TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HERC2 GEN POLİMORFİZMİNİN GÖZ RENGİ ÜZERİNE ETKİSİ Yasemin KARTAL DİSİPLİNLERARASI ADLİ BİLİMLER ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Doç. Dr. Zeliha KAYAALTI 2012- ANKARA TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HERC2 GEN POLİMORFİZMİNİN GÖZ RENGİ ÜZERİNE ETKİSİ Yasemin KARTAL DİSİPLİNLERARASI ADLİ BİLİMLER ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Doç. Dr Zeliha KAYAALTI 2012-ANKARA iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay ii İçindekiler iii Önsöz vi Simgeler ve Kısaltmalar vii Şekiller viii Çizelgeler x 1. GİRİŞ 1 1.1. Göz (Organum Visuale) 1 1.1.1. Gözün Anatomisi 1 1.2. İnsan Pigmentasyonu ve Genetik Temeli 3 1.2.1. Melanin Pigmenti 3 1.3. İris Fenotipi ve Pigment Dağılımı 6 1.4. Genotip Fenotip İlişkisi ve İnsan Göz Rengi 8 1.5. OCA2 (Oculocutaneus Albinism II) 11 1.6. HERC2 (Hect domain and RCC1-like domain-containing protein 2) 12 1.7. DNA ( Deoksiribonükleik asit) 15 1.7.1. Genetik Polimorfizm 15 1.7.1.1. Polimorfizm Çeşitleri 16 1.7.1.1.1. Tek Nükleotid Değişimi (Single Nucleotide Polymorphism:SNP) 16 1.8. DNA İzolasyonu 19 1.8.1. Fenol Kloroform İzolasyonu 19 1.9. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction:PCR) 21 1.9.1. PCR’ın Aşamaları 22 1.9.2. Standart PCR Bileşenleri 24 1.9.3. Primerlerin Seçimi 25 1.10. Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 26 1.10.1. Restriksiyon Endonükleaz (RE) Sınıflandırılması 28 iv 1.11.Gen Eksprsyonu 29 2. GEREÇ VE YÖNTEM 32 2.1. Gereçler 32 2.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler 32 2.1.2. Kullanılan Araç ve Gereçler 33 2.1.3. Deney Protokolü 34 2.1.3.1. Çalışma Grubunun Seçilmesi 34 2.1.3.2. Çalışma ve Kontrol Grubundan Biyolojik Materyalin Toplanması 34 2.1.4. Yöntem 34 2.1.4.1. Göz Renginin Oluşmasında Etkili Olan HERC2 Genindeki A→G Polimorfizminin Belirlenmesi 35 2.1.4.1.1. Yöntemde Kullanılan Çözeltiler 35 2.1.4.2. HERC2 Gen Polimorfizminin Genotipinin Belirlenmesi 36 2.1.4.2.1. Svab Örneklerinden DNA İzolasyonu 36 2.1.4.2.2. Genomik DNA’nın Agaroz Jel Elektroforezi ile Belirlenmesi ve %0.5’lik Agaroz Jel Hazırlanması 38 2.1.4.2.2.1. Agaroz Jel’e Yüklemek İçin Örnek Hazırlanması ve Yürütme Koşulları 39 2.1.4.2.3. PCR 40 2.1.4.2.3.1. Primer Listesi 40 2.1.4.2.3.2. PCR Bileşenleri ve PCR Programı 41 2.1.4.2.3.3. PCR Ürünlerinin Jele Uygulanması ve Elektroforez 43 2.1.4.2.4. PCR Ürünlerinin Restriksiyon Enzimi ile Kesilmesi (RFLP) 43 2.1.4.2.4.1. Kullanılan Kesim Koşulları 43 2.1.4.2.4.2. Kesim Ürünlerinin Agaroz Jel Elektroforezine Uygulanması ve Genotip Tayini 44 2.1.5. İstatistiksel Analiz Yöntemi 44 v 3.BULGULAR 45 3.1. HERC2 Genindeki A→G Polimorfizmini Belirlemek Amacıyla Yapılan Analiz Sonuçları 45 3.1.1. Genomik DNA’nın Agaroz Jel Elektroforezi