Opinnäytetyö (AMK) Bioanalytiikka koulutusohjelma NBIOAK14 2017 Ilona Uotila ja Laura Valli GROCOTT- JA ZIEHL- NEELSEN-VÄRJÄYKSIEN TESTAUS ARTISAN LINK - ERIKOISVÄRJÄYS- AUTOMAATILLA OPINNÄYTETYÖ (AMK) | TIIVISTELMÄ TURUN AMMATTIKORKEAKOULU Bioanalytiikan koulutusohjelma | Patologia 2017 | 38 + 9 Ilona Uotila ja Laura Valli GROCOTT- JA ZIEHL-NEELSEN-VÄRJÄYKSIEN TESTAUS ARTISAN LINK - ERIKOISVÄRJÄYSAUTOMAATILLA Patologia on lääketieteen erikoisala, jossa tutkitaan solu- ja kudosmuutoksia. Värjäysmenetelmien avulla saadaan näkyviin solujen ja kudosten rakenteet, jotka tutkitaan mikroskooppisesti. Perusvärjäyksien lisäksi tehdään erikoisvärjäyksiä, joilla saadaan varmistettua tai täydennettyä diagnoosia. Tässä opinnäytetyössä käsitellään kahta erikoisvärjäystä. Värjäyksissä käytetään erilaisia terveydelle haitallisia tai vaarallisia kemikaaleja, joille altistumista tulisi välttää. Opinnäytetyö tehtiin TYKS-SAPA-liikelaitoksen patologian palvelualueen laboratoriolle. Tutkimuksen tarkoituksena oli testata, voidaanko sytologian laboratoriossa käsin tehtävä Grocott- värjäys ja histologian laboratoriossa käsin tehtävä Ziehl-Neelsen-värjäys siirtää Artisan Link - erikoisvärjäysautomaatille. Tavoitteena oli automaatioon siirtymisen myötä helpottaa työntekijöiden työtehtäviä ja parantaa työturvallisuutta vähentämällä työntekijöiden kontakteja käsivärjäyksissä käytettävien terveydelle vaarallisten tai haitallisten kemikaalien kanssa. Tutkimus toteutettiin keväällä 2017 histologian laboratoriossa. Grocott-värjäyksen näytemateriaalina oli bronkoalveolaariset lavaationäytteet (BAL) ja Ziehl-Neelsen-värjäyksen näytemateriaali koostui keuhkokudosleikkeistä. Molempia värjäyksiä testattiin Artisan Link - erikoisvärjäysautomaatilla kolmella eri ohjelmalla, jotta löydettiin parhaat inkubaatioajat ja huuhtelujen lukumäärät. Automaattivärjäyksien laatua verrattiin lopuksi aikaisemmin tehtyihin käsivärjäyksiin. Tutkimustulosten perusteella sytologinen Grocott-värjäys toimi Artisan Link - erikoisvärjäysautomaatilla ja se on tarkoituksena ottaa käyttöön käsivärjäyksen tilalle TYKS- SAPA-liikelaitoksen patologian palvelualueen laboratoriossa. Histologinen Ziehl-Neelsen-värjäys ei ollut tarpeeksi luotettava automaattimenetelmällä, eikä sitä vielä oteta käyttöön laboratoriossa. ASIASANAT: sytologia, histologia, Grocott-värjäys, Ziehl-Neelsen-värjäys BACHELOR´S THESIS | ABSTRACT TURKU UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES Degree programme in Biomediacal laboratory science | Pathology 2017 | 38 + 9 Ilona Uotila and Laura Valli TESTING OF GROCOTT- AND ZIEHL-NEELSEN STAININGS WITH ARTISAN LINK SPECIAL STAINING SYSTEM Pathology is a medical specialty that studies cell and tissue changes. Different staining methods are used to make the structure of cells and tissues visible and they are examined with a microscope. In addition to the most common staining methods there are special staining methods that are used to confirm and complete diagnosis. In this bachelor’s thesis two special staining methods were tested. Some chemicals that are used in staining methods are harmful or dangerous for