FILIPE ALEXANDRE MARQUES PEREIRA O PAPEL DO Fe NA INTERACÇÃO PEIXE /AGENTE PATOGÉNICO Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar Universidade do Porto 2004 Dissertação apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar para obtenção do grau de Mestre em Ciências do Mar-Recursos Marinhos, especialidade Aquacultura Resolução 12/SC/95 D.R. n° 169, II série, de 24 de Julho de 1995 Orientação: Professor Doutor Pedro Nuno Simões Rodrigues A meus pais AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar quero deixar aqui o meu agradecimento aos meus pais, pelo incentivo que me souberam dar em fases de menor inspiração. Em especial a minha sincera homenagem póstuma ao meu pai, falecido no decorrer deste trabalho, e dizer que será sempre recordado com um sorriso. Aproveito também para agradecer à Cláudia, minha companheira desde há longa data, que sempre me apoiou, quer nos bons quer nos maus momentos pelos quais passei ao longo deste período. A todos os meus amigos de Vila do Conde, e aos amigos e colegas do CIMAR, IBMC, INEB e ICBAS, que acompanharam a evolução do meu trabalho. Ao Jesus, Béa, Alicia e Juan do Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade de Santiago, pelas ajudas quanto a possíveis caminhos a seguir neste trabalho. A todos os outros que compõem o Departamento e o Instituto de Acuicultura da Universidade, o meu agradecimento pelo companheirismo exemplar. Por último mas não menos importante, ao Prof. Pedro Rodrigues, pela sua orientação neste trabalho. Porto, Maio de 2004 ÍNDICE RESUMO i INTRODUÇÃO 1 OBJECTIVOS 16 MATERIAIS E MÉTODOS 17 RESULTADOS 22 DISCUSSÃO 36 CONCLUSÃO 42 PERSPECTIVAS FUTURAS DE INVESTIGAÇÃO 43 BIBLIOGRAFIA 44 Resumo: Quase todos os organismos necessitam de ferro para viver. Para promover melhorias no estado de saúde e aumentar o crescimento dos peixes, o ferro é rotineiramente adicionado às rações. Nos vertebrados a absorção deste elemento é controlada primeiramente pelo intestino. No entanto, apesar do metabolismo do ferro ser fortemente regulado, podem ocorrer episódios de sobrecarga do metal. Foi demonstrado anteriormente que patogénios de peixes marinhos têm importantes factores de virulência que dependem do ferro para a sua expressão. Um desses organismos patogénicos é a bactéria Photobacterium damselae subsp. piscicida (anteriormente designada por Pasteurella piscicida), causadora da pasteurelose ou pseudotuberculose. Nos últimos anos têm ