxikokinetik der aromatischen Amine .................................................................. 9 1.4.1 Cytochrom-P450-Monooxygenasen .......................................................................... 11 1.4.2 N-Acetyltransferasen ................................................................................................. 11 1.4.3 Metabolisierung der aromatischen Amine ................................................................. 12 1.5 Kanzerogenese .......................................................................................................... 14 1.6 Erkennung, Überwachung und Bewertung von Krebsrisiken durch humanes Biomonitoring ........................................................................................................... 15 1.6.1 Bestimmung des Rauchstatus durch Biomonitoring .................................................. 17 1.6.2 DNA-Addukte ............................................................................................................ 19 1.6.2.1 Nachweismethoden von DNA-Addukten ........................................................................ 20 1.6.2.2 DNA-Addukte von 4-ABP und o-Toluidin ..................................................................... 22 1.7 Ziel der Arbeit .......................................................................................................... 22 2 Material und Methoden .................................................................................... 24 2.1 Material ..................................................................................................................... 24 2.1.1 Geräte/Zubehör und Parameter .................................................................................. 24 2.1.2 Materialien ................................................................................................................. 25 2.1.3 Chemikalien ............................................................................................................... 25 2.1.4 Lösungen und Reagenzien ......................................................................................... 26 2.1.4.1 Stammlösungen der internen Standards .......................................................................... 26 2.1.4.2 Stammlösungen der Standards ....................................................................................... 26 2.1.4.3 Sonstige Lösungen ....................................................................................................... 27 2.1.5 Proben ........................................................................................................................ 27 2.1.5.1 Proben der Rechtsmedizin ............................................................................................. 27 2.1.5.2 Proben der Universitätsklinik Regensburg ...................................................................... 28 II 2.2 Methoden .................................................................................................................. 28 2.2.1 Gewinnung von DNA-Addukten aus humanem Blasengewebe ................................ 28 2.2.1.1 Vorbereiten der Gewebe ................................................................................................ 28 2.2.1.2 Isolierung der DNA ...................................................................................................... 28 2.2.1.3 Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration ..................................................... 29 2.2.1.4 Saure Hydrolyse und Isolierung durch Flüssig-Flüssig-Extraktion .................................... 29 2.2.1.5 Derivatisierung der aromatischen Amine ........................................................................ 30 2.2.1.6 Chromatographische Bedingungen ................................................................................. 31 2.2.1.7 Berechnung des Gehaltes an aromatischen Aminen ......................................................... 32 2.2.2 Validierung der Methoden ......................................................................................... 33 2.2.2.1 Identifizierung der aromatischen Amine in der GC/MS ................................................... 33 2.2.2.2 Präzision der GC/MS-Anlage ........................................................................................ 33 2.2.2.3 Bestimmung von Linearität in der GC/MS ...................................................................... 33 2.2.2.4 Präzision und Wiederfindung in der Bestimmung der DNA-Addukte ............................... 34 2.3 Bestimmung der Tabakalkaloide in Urin und Zehennägeln ................................ 34 2.4 Statistische Auswertung der Daten ........................................................................ 35 3 Ergebnisse .............................................................................................................. 36 3.1 GC/MS-Analyse und Parameter ............................................................................. 36 3.1.1 Identifizierung der aromatischen Amine .................................................................... 36 3.1.2 Überprüfung der Präzision der GC/MS Anlage ......................................................... 37 3.1.3 Bestimmung der Linearität und Wiederfindungsrate ................................................. 37 3.1.4 Methodenvalidierung für DNA-Addukte aus Gewebeproben ................................... 38 3.2 Demographische Daten und Raucherstatus .......................................................... 39 3.2.1 Proben von Sektionen aus der Rechtsmedizin ........................................................... 39 3.2.2 Proben von Tumorpatienten aus Regensburg ............................................................ 