human health and exposure for these chemicals should be avoided. This thesis was made for service division of pathology of public utility Tyks-Sapa. The purpose of this thesis was to test if it is possible to replace the cytological Grocott hand staining and histological Ziehl-Neelsen hand staining with Artisan Link special staining system. The aim of this thesis was to simplify the duties of the employees and to improve occupational safety by decreasing contacts with harmful or dangerous chemicals that are used in hand staining methods. The staining methods of this thesis were carried out in the spring of 2017 in histology laboratory. The sample material of Grocott staining consisted of bronchoalveolar lavage samples (BAL) and the sample material of Ziehl-Neelsen staining was lung tissue. Both stainings were tested with Artisan Link special staining system with three different programmes so that the best incubation times and amount of rinses were found. Finally, the quality of the automatic stainings were compared with handmade stainings that were made earlier. Based on the results of this thesis cytological Grocott staining was functional with Artisan Link special staining system and this method will be introduced in the laboratory instead of hand staining method. Histological Ziehl-Neelsen staining wasn’t reliable enough with the automatic method and won’t be introduced yet in the laboratory. KEYWORDS: cytology, histology, Grocott staining, Ziehl-Neelsen staining SISÄLTÖ 1 JOHDANTO 6 2 PATOLOGIAN ERIKOISVÄRJÄYKSIÄ 7 2.1 Sytologia 7 2.1.1 Näytemateriaali ja diagnostiikka 7 2.1.2 Bronkoalveolaarinen lavaationäyte (BAL) 9 2.1.3 Yleisimmät värjäykset 9 2.2 Histologia 10 2.2.1 Näytemateriaali ja diagnostiikka 10 2.2.2 Kudosleike 12 2.2.3 Yleisimmät värjäykset 12 2.3 Grocott-värjäys 13 2.4 Ziehl-Neelsen-värjäys 14 2.5 Työturvallisuus 14 2.6 Artisan Link -erikoisvärjäysautomaatti 16 3 OPINNÄYTETYÖN TARKOITUS, TAVOITE JA TUTKIMUSTEHTÄVÄT 18 4 OPINNÄYTETYÖN KÄYTÄNNÖN TOTEUTUS 19 4.1 Grocott-värjäyksen käytännön toteutus 19 4.2 Ziehl-Neelsen-värjäyksen käytännön toteutus 21 4.3 Opinnäytetyön metodologiset lähtökohdat 23 4.4 Opinnäytetyön eettisten näkökohtien tarkastelu 23 5 TUTKIMUSTULOKSET JA NIIDEN TARKASTELU 25 5.1 Grocott-värjäys 25 5.2 Ziehl-Neelsen-värjäys 30 6 POHDINTA 33 LÄHTEET 35 LIITTEET Liite 1. Rekisteritutkimuksen/laatuhankkeen lupahakemus Liite 2. Grocott-värjäyksen 1. ohjelma Liite 3. Grocott-värjäyksen 2. ohjelma Liite 4. Grocott-värjäyksen 3. ohjelma Liite 5. Ziehl-Neelsen-värjäyksen 1. ohjelma Liite 6. Ziehl-Neelsen-värjäyksen 2. ohjelma Liite 7. Ziehl-Neelsen-värjäyksen 3. ohjelma KUVAT Kuva 1. Artisan Link -erikoisvärjäysautomaatti (Agilent 2017a). 17 Kuva 2. Grocott-käsivärjäys, näyte 1. 25 Kuva 3. Grocott-värjäys automaatilla, näyte 1, ohjelma 1. 26 Kuva 4. Grocott-värjäys automaatilla, näyte 3, ohjelma 1. 26 Kuva 5. Grocott-värjäys automaatilla, näyte 4, ohjelma 1. 26 Kuva 6. Grocott-värjäys automaatilla, näyte 5, ohjelma 1. 27 Kuva 7. Grocott-värjäys automaatilla, näyte 1, ohjelma 2. 27 Kuva 8. Grocott-värjäys automaatilla, näyte 2, ohjelma 2. 28 Kuva 9. Grocott-värjäys automaatilla, näyte 1, ohjelma 3. 28 Kuva 10. Grocott-värjäys automaatilla, näyte 3, ohjelma 3. 29 Kuva 11. Grocott-värjäys automaatilla, näyte 6, ohjelma 3. 29 Kuva 12. Grocott-värjäys automaatilla, näyte 7, ohjelma 3. 29 Kuva 13. Ziehl-Neelsen-käsivärjäyksen vertailu automaattimenetelmään, näyte 3. 30 Kuva 14. Ziehl-Neelsen-värjäys automaatilla, näyte 1, ohjelma 1. 30 Kuva 15. Ziehl-Neelsen-värjäys automaatilla, näyte 6, ohjelma 1. 31 Kuva 16. Ziehl-Neelsen-värjäys automaatilla, näyte 1, ohjelma 2. 31 Kuva 17. Ziehl-Neelsen-värjäys automaatilla, näyte 1, ohjelma 3. 32 Kuva 18. Ziehl-Neelsen-värjäys automaatilla, näyte 6, ohjelma 3. 32 TAULUKOT Taulukko 1. Grocott-värjäyksen näytteet. 20 Taulukko 2. Grocott-värjäyksen ohjelmien inkubaatioajat. 20 Taulukko 3. Ziehl-Neelsen-värjäyksen näytteet. 21 Taulukko 4. Ziehl-Neelsen-värjäyksen ohjelmien inkubaatioajat ja huuhtelujen lukumäärät. 22 6 1 JOHDANTO Patologia on lääketieteen erikoisala, jossa kuvataan ja tunnistetaan sairauksia ja selvi- tetään niiden syitä. Tämä perustuu solu- ja kudosmuutosten tutkimiseen. Erilaisten vär- jäysmenetelmien avulla saadaan näkyviin solujen ja kudosten rakenteet, jotka tutkitaan mikroskooppisesti. (Karttunen ym. 2005.) Solunäytteet värjätään Papanicolaoun mene- telmällä (Klemi & Stenbäck 2012a) ja kudosnäytteet värjätään yleisimmin hematoksyliini- eosiini (HE) menetelmällä. Lisäksi voidaan tehdä erikoisvärjäyksiä, joilla saadaan var- mistettua tai täydennettyä diagnoosia. (Mäkinen 2012a.) Tässä opinnäytetyössä testa- taan Grocott- ja Ziehl Neelsen-erikoisvärjäykset Artisan Link -erikoisvärjäysautomaatilla. Värjäyksissä käytetään erilaisia kemikaaleja, joista lähes kaikki ovat haitallisia tervey- delle (Kirjavainen 2013). Työturvallisuuden takaamiseksi kemikaaleille altistumista tulisi välttää (Työturvallisuuslaki 738/2002; Kemikaalilaki 599/2013). Grocott-käsivärjäyk- sessä käytetään haitalliseksi luokiteltuja kemikaaleja, kuten kromihappoa, hopeanitraat- tia ja natriummetabisulfiittia, joista kromihappo aiheuttaa syöpää hengitettynä (Hirsimäki 1999a). Ziehl-Neelsen-käsivärjäyksessä käytetään myrkyllistä fenolia ja haitallista light green-väriliuosta, jonka epäillään aiheuttavan syöpää (Hirsimäki 1995). Värjäysauto- maatin etuja ovat työturvallisuus, tasalaatuisuus ja työtehtävien helpottaminen (Kirjavai- nen 2013). Tämän opinnäytetyön tarkoituksena on testata, voidaanko käsivärjäykset Grocott ja Ziehl-Neelsen siirtää Artisan Link -erikoisvärjäysautomaatille. Tutkimus tehdään TYKS- SAPA-liikelaitoksen patologian palvelualueen laboratoriolle. Tämän opinnäytetyön ta- voitteena on automaatioon siirtyminen, koska se parantaa työturvallisuutta ja tasalaatui- suutta, vähentää inhimillisiä virheitä ja helpottaa työntekijöiden työtehtäviä. TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ | Ilona Uotila ja Laura Valli 7 2 PATOLOGIAN ERIKOISVÄRJÄYKSIÄ Patologia eli tautioppi muodostaa lääketieteen perustan, koska sitä käytetään taudin- määrityksessä, tautien hoidossa, seurannassa ja ehkäisyssä. Patologian tarkoituksena on kuvata ja tunnistaa tautien syitä eli etiologisia tekijöitä ja selvittää miten taudit synty- vät. Tämä perustuu solujen ja kudosten makroskooppiseen ja mikroskooppiseen tutki- miseen. (Karttunen 2005.) Solujen ja kudosten rakenteet saadaan näkyviin erilaisten vär- jäysmenetelmien avulla (Karttunen & Vuopala 2005). Patologian alueisiin kuuluu solu- ja kudosoppi sekä ruumiinavauspatologia (Karttunen 2005). 