ile Belirlenmesinin Sonuçları 46 3.1.2. PCR Reaksiyonu ile HERC2 Geninin Amplifikasyon Sonuçları 46 3.1.3. DraI Restriksiyon Enzimi ile Amplifiye Edilen Bölgenin Kesim Sonuçları 48 3.1.3.1. DNA Örneklerinin Genotiplendirilmesi 49 3.1.3.2. "A\A" Genotipli Homozigot Tipik Bireyler 50 3.1.3.3. "G\G" Genotipli Homozigot Atipik Bireyler 51 3.1.3.4. "A\G" Genotipli Heterozigot Bireyler 52 3.2. HERC2 Gen Polimorfizminin Araştırıldığı Açık Göz Rengine Sahip Çocuklar ile Bu Çocukların Anne ve Babalarından Oluşan Bireylerin Fenotipik ve Genotipik Açıdan Değerlendirilmesi 54 3.2.1. Açık Göz Renginin Kalıtımında, Anne ve Babanın Fenotipik Etkisinin, Çocuklardaki Fenotipik Özellik Üzerine Etkisinin Değerlendirilmesi 54 3.2.2. Açık Göz Rengine Sahip Çocuklar ile Anne ve Babalarının Genotip Frekanslarının Dağılımı 55 3.2.3. Tüm Populasyondaki Fenotip-Genotip İlişkisi 56 3.2.4. Anne, Baba ve Çocuklardaki Genotip-Fenotip İlişkisi 58 3.2.5. Çocuk Fenotipi ile Anne ve Baba Fenotipi Arasındaki İlişki 61 3.2.6. Çocuk Genotipi ile Anne ve Baba Fenotipi Arasındaki İlişki 63 3.2.7. Çalıştığımız Populasyonun Hardy-Weinberg Dengesinin Tespiti 65 4. TARTIŞMA 66 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 71 ÖZET 73 SUMMARY 74 KAYNAKLAR 75 EKLER 91 Ek-1 91 ÖZGEÇMİŞ 93 vi ÖNSÖZ Adli yönden, olay yerinde bulunan biyolojik örneklerin analizi ile suçluya ulaşılması son yıllarda oldukça önem kazanmıştır. Göz rengi bireylerin belirgin fiziksel özelliklerinden birisi olduğundan, toplumumuzda göz rengini belirleyen genlerdeki polimorfizmlerle ilgili veri tabanı oluşturulması önemlidir. Bu çalışmada; toplumumuzda göz rengini belirleyen kalıtsal özelliklerin dağılımının belirlenmesi amacıyla gözleri açık renkli olan bireyler ile anne ve babalarının HERC2 genotiplerinin araştırılması hedeflenmiştir. Tez konusu seçiminde, tezimin hazırlanmasında yol gösteren, karşılaşılan sorunların çözümünde bilimsel ve sosyal desteğini her zaman yanımda hissettiğim hocam Sayın Prof. Dr. Tülin SÖYLEMEZOĞLU’na, Çalışmalarıma yön veren, her türlü sorunda desteğini ve yardımını her zaman hissettiğim, araştırmaların ve deneylerin yürütülmesinde yardımlarını esirgemeyen, yetişmemi sağlayan danışmanım, sevgili hocam Sayın Doç. Dr. Zeliha KAYAALTI’na, Gerek lisans gerekse lisans sonrası eğitimimde desteğini ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Zeki AYTAÇ’a, Üstün başarılı genç bilim insanlarını destekleyen ve teşvik eden, toplumda bilim ve teknoloji kültürünün oluşmasına yardımcı olan TÜBİTAK kurumuna, yüksek lisans programım boyunca verdiği maddi desteklerden dolayı, Örneklerin analizleri için hazırlanmasında emeği geçen, dostluğu ve yardımıyla her zaman yanımda olduğunu hissettiğim Yrd. Doç. Dr. Ayşegül BACAKSIZ ve Dr. Bio. Dilek KAYA’ya, Tezim için gerekli olan biyolojik materyallerin