FIXATION DES METAUX LOURDS, FER, ZINC, CUIVRE, PLOMB, PAR CERTAINES PROTEINES SERIQUES DES ANIMAUX MARINS. par M. PINTA R. TRAN et W. GHIDALIA ORSTOM ORSTOM Université Paris VI BONDY BONDY PARIS Convention de Recherche avec le Ministère de l'Environnement CCB-78.119 PLAN 1. Introduction. 2. Matériel et Méthodes. 3. Expériences de contamination. 4. Résultats et discussion. 1. INTRODUCTION. Parmi les nombreux types de pollution en milieu marin, les métaux lourds à l'état de traces constituent une source de danger certain, aussi bien sur le plan écologique vis-à-vis des systèmes aquatiques, que sur la chaîne alimentaire. Les études consacrées à ce problème ont mis à jour le rôle hautement toxique d'éléments tels que le mercure, le cadmium et le plomb, en raison de leur accumulation chez certains organismes marins et de leur transmission à travers les échelons de la chaîne biologique. En fait, les connaissances actuelles sont surtout basées sur des recherches qui ont été menées à la suite de pollutions accidentelles, lorsque l'on constate l'apparition de perturbations morphologiques ou physiologiques chez l'homme ou chez des espèces directement comesti bles par l'homme (poissons, crustacés .••). Ces recherches permettent, dans la plupart des cas, de remonter à l'origine des troubles obser vés. Cependant, l'identification de l'agent polluant responsable peut prendre un certain temps, du fait de la difficulté d'établir un diag nostic sur et du laps de temps qui peut s'écouler entre l'apparition des perturbations et leur constat. De plus, cette démarche à postério ri fournit peu de renseignements sur les mécanismesd'action de la substance incriminée. C'est sur ce thème que sera essentiellement consacré ce travail. Nous avons tenté d'apporter quelques précisions sur les modalités d'action d'un élément tel que le plomb, choisi en raison de ses effets toxi ques bien connus chez l'homme (saturnisme, troubles des fonctions rénales, ...) et de son importance en tant que métal polluant pour l'environnement de façon générale. Une telle étude pouvait être envisagée sous deux aspects : - soit en prélevant des échantillons d'organismes évoluant dans un milieu supposé pollué en plomb afin d'étudier leur physiologie et de déterminer les teneurs en métal dans leurs organes, - soit en reproduisant expérimentalement un milieu marin artificiel, puis en mettant dans ce milieu l'espèce animale étudiée en présence de plomb à des concentrations fixées. L'intérêt de cette dernière méthode réside dans la simplification du milieu contaminé, ce qui permet de mettre en cause directement le métal en question et d'établir une corrélation entre la présence de cet élément dans le milieu et l'apparition de certaines perturbations physiologiques chez l'espèce étudiée. C'est sous cet aspect que sera abordé ce travail. Il s'agit d'étudier le comportement de l'espèce MaaropipuB puber, crabe comestible, en milieu marin artificiel additionné de quantités connues de plomb. Des recherches préalables (Convention de Recherche 1975-1976) ont abouti à la mise au point d'un protocole expérimental permettant de mettre en évidence une fixation effective de plusieurs métaux (Fe, Zn, Cu, Pb), par une fraction des protéines sériques de Maaropipus puber, par simple mise en contact de ces éléments avec du sérum. En continuité avec ces essais d'ajout de métal sur du sérum prélevé, une série d'expériences préliminaires à ce travail a été menée sur deux de ces métaux (cuivre et plomb), dans le but d'obtenir des ren seignements sur leur cinétique d'action. L'ensemble des résultats a montré que les protéines sériques ont un comportement différent vis-à-vis des deux éléments étudiés ; cette différence peut s'expliquer par le fait que le cuivre est le métal constitutif de l'hémocyanine, protéine majeure du sérum des crusta cés, alors que le plomb n'a pas un rôle biologique connu chez ces organismes. De plus, l'étude cinétique a révélé, aussi bien pour le cuivre que pour le plomb, que la phase de fixation est toujours suivie d'une phase de désorption ou relargage du métal par les protéines. La méthode de contamination en milieu marin artificiellement repro duit permet de vérifier si les phénomènes de fixation et de relar gage observés lors de ces essais chimiques se produisent réellement chez les crustacés vivants. Cette étude comprend trois essais correspondant à la contamination de plusieurs lots de crabes, dans une eau, de mer synthétique conte nant des concentrations en plomb variant de 1 Ug/ml à 0,01 ug/ml. Des échantillons de sérum sont prélevés sur les animaux, à des temps déterminés, avant et après contact avec le milieu pollué. Le plomb est dosé d'une part dans le sérum total, d'autre part sur la frac tion protéique. 2. MATERIEL ET METHODES. 2.1. Matéri3l animal. Les lots d'étrilles sont fournis, sur commande, par un pêcheur de Bretagne, et arrivent dans la Région Parisienne après une nuit de transport, sans précaution particulière. Leur provenance est, par 2. conséquent, exactement la même que celle des crabes destinés aux consommateurs sur les marchés. Pour les besoins expérimentaux, les critères de sélection sont basés sur une taille moyenne, correspondant à une surface de carapace de 8 cm x 6 cm, et sur la plus grande vivacité possible. Ces crabes doivent être suffisamment vigoureux pour s'adapter aux conditions expérimentales et résister aux ponctions répétées. Les étrilles sont groupées par quinzaine dans de grands bacs d'eau de mer artificielle placés dans une pièce maintenue constamment à 15°C et éclairée artificiellement suivant un rythme circadien. Un bulleur et un filtreur d'eau assurent l'aération et la filtration du milieu à l'intérieur des bacs. L'eau de mer est obtenue par dis solution de sels synthétiques Hw-Wimex, à une concentration de 35 g/l, pour une densité mesurée de 1,022. Ces sels reconstituent un milieu artificiel contenant les bioéléments indispensables à la conservation des organismes marins. Durant la semaine qui précède les expériences, l'eau de mer est chan 1 A semaine gée deux fois par et des moules crues sont fournies comme nourri ture aux animaux. Cet apport est interrompu pendant le temps que dure les essais. 2.2. Méthodes. Après un séjour dans un bac d'eau de mer contaminée en nitrate de plomb, les crabes sont ponctionnés à des temps déterminés. Les sé rums sont soumis à une électrophorèse pour séparer la fraction pro téique. Le dosage du plomb se fait,d'une part directement sur les sérums pour déterminer la quantité de plomb absorbée dans le sérum total, d'autre part sur les fractions électrophorétiques après solubi- lisation dans un acide, pour apprécier la part de plomb fixée au niveau des protéines sériques. Ce protocole opératoire nécessite la mise en oeuvre de deux méthodes microanalytiques : l'électrophorèse et la spectrométrie d'absorption atomique sans flamme. On peut, en première approximation, considérer le sérum des crusta cés comme une solution de protéines dans un milieu très voisin de l'eau de mer. Du fait des très faibles quantités de sérum dont nous disposons et de la haute sensibilité analytique qu'exige le dosage du plomb, la microtechnique d'électrophorèse sur bande d'acétate est la plus ap propriée pour la séparation des protéines. Cette séparation se fait sur des bandes d'acétate de cellulose Cellogel (17 x 2,5 cm) en pré sence d'un tampon phosphate monopotassique à pH 6,4 qui permet d'iso ler l'ensemble des protéines sériques en une seule fraction. La quantité de sérum déposée au départ par application unique est de 3 ~l. La migration s'effectue dans les conditions suivantes: 3. - différence de potentiel 180 V - intensité de courant 25 mA durée de migration 45 minutes. Chaque électrophorèse correspond à l'analyse d'un sérum et comprend six bandes : - une bande témoin sans dépôt, cinq bandes avec dépôt du même sérum dont une est soumise à une coloration à l'amidoschwartz afin de révéler l'emplacement des protéines. Seule, cette dernière n'est pas destinée au dosage. Une fois les protéines localisées par comparaison avec la bande co lorée, les bandes à analyser sont découpées à ce niveau avec une lame de verre, en fractions de 1 cm2. Celles-ci sont solubilisées pendant 24 heures dans de petits piluliers en verre contenant 1 ml d'acide nitrique 10 i., puis subissent une agitation ultrasonique à froid pendant 5 minutes, ce qui permet la dissolution du métal fixé à 85 %• Il est absolument nécessaire de faire au moins quatre applications répétées du même sérum et d'éviter toute contamination par du plomb lors des nombreuses opérations pour assurer la plus grande justesse possible des résultats lors du dosage. La précision de cette méthode varie de 10 à 15 i.. La détermination du plomb dans les sérums et dans les fractions pro téiques solubilisées revient à doser le plomb à des teneurs de quel ques dizaines de ng/ml, - soit dans un milieu organique chargé en sels, - soit dans une solution acide concentrée. La spectrométrie d'absorption atomique électrothermique permet, à la fois, de détecter les quantités de plomb en très faibles traces et de résoudre les problèmes liés à la complexité de ces matrices. Rappelons brièvement le principe de cette méthode. L'échantillon introduit dans un four en graphite subit les étapes suivantes : - séchage de la matrice, décomposition des éléments en présence d'un gaz inerte, - atomisation du métal par chauffage électrothermique. Les atomes sont mesurés par absorption et les concentrations en plomb sont déterminées par rapport à une gamme étalon. a) Milieux "eau de mer" et "sé1'Ul7l total". La programmation thermique mise au point par RIANDEY, GAVINELLl et PINTA (1980) a été appliquée dans ce cas, pour l'analyse des sérums et de l'eau de mer, avant et après contamination (1). L'emploi du programme à chauffage rapide est nécessaire pour corriger les fortes absorptions non spécifiques dues à la présence, dans les matrices, de NaCl à des concentrations voisines de 35 %0 soit 3,5 %0 après dilution par dix des échantillons. 4. TABLEAU 1. Programme optimum pour le plomb dans une matrice "eau de mer" et "sérum total". Cycle 1 2 3 4 5 6 Oc Température 100 400 400 960 20 2200 Temps de montée s 15 15 1 0 1 1 Temps d'isotherme s 15 15 5 3 5 5 Débit d'argon ml/mn 300 300 10 10 300 300 1 Séchage 2-3 : Décomposition 4 Atomisation - 5 Refroidissement 6 : Nettoyage. La sensibilité est améliorée d'environ 2 à 3 fois en diminuant le balayage d'argon au cycle d'atomisation. La décomposition se fait en deux temps pour réduire progressivement le courant d'argon et obtenir un débit minimal juste au moment de l'atomisation. bJ Fraction protéique. Après solubilisation du support en acétate, le plomb fixé au n1veau de la fraction protéique se trouve dissous dans un volume de 1 ml d'acide nitrique 10 %. C'est à partir de cette solution que se fait le dosage du métal. La programmation thermique pour le plomb, en fonction d'une matrice nitrique, a été étudiée par CAILLOT (1974), PINTA et RIANDEY (1975) 1. RIANDEY, etJLINHARES et PINTA (1975) (2-4). Ce programme a été repris et adapté au cas des échantillons qui nous concernent, en modifiant légèrement les températures d'atomisation et de décomposition afin d'améliorer la sensibilité. Ce dosage est rendu délicat par la "décomposition" du support en acétate par l'acide nitrique, ce qui rend la solution hétérogène et chargée en matière organique. Nous nous trouvons devant l'alterna tive suivante : J / analyser les échantillons rapidement, dans les 24 heures qui sui- vent l'agitation ultrasonique, - ou enlever, avec précaution, le support en acétate avec une pince en plastique, ce qui constitue un risque de contamination. 5. TABLEAU 2. Programme optimum pour le plomb dans une matrice nitrique. Cycle 1 2 3 4 5 QC Température 100 550 550 2000 20 Temps de montée s 15 15 1 1 1 Temps d'isotherme s 15 15 5 5 5 Débit d'argon ml/mn 300 300 10 10 300 c) Propriétés analytiques de la méthode. Un système d'injection automatique de l'échantillon dans le four en graphite permet une répétabilité moyenne de 5 %. La sensibilité absolue mesurée par le rapport ~(Pb)/(~) est de l'ordre de 0,3 x 10-9 g pour une absorption de 1 %. La limite de détection pour le plomb est de 10-11 g. La courbe d'étalonnage (Fig. 1) montre que le domaine analytique est compris entre 2.10-6 g/l et 40.10-6 g/l pour la sensibilité indiquée. En matière d'analyse d'ultratraces, les causes d'erreur prépondéran tes proviennent des risques de contamination à toutes les étapes des opérations, viennent ensuite les absorptions non spécifiques, puis éventuellement, les interférences chimiques notamment pour les matri ces "eau de mer" pour les échantillons étudiés. Afin de pallier à ces multiples inconvénients, des précautions rigou reuses sont prises pour éviter tout risque de contamination ; les manipulations ont lieu dans des locaux dont l'atmosphère est à em poussiérage contrôlé. L'acide nitrique est de qualité "suprapur" Merck et le chlorure de sodium de qualité "specpur" Johnson Matthey. Les divers blancs sont systématiquement mesurés : blancllfour vide'~ blanc"milieu HN03 10 %I~ blanc"matrice NaCl", blanc"support acétate~ L'utilisation d'un spectromètrft Perkin-Elmer 400, équipé d'un dispo sitif de correction de fond simultanée à arc au deutérium, permet la correction totale des absorptions non spécifiques indésirables dues aux matrices chargées en NaCl. Cette correction est contrôlée régu lièrement par analyse des échantillons avec et sans l'effet de la lampe à deutérium. 6. La méthode de l'étalonnage complexe est employéepour les échantil lons en milieu "eau de mer" ; il s'agit de faire une gannne de Pb(N03)2 dans du NaCl à 35 %0. 2.2.3. La méthode du "Biuret". La technique retenue pour le dosage des protéines sériques est la méthode colorimétrique dite du "Biuret". " Le principe de la réaction est le suivant les fonctions -CONH2' -CH2NH2, -C(NH)(NH2) ou -C3NH2' des protéines réagissent en présence du réactif de Biuret (solution de NaOH et de Cu(S04)2 ) pour donner une coloration bleue-violette dont l'intensité est mesurable au spectrocolorimètre, à la longueur d'onde 340 nm (5-6). Cette méthode est utilisée généralement pour le dosage 'des protéines, albumines et globulines du sang humain. Les concentrations en pro téines des échantillons sont déterminées par rapport à une droite établie grâce à un étalon de référence qui est une solution d'albumi ne synthétique à une concentration donnée:J (Appliquée au dosage des protéines sériques de crustacés, la technique du Biuret ne permet pas de donner des résultats rigoureusement jus- tes; elle est utilisée à titre semi-quantitatif, pour faire des comparaisons de teneurs entre les crabes, l'erreur de précision étant de 3 %. 2.3. Expression des résultats. 2.3.1. Unités. Résultats concernant le dosage direct des protéines et du plomb total du sérum : . _. _ . - concentrat10n en prote1nes ser1ques mg/ml - concentration en plomb dans le sérum ].lg/ml sérum. Résultats concernant l'analyse des fractions protéiques: - concentration en plomb ].lgPb fixé par les protéines/ml sérum. Les résultats se traduisent graphiquement par des courbes de ciné tique en fonction du temps : 1 - variation de la teneur en plomb sérique en fonction du temps, 2 - variation de la teneur en plomb fixé par les protéines en fonction du temps. 