Titre: Formation et caractérisation physico-chimique des complexes Title: ADN/chitosane pour la thérapie génique Auteur: Pei Lian Ma Author: Date: 2010 Type: Mémoire ou thèse / Dissertation or Thesis Ma, P. L. (2010). Formation et caractérisation physico-chimique des complexes Référence: ADN/chitosane pour la thérapie génique [Thèse de doctorat, École Polytechnique Citation: de Montréal]. PolyPublie. https://publications.polymtl.ca/304/ Document en libre accès dans PolyPublie Open Access document in PolyPublie URL de PolyPublie: https://publications.polymtl.ca/304/ PolyPublie URL: Directeurs de recherche: Michael D. Buschmann, & Françoise Winnik Advisors: Programme: Génie chimique Program: Ce fichier a été téléchargé à partir de PolyPublie, le dépôt institutionnel de Polytechnique Montréal This file has been downloaded from PolyPublie, the institutional repository of Polytechnique Montréal https://publications.polymtl.ca UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL FORMATION ET CARACTÉRISATION PHYSICO-CHIMIQUE DES COMPLEXES ADN/CHITOSANE POUR LA THÉRAPIE GÉNIQUE PEI LIAN MA DÉPARTEMENT DE GÉNIE CHIMIQUE ÉCOLE POLYTECHNIQUE DE MONTRÉAL THÈSE PRÉSENTÉE EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLÔME DE PHILOSOPHIAE DOCTOR (Ph. D.) (GÉNIE CHIMIQUE) AVRIL 2010 © Pei Lian Ma, 2010. UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL ÉCOLE POLYTECHNIQUE DE MONTRÉAL Cette thèse intitulée: FORMATION ET CARACTÉRISATION PHYSICO-CHIMIQUE DES COMPLEXES ADN/CHITOSANE POUR LA THÉRAPIE GÉNIQUE présentée par : MA Pei Lian en vue de l’obtention du diplôme de : Philosophiae Doctor a été dûment acceptée par le jury d’examen constitué de : M. FAVIS Basil, Ph. D., président M. BUSCHMANN Michael, Ph. D., membre et directeur de recherche Mme WINNIK Françoise, Ph. D., membre et codirectrice de recherche M. DE CRESCENZO Grégory, Ph. D., membre Mme STRAND Sabina P., Ph. D., membre iii DÉDICACE J’aimerais dédier ce travail à tous les membres de ma famille, avec mes souhaits de bonheur. iv REMERCIEMENTS Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur le professeur Michael Buschmann pour m’avoir donné la chance de rejoindre son groupe de recherche et de continuer mon doctorat suite à mon interruption d’études. Je le remercie également pour la confiance et les moyens qu’il a mis à ma disposition au cours des cinq dernières années dans la réalisation de mon projet de thèse. Je remercie sincèrement ma co-directrice la professeure Françoise Winnik pour son soutien, sa confiance et son aide durant ces dernières années de thèse. Je me rappellerai toujours avec émotion de la première journée où elle m’a accueillie chaleureusement au sein de son groupe de recherche. Je lui suis très reconnaissante de m’avoir recommandée à Mike afin que je puisse poursuivre mes études et réaliser ce projet. Je lui exprime également ma profonde gratitude pour ses conseils avisés et personnels durant les moments les plus difficiles qui nous ont beaucoup rapprochées. J’adresse mes sincères remerciements au professeur Basil Favis pour m’avoir initiée à la recherche et appris l’importance du savoir-faire et du savoir-être. Je lui suis très reconnaissante pour l’amitié et le soutien continuel qu’il m’a témoignés durant ces dernières années. Je tiens également à lui exprimer ma gratitude pour avoir accepté de présider ce jury de thèse. Je remercie également Dr. Strand et Prof. De Crescenzo d’avoir accepté d’évaluer mon travail. Je remercie mes collègues, du passé et présent, du groupe de Mike et de Mme Winnik. Merci en particulier à J-R, Eliza, Satu, Vladimir, Shivaji, Suri, Cyril, Florence S., Sania, Charbel et Piotr. J’apprécie énormément leur amitié, leur solidarité et tous les moments de détente et de fous rires passés ensemble. v Un grand merci à Yuan, Carol, Robert, Jacques et Louise Beaudry du département de génie chimique pour leur aide précieuse durant ces dernières années. Merci à Sevario et Christian de JAB pour leur sympathie et leur bonne humeur ! Je remercie également le FQRNT et la Fondation J. Armand Bombardier (Fondation de Polytechnique) pour l’octroi de mes bourses d’études. Je tiens à remercier Margaret et mes super-héros Pierre, Florence, Emma, André et Chloé- Anne pour leur soutien chaleureux et l'amitié profonde qu'ils m'ont témoignés pendant ces années. Je vous adore! Pierre, Florence, cette amitié ne serait possible si elle n’était pas fondée sur le respect, le partage et la confiance inestimable que vous m’avez accordés. Un grand merci à Vincent pour son aide précieuse et la relecture de cette thèse. Je tiens surtout à remercier tous les membres de ma famille, en particulier mon petit chéri, pour leur amour et leur soutien inconditionnel. Aucun mot ne saurait exprimer toute ma grande reconnaissance envers mes parents qui ont beaucoup risqué et énormément donné pour nous offrir une bonne éducation et une vie meilleure. vi RÉSUMÉ La thérapie génique est un secteur biomédical en plein essor et de nombreux vecteurs non- viraux à partir de polymères cationiques ont été étudiés pour la livraison de gènes. Le système de livraison de gènes doit condenser l’ADN, le protéger contre la dégradation par les nucléases, faciliter son entrée dans les cellules et transporter l’ADN jusqu’au noyau pour permettre l’expression des gènes. Ce projet consiste à approfondir notre compréhension d’un système prometteur pour la livraison de gènes: les complexes ADN/chitosane. Les objectifs principaux de cette thèse étaient de déterminer les interactions qui régissent la formation des complexes ADN/chitosane, de caractériser leurs propriétés physico-chimiques et d’étudier leur stabilité afin d’établir une corrélation avec leur efficacité de transfection. Dans un premier temps, l’association entre le chitosane et un ADN plasmide en fonction du pH, du degré de désacétylation (DDA) et de la masse molaire (M ) du chitosane a été étudiée n par microcalorimétrie de titrage isotherme (ITC). Cette étude nous a permis de déterminer la constante d’interaction, l’enthalpie d’interaction et la stœchiométrie des complexes. Nous avons trouvé que l’interaction chitosane-ADN est couplée avec un transfert de protons du système tampon au chitosane. Le transfert de proton est occasionné par la nature fortement anionique de l’ADN qui facilite l’ionisation des amines du chitosane lors de la complexation. De plus, nous avons démontré que l’enthalpie d’interaction mesurée était entièrement due aux changements d’ionisation du chitosane et du tampon. Nous avons trouvé une constante d’interaction chitosane-ADN de l’ordre de 109-1010 M-1 et qui augmente avec la diminution du pH. Ceci est attribué aux interactions électrostatiques plus intenses lorsque le degré d’ionisation du chitosane est plus élevé. Nous avons également mesuré une augmentation par dix de la constante d’affinité vii pour une augmentation de la masse molaire du chitosane de 7 à 153 kDa. Cette constante varie peu pour un DDA compris entre 72% et 80% (~80 kDa). En revanche, un DDA variant de 80 à 93% augmente la constante d’affinité pour atteindre une valeur proche du chitosane avec un M n de 153 kDa et un DDA de 80%. Ces résultats montrent qu’il est possible de contrôler l’affinité chitosane-ADN par le pH et les caractéristiques moléculaires du chitosane. Cette étude a démontré que la formation des complexes ADN/chitosane est gouvernée par des interactions électrostatiques. Pour la transfection, les complexes ADN/polycation sont généralement formés avec un excès de polycation et utilisant des ratios N/P supérieurs à 3 (amines du polycation/phosphates de l’ADN). L’excès important de chitosane par rapport à la quantité d’ADN souvent utilisé dans la préparation des complexes pour la transfection nous a convaincu de l’importance de déterminer la fraction de chitosane libre en solution. Le but de cette deuxième étude était de développer une méthode permettant de quantifier cette fraction. Les travaux ont été réalisés en combinant la technique de fractionnement par flux-force avec flux asymétrique (AF4) avec un spectrophotomètre UV/Vis, un détecteur de diffusion de lumière multi-angles (MALS) et un détecteur de diffusion dynamique de la lumière (DLS). Ce système AF4 permet de séparer le chitosane libre des complexes, de le quantifier directement et de mesurer la taille des particules séparées. Pour une dispersion de complexes ADN/chitosane préparée avec un ratio N/P de 5, nous avons trouvé que 73% du chitosane reste sous forme libre. Les particules ADN/chitosane ont un rayon hydrodynamique (R ) compris entre 20 et 160 nm. Ces résultats ont été confirmés h par SEM et par DLS en mode « batch ». Nous avons démontré que ce système AF4 est un outil puissant pour la caractérisation de systèmes de livraison de gènes car il permet à la fois de viii mesurer la taille et la distribution de taille des particules mais aussi de quantifier la proportion de chitosane libre en solution. Le système AF4 couplé avec les détecteurs UV/Vis, MALS et DLS a ensuite été utilisé afin d’étudier des facteurs qui peuvent influencer l’efficacité de transfection des complexes ADN/chitosane, tels que la concentration d’ADN lors du mélange, le rapport N/P utilisé pour préparer les complexes, la masse molaire et le DDA du chitosane. Cette technique a permis de déterminer plusieurs propriétés physico-chimiques importantes des complexes ADN/chitosane: la taille et la distribution de taille et la conformation structurale des particules, ainsi que la composition des particules calculée à partir de la fraction de chitosane libre. Pour toutes les préparations, les particules mesurent de 15 à 160 nm de rayon hydrodynamique mais la distribution de taille varie suivant les préparations. Lorsque la concentration d’ADN ou la masse molaire du chitosane augmente, nous avons observé la formation d’une fraction importante de grosses particules (> 60 nm). Dans tous les cas, la proportion de chitosane libre est majoritaire. Nous avons constaté que la composition des complexes ADN/chitosane reste constante avec une valeur N/P de 1.4, quelque soit l’excès de chitosane utilisé par rapport à l’ADN lors du mélange. Nous avons confirmé ses résultats par ultracentrifugation des dispersions et analyse des surnageants par colorimétrie. Cette étude a révélé l’importance de quantifier le chitosane libre pour comprendre son rôle dans les mécanismes de livraison de gènes. Après l’étude themodynamique de l’association chitosane-ADN et la caractérisation des propriétés physico-chimiques des complexes ADN/chitosane formés, leur stabilité a été étudiée en présence de différents polyanions compétiteurs afin de complèter ce projet de thèse. Ces polyanions peuvent interagir avec le chitosane et, par conséquent, induire la dissociation des complexes ADN/chitosane. L’ADN dissocié des complexes a été quantifié par spectroscopie de ix fluorescence en utilisant le Picogreen comme fluorophore. Nous avons montré que la capacité de ces polyanions à déstabiliser les complexes ADN/chitosane est reliée à leur affinité pour le chitosane par rapport à l’affinité ADN-chitosane. Les complexes ADN/chitosane étaient très stables en présence de la chondroitine de sulfate ou l’acide hyaluronique. La constante d’affinité ADN-chitosane est au moins 40 fois supérieure à celle de ces polyanions pour le chitosane. Par contre, l’héparine qui a une densité de charge élevée et possède une constante d’affinité proche de celle entre l’ADN et le chitosane, peut dissocier les complexes. Cependant, la stabilité des complexes augmente avec le DDA et la masse molaire du chitosane, en accord avec les constantes d’association déterminées dans la première étude. Nous avons également démontré que le chitosane libre en quantité suffisante peut éviter la dissociation des complexes par l’héparine.