toplanması aşamasındaki yardımlarından dolayı Seher Asena GÜLPINAR, Onur DİNEK ve diğer tüm arkadaşlarıma, Anlayış ve desteğini hiçbir zaman esirgemeyen canım yeğenim Sevilay Dilara ÖZBEK’e sonsuz sevgi ve teşekkürlerimi sunarım. vii SİMGELER VE KISALTMALAR A Adenin bp Baz çifti (Base pair) C Sitozin DNA Deoksiribonükleik asit dNTP Deoksiribonükleozidtrifosfat DTT Dithiothreitol EDTA Etilen diamin tetraasetik asit F primer Forward Primer g Gram G Guanin M Molarite mg Miligram ml Mililitre mM Milimolar NaCl Sodyumklorür PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction) R primer Reverse Primer RE Restriksiyon Endonükleaz RFLP Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi RNA Ribonükleik Asit SDS Sodyum Dodesil Sülfat SNP Tek Nükleotid Polimorfizm (Single Nucleotid Polymorphism) T Timin TBE Tris-Borik asit-EDTA TE Tris-EDTA U Urasil μg/ml Mikrogram/mililitre μl Mikrolitre viii ŞEKİLLER Şekil.1.1. Gözün anatomisi 1 Şekil.1.2. Ömelaninin yapısal formülü 4 Şekil.1.3. Feomelaninin yapısal formülü 4 Şekil.1.4. Gözün uveal sisteminin bir parçası olan iris 7 Şekil.1.5. Genotip ve fenotip 9 Şekil.1.6. Göz rengi skalası 10 Şekil.1.7. OCA2 geni 11 Şekil.1.8. HERC2 geni 12 Şekil.1.9. Tek Nükleotid Değişimi (Single Nucleotide Polymorphism: SNP) 16 Şekil.1.10. Transisyon 17 Şekil.1.11. Transversiyon 17 Şekil.1.12. İnsersiyon 18 Şekil.1.13. Delesyon 18 Şekil.1.14. DNA izolasyonu 20 Şekil.1.15. PCR basamakları 23 Şekil.1.16. Taq DNA Polimeraz enzimi 24 Şekil.1.17. RFLP tekniği ile canlılar arasındaki genetik farklılığın tespiti 27 Şekil.1.18. Gen ekspresyonu 29 Şekil.1.19. Gen sentezi başlama aşamasının şematik gösterimi 31 Şekil.2.1. Agaroz jel kuyucuklarına örneklerin yüklenmesi 39 Şekil.2.2. PCR ile çoğaltılan 226bp’lik baz dizilimi, HERC2-F ve HERC2-R primerleri 42 Şekil.3.1. Çalışmadaki bireylerin dağılımı 45 Şekil.3.2. Amplifikasyonunun jel görüntüsü 48 Şekil.3.3. DraI restriksiyon enziminin tanıma bölgesi ve kesim ürünlerinin şematik gösterimi 49 Şekil.3.4. 226 bp’lik amplifikasyon ürününün homozigot tipik bireylerde, DraI enzimi ile kesim sonucunda oluşan oligonükleotid uzunlukları 50 Şekil.3.5. 226 bp’lik amplifikasyon ürününün homozigot atipik bireylerde oluşan oligonükleotid uzunlukları 51 ix Şekil.3.6. 226 bp’lik amplifikasyon ürününün heterozigot bireylerde oluşan oligonükleotid uzunlukları 52 Şekil.3.7. Tüm populasyondaki fenotip-genotip ilişkisi 58 Şekil.3.8. Populasyonda yer alan annelerin genotip-fenotip ilişkisi 60 Şekil.3.9. Populasyonda yer alan babaların genotip-fenotip ilişkisi 60 Şekil.3.10. Populasyonda yer alan çocukların genotip-fenotip ilişkisi 61 Şekil.3.11. Çocuk fenotipi ile anne ve baba fenotipi arasındaki ilişki 63 Şekil.3.12. Çocuk genotipi ile anne ve baba fenotipi arasındaki ilişki 65 Şekil.4.1. OCA2 gen ekspresyonu 68