7. 3. EXPERIENCES DE CONTAMINATION. 3.1. Protocole commun. Les exper~ences sont menées sur des lots homogènes de dix crabes mâles. Le prélèvement de l'hémolymphe se fait par ponction avec une seringue de 1 ml, au niveau du sinus situé à la base des pattes mar cheuses, aux temps suivants : 1 jour avant contamination du milieu (J-I), c'est-à-dire lorsque le crabe se trouve dans son état physiologique normal, le jour J étant le début de l'essai de contamination; - J+I, J+2, J+3 (ou 4), J+7 jours après contamination du milieu par du Pb à différentes concentrations. Les volumes prélevés (environ 0,2 ml par ponction) sont immédiate ment mis à centrifuger pendant dix minutes, à 4000 tours/mn. Le surnageant recueilli constitue le sérum et correspond à l'hémolym phe débarrassée des cellules sanguines. Quelques gouttes de sérum sont destinées à l'électrophorèse et le reste est conservé, à 4°C, dans des tubes bouchés hermétiquement. 3.2. Contamination par une eau contenant 1 ~g/ml de plomb. Deux lots de crabes sont étudiés parallèlement aux temps J-I, J+l, J+2 et J+3 : un lot "témoin" dans une eau de mer sans ajout de métal, - un lot séjournant dans une eau contenant 1 ~g/ml de plomb sous forme de Pb(N01)2. Le premier but est de retrouver des traces de plomb dans le sérum, auquel cas on pourra affirmer que les barrières physiologiques natu relles telles que les épithéliums branchiaux et les téguments du crabe, ne constituent pas un système de filtration sélectif vis-à-vis de ce métal. Le dosage des fractions protéiques permettront, dans un second temps, de vérifier si les phénomènes de fixation et de relar gage se produisent lorsque les crabes se trouvent dans un milieu ma rin reconstitué. 3.3. Contamination par une eau contenant 0,1 pg/ml de plomb. Compte tenu des résultats de l'expérience précédente, cet essai est fait sur deux séries de crabes, dans une eau de mer conta- minée par 0,1 ~g/ml en Pb dont une série sert de témoin d'ob servation (non ponctionnée), l'autre à l'analyse. L'étude cinétique se fait pendant sept jours pour suivre la stabilisation ou la décroissance des phénomènes. L'observation du lot témoin permet de déterminer le taux de mortalité dû uniquement à la toxicité du métal. 8. 3.4. Contamination par une eau contenant 0,01 ~g/ml de plomb. Un lot de dix crabes séjournant dans une eau de mer contaminée à O,OI~g/ml en Pb subissent des ponctions aux temps J-), J+I et J+2. La moitié du lot est alors remise dans une eau non contaminée et les ponctions poursuivies pendant cinq jours sur les dix crabes. La comparaison des résultats entre les crabes décontaminés et les autres permet de savoir s'il existe une accélération du relargage du plomb lorsque le séjour en milieu pollué est interrompu. 4. RESULTATS EXPERIMENTAUX. 4.1. Contamination par une eau contenant ~g/ml. 4.1.1. Résultats avant contamination. ------------------------------ Les contrôles effectués sur les crabes avant contamination par le plomb donnent les résultats suivants: tableau 3. TABLEAU 3 - Teneurs en plomb et en protéines des sérums. Moyenne Crabes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 des 10 Pb ~g/ml sérum 0',007 0,016 0,015 0,009 0,020 0,004 0,013 0,008 0,004 0,016 0,011 Protéines mg/ml sérum 57,37 56,03 64,62 52,76 61,32 59,35 62,30 55,40 55,40 63,30 58,78 La teneur moyenne en plomb du sérum des crabes à l'état normal est de 0,011 ~g/ml. Nous ne pouvons préciser si ce plomb trouvé dans le sérum total se trouve lié ou non aux protéines, étant donné la limite de dé tection relative de l'absorption atomique qui est de 0,0005 ~g/ml. 9.