42 3.3 Bestimmung der DNA-Addukte ............................................................................. 43 4 Diskussion .............................................................................................................. 50 5 Zusammenfassung .............................................................................................. 57 6 Literaturverzeichnis ........................................................................................... 59 III Abkürzungen ABP Aminobiphenyl ADI Acceptable Daily Intake BG Berufsgenossenschaft CYP Cytochrom-P -Enzyme 450 dd doppeldestilliert DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft DCM Dichlormethan DNA Desoxyribonukleinsäure GC Gaschromatographie Hb Hämoglobin HBM Humanes Biomonitoring HFBA Heptafluorbuttersäureanhydrid HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie IARC International Agency for Research on Cancer IST Interner Standard HFBA Heptafluorbuttersäureanhydrid HWZ Halbwertszeit LA Lokalanästhetikum MAK maximale Arbeitsplatzkonzentration MetHb Methämoglobin MW arithmetischer Mittelwert MS Massenspektroskopie NAT N-Acetyltransferase NCI Negativ chemische Ionisierung NR Nichtraucher p.a. pro analyse PP Polypropylen R Raucher RKI Robert-Koch-Institut SD Standardabweichung vom arithmetischen Mittelwert (standard deviation) SE Standardfehler (standard error) S/N Signal-Rausch-Verhältnis in den Chromatogrammen (signal/noise) s.s. supra solve Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Krebserkrankungen in Deutschland Nach wie vor stehen Krebserkrankungen als Todesursache in Deutschland mit an vorderster Stelle. Sie sind nach den Erkrankungen des Kreislaufsystems die zweithäufigste Todesursache für beide Geschlechter. Bei 26% (ca. 216.000 Personen) aller Todesfälle, also jedem vierten Sterbefall, wurden 2008 in Deutschland Tumoren als Ursache festgestellt. Dabei ist der Anteil bei Männern mit 29,2% etwas höher als bei Frauen mit 22,3% [1] (Abb. 1-1). Männer Frauen Sonstige Sonstige 17% Unfälle Unfälle 18% 5% 3% Verdaungs- Kreislaufsystem Verdaungs- organe Kreislaufsystem 5% 37% organe 43% 5% Atmungsorgane 8% Atmungsorgane 7% Krebs Krebs 29% 24% Abb. 1-1: Todesursachen in Deutschland 2008: Prozentualer Anteil an allen Todesfällen (modi- fiziert nach Becker und Wahrendorf [1]) Bei Männern ist der Lungenkrebs mit 25,9% aller Tumoren die häufigste zum Tode führende Krebskrankheit, bei Frauen ist das mit 19,4% der Brustkrebs (Abb. 1-2). Lange Zeit war bei beiden Geschlechtern der Darmkrebs mit 10-12% die zweithäufigste Krebstodesursache. Erst in den letzten Jahren wurde er bei Frauen vom stark zunehmenden Lungenkrebs überholt (Abb. 1-3), der 2008 mit 15,2% den zweiten Rang einnimmt. Bei Männern hingegen haben die Todesfälle durch Lungenkrebs in den 1980er Jahren ein Plateau erreicht und nehmen seit 1990 deutlich ab. Der Prostatakrebs rangiert bei Männern als Todesursache an dritter Stelle aller Krebserkrankungen, der weitgehend therapieresistente Krebs der Bauchspeicheldrüse bei beiden Geschlechtern an vierter Stelle. Den auffälligsten Rückgang als Todesursache ver- zeichnet der Magenkrebs, der bei Männern an fünfter und bei Frauen nur mehr an sechster Stelle liegt. Einleitung 2 Abb. 1-2: Die 20 häufigsten Krebstodesursachen in Deutschland 2008: Altersstandardisierte Mortalitätsraten und prozentualer Anteil an allen Krebsneuerkrankungen (aus Becker und Wahrendorf [1]). Abb. 1-3: Entwicklung der standardisierten Mortalitätsraten für die 5 (Männer) und 6 (Frauen) häufigsten Krebstodesursachen in Deutschland (aus Becker und Wahrendorf [1]). Einleitung 3 Die altersbereinigte Sterblichkeit an bösartigen Neubildungen geht in Deutschland bei Frauen bereits ab den 1950er Jahren kontinuierlich zurück. Seit 1990 ist auch für Männer dieser rückläufige Trend zu beobachten (Abb. 1-4). Trotzdem steigt, bedingt durch die zunehmende Lebenserwartung, die Anzahl der Jahr für Jahr an Krebs versterbenden Personen bei beiden Geschlechtern weiter an. Allerdings deutet sich in den letzten Jahren auch hier eine Verlang- samung an. Wenn sich auf dem Gebiet der Krebsprävention in der nächsten Zeit keine ähnlich durchschlagenden Erfolge einstellen wie bei den Erkankungen des Kreislaufsystems, wird Krebs in 15-20 Jahren die Todesursache Nummer Eins in Deutschland sein [1]. Abb. 1-4: Altersbereinigte Sterblichkeitsrate in Deutschland (aus Becker und Wahrendorf [1]). 1.1.1 Harnblasenkrebs Tumoren der Harnblase sind in Deutschland derzeit bei Männern dreimal häufiger als bei Frauen. Wie beim Lungenkrebs nahmen die Todesfälle durch Harnblasenkrebs seit 1990 bei Männern stark ab, bei Frauen zeigt sich bislang nur eine schwache Tendenz zur Abnahme (Abb. 1-5) Einleitung 4 Abb. 1-5: Entwicklung der standardisierten Mortalitätsraten für Harnblasenkrebs in Deutsch- land (aus Becker und Wahrendorf [1]). Nach der Gesundheitsberichterstattung des RKI erkranken einer von 23 Männern und eine von 62 Frauen im Laufe ihres Lebens an Harnblasenkrebs, allerdings zumeist erst im höheren Lebensalter: Das mittlere Erkrankungsalter liegt für Männer mit 72 und für Frauen mit 74 Jahren vergleichsweise hoch [2]. Im Jahr 2006 erkrankten 27.410 Menschen in Deutschland an Harnblasenkrebs, davon 19.360 Männer und 8.480 Frauen. Für die noch nicht vorliegenden Daten von 2010 wurden in diesem Bericht fast 30.000 Erkrankungen vorhergesagt. Die deut- lich geringere Zahl an Sterbefällen durch Harnblasenkrebs, 5.442 (19,8% der Neuerkrankun- gen) in 2006, zeigt die relativ günstigen Überlebenschancen für die Gesamtheit dieser Tumo- ren, die in diesem Maße nicht für die bösartigen Neubildungen der Harnblase gilt, bei denen es sich fast immer um Urothelkarzinome handelt, die auch als Transitionalzellkarzinome (Übergangszellkarzinome) bezeichnet werden. Sehr viel seltener sind Plattenepithelkarzinome oder Adenokarzinome der Harnblase.