2.1 Sytologia Sytologia eli soluoppi on solujen ja niiden rakenneosien tutkimista, joka tuli mahdolliseksi mikroskoopin keksimisen myötä 1600-luvulla (Koivuniemi & Stenbäck 1994). Mikro- skooppinen tautidiagnostiikka alkoi kehittyä kuitenkin vasta 1800-luvulla. Vuonna 1917 George Nicolas Papanicolaou ja hänen työtoverinsa aloittivat tutkimus- ja julkaisutoimin- nan, jonka myötä sytologian diagnostiikka sai perustan ja laajemman kliinisen merkityk- sen. (Klemi & Stenbäck 2012b.) Sytologiasta tuli osa patologian diagnostiikkaa varsinai- sesti 1960-luvulla (Kholová 2015). 2.1.1 Näytemateriaali ja diagnostiikka Sytologian diagnostiset menetelmät ovat nopeita, yksinkertaisia ja taloudellisia (Koivu- niemi & Stenbäck 1994; Klemi & Stenbäck 2012b). Sytologisia tutkimuksia käytetään epäiltäessä kasvainta, varhaisdiagnostiikassa, sekä potilaan hoidon seurannassa eri hoitomenetelmien vaikutusta arvioitaessa. Sytologinen tutkimus on hyödyllinen myös, jos koepalaa on vaikeaa tai mahdotonta ottaa komplikaatioiden vaaran tai teknisten syi- den takia. Sytologisten tutkimuksen virheitä voivat olla epävarmat tulkinnat, väärät ne- gatiiviset ja väärät positiiviset löydökset, jotka johtuvat tulkintavirheistä tai -vaikeuksista. Diagnostiikan onnistumiseen vaikuttavat näytteenotto, näytteen valmistus, sekä sytolo- gin ja esitarkastajan pätevyys. Sytologisten tutkimusten hyöty on silti osoittautunut huo- mattavaksi kliinisessä mikroskooppisessa diagnostiikassa. (Koivuniemi & Stenbäck 1994.) TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ | Ilona Uotila ja Laura Valli 8 Kehon kaikkia pintoja peittää kalvo, joka muodostuu pintasoluista. Ne kuluvat ja uusiu- tuvat fysiologisesti jatkuvasti. Sytologisessa diagnostiikassa käytetään kullekin elimelle tyypillisiä soluja, jotka irtoavat eritteisiin itsestään tai joita irrotetaan mekaanisesti kalvon pinnalta. Pintasolut jaetaan muun muassa levy-, lieriö- ja kuutioepiteeliin, sekä välimuo- toiseen epiteeliin, mesoteeliin ja endoteeliin. (Koivuniemi & Stenbäck 1994.) Soluja ir- toaa enemmän kasvaimista ja tulehtuneilta pinnoilta kuin terveiltä pinnoilta, josta on hyö- tyä diagnosoinnissa (Karttunen & Vuopala 2005). Sytologisia näytteitä voidaan ottaa monella eri tapaa. Irtosolunäytteitä otetaan esimer- kiksi kohdunkaulasta, emättimestä, kohdun kaulaosasta, suuontelosta, ysköksistä ja virt- soista. Imunäytteitä saadaan hengitysteiden ja ruuansulatuskanavan limakalvoilta tähys- tyksen eli endoskopian avulla. Huuhtelunäytteitä otetaan esimerkiksi ruoansulatuskana- vasta, keuhkoputkista ja virtsateistä. Huuhtelu voidaan tehdä pelkällä letkulla tai tähys- tyksessä, jonka hyöty on suunnata huuhtelu suoraan epäiltyyn kohteeseen. Kaapimis- näytteitä ja harjairtosolunäytteitä otetaan yleensä ruoansulatuskanavasta, suuontelosta, kurkunpäästä, keuhkoputkista ja kohdun kaulaosasta. Punktionäytteitä otetaan sisäeli- miä ympäröivistä onteloista, esimerkiksi perikardium-, abdominaali-, pleura- ja nivelon- teloista, sekä myös patologisista onteloista kuten kystoista. Punktionäytteiden ottami- seen käytetään neulaa tai ruiskua. Ohutneulabiopsiassa ohuella neulalla tai ruiskulla imetään solumateriaalia ja kudoksen kappaleita elimen tai kudoksen epäilyttävästä muu- toksesta. (Koivuniemi & Stenbäck 1994; Klemi & Stenbäck 2012c.) Sytologian maligniteettidiagnoosi perustuu solumuutoksiin, joista tärkeimpiä ovat tuma- muutokset. Tumamuutoksia ovat esimerkiksi tumakoon vaihtelu, monitumaisuus ja kro- matiinin rakenteen muutokset. Muutoksia voi ilmetä myös sytoplasmassa sen muodon ja määrän vaihteluna. Lisäksi muutoksia voi esiintyä tuman ja sytoplasman suhteessa, solun kypsymisessä eli differentaatiossa ja solujen välisessä koheesiossa. (Koivuniemi & Stenbäck 1994.) Suomessa solunäytteiden vastaamiseen käytetään yleensä Papa- luokitusta (0-5) tai Bethesda järjestelmää. Jos luokka on korkea, tehdään myös löydöstä selventävä lausunto. Edustava näyte ja hyvät esitiedot ovat tärkeitä lopputuloksen kan- nalta. (Klemi & Stenbäck 2012d; Klemi & Stenbäck 2012e.) TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ | Ilona Uotila ja Laura Valli 9 2.1.2 Bronkoalveolaarinen lavaationäyte (BAL) Bronkoalveolaarinen lavaationäyte (BAL) otetaan keuhkohuuhtelumenetelmällä, jolla saadaan alemmista hengitysteistä solunäytteitä ja eritteitä, kuten proteiineja ja mikro- beja. Menetelmän etuina ovat helppous, alhainen komplikaatioiden riski, sekä useat eri analysointimahdollisuudet. (Taskinen 1994.) Onnistuneella BAL-näytteellä voidaan usein välttää keuhkobiopsia. Tavallisimpia tutkimusindikaatioita ovat keuhkosairaudet, kuten keuhkosarkoidoosi, keuhkofibroosi ja erilaiset alveoliitit, sekä infektioiden aiheut- tajat kuten Pneumocystis jirovecii, sienet ja sytomegalovirus. BAL-näytteestä voidaan myös laskea asbestikappaleiden määrä keuhkoissa. (Hirsimäki 1999b.) Tässä opinnäy- tetyössä yhtenä näytemateriaalina käytetään BAL-näytteitä. Huuhtelu tehdään polikliinisesti tähystyksen yhteydessä ja hengitystiet puudutetaan pai- kallisesti. Potilaan keuhkokudokseen ruiskutetaan 10x20 ml keittosuolaliuosta, joka ime- tään takaisin jokaisen ruiskutuksen jälkeen. Lopulliseksi näytemääräksi saadaan yleensä 100-150 ml ja se lähetetään laboratorioon. (Taskinen 1994.) TYKS-SAPA-liike- laitoksen patologian palvelualueen sytologian laboratoriossa fiksoimaton näyte käsitel- lään kahden tunnin sisällä näytteenotosta. Osa BAL-näytteestä fiksoidaan absoluutti- sella etanolilla ja siitä tehdään Cyto-Tek-solusentrifugivalmisteet Papanicolaun (Papa) värjäystä ja rautavärjäystä varten. Jäljelle jäänyt näyte suodatetaan sideharson läpi ja esitarkastaja laskee siitä kokonaissolumäärän. Kokonaissolumäärän avulla valitaan oi- kea näytemäärä erikoisvärjäyksien valmistukseen. Erikoisvärjäyksistä tehdään aina May-Grünwald-Giemsa (MGG) ja pyydettäessä Grocott ja Oil Red O (ORO) ja ne val- mistetaan solusentrifuginäytteistä. Lisäksi niistä voidaan tehdä immunohistokemiallisia värjäyksiä. (Hirsimäki 1999b.) 2.1.3 Yleisimmät värjäykset Sytologisten näytteiden fiksaatio riippuu näytetyypistä ja ottamistavasta (Aho 2000). Papa-näyte fiksoidaan välittömästi 95 % alkoholilla (Kauraniemi & Vuopala 1994) tai suihkemuotoisella isopropyylialkoholilla ja polyetyleeniglykolilla. Muut solunäytteet fik- soidaan 50-70 % etanolilla, jonka etuna on nopea fiksaatio ja näytteen hyvä säilyvyys. Jotkut näytteet ilmakuivataan myöhempää värjäystä varten. Yleisimmät sytologiset vär- jäykset ovat Papanicolaou (Papa) ja May-Grünwald-Giemsa (MGG). (Aho 2000.) Papa- värjäystä käytetään syöpädiagnostiikassa, gynekologisissa sivelyvalmisteissa ja sillä TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ | Ilona Uotila ja Laura Valli 10 voidaan saada tietoa myös infektioista. Menetelmän näytemateriaaleina ovat etanolilla kiinnitetyt sively-, solusentrifugi- ja suodatinvalmisteet. Niiden värjäämisessä käytetään tumavärinä hematoksyliiniä ja sytoplasmaväreinä ovat EA-50 (eosiiniatsuuri) ja OG-6 (orange-G-6-fosfovolframihappo). (Hirsimäki 1997.) MGG-värjäys soveltuu kasvaindiag- nostiikkaan, tulehdussolujen tyypitykseen, sekä luuydin- ja imukudosdiagnostiikkaan. Menetelmässä käytetään ilmakuivattuja sivelyjä, sekä Cytospin-solusentrifuugivalmis- teita. Niiden värjääminen koostuu kahden eri menetelmän yhdistelmästä ja väreinä ovat hapan eosiini, emäksinen metyleenisini ja atsuuriväri. (Hirsimäki 2004.) 2.2 Histologia Histologia eli kudosoppi on kudosten rakenteen ja toiminnan tutkimista valomikroskoopilla. Histologian tutkiminen syntyi 1800- ja 1900-lukujen vaihteessa, kun valomikroskoopit alkoivat kehittyä ja tekniikat ohuiden leikkeiden valmistamiseen syntyivät. Laboratoriovälineistöt ovat kehittyneet viimeisten 20 vuoden aikana paljon. Perusmenetelmät ovat kuitenkin pysyneet samoina. (Stevens & Lowe 2005; Mäkinen 2012b.) 2.2.1 Näytemateriaali ja diagnostiikka Histologisia tutkimuksia käytetään hyvänlaatuisten kasvainten, rappeumasairauksien, infektioiden, aineenvaihdunnan tautien ja muiden tulehdustautien toteamiseen ja luokit- teluun, sekä syöpädiagnostiikassa. Kudosnäytteet voivat olla hyvin erikokoisia, muuta- masta millimetristä kymmeniin senttimetreihin. Näytteen kokoon vaikuttaa muutoksen koko ja poistetun terveen kudoksen määrä. (Karttunen & Vuopala 2005.) Diagnostiikan onnistumiseen vaikuttavat näytteenotto, näytteen valmistaminen laboratoriossa ja pato- login pätevyys. Näytteenotossa on erityisen tärkeää saada edustava näyte ja kirjata esi- tiedot tarkkaan ylös. Lähetetystä materiaalista otetaan tutkimukseen yleensä vain pieni osa mukaan, joten lähettävän lääkärin on merkittävä selkeästi, mitä osaa halutaan tutkia. (Mäkinen 2012b.) Vierekkäin asettuneet solut ja soluväliaine muodostavat kudoksia ja erilaiset kudokset muodostavat yhdessä suurempia toiminnallisia yksiköitä eli elimiä. Elimet voivat koostua monista eri kudostyypeistä ja niiden päätyypit ovat epiteeli-, tuki-, hermo- ja lihaskudos. Epiteelikudosta on muun muassa iholla, limakalvoilla ja elimistön vapailla pinnoilla. Sen TURUN AMK:N OPINNÄYTETYÖ | Ilona Uotila ja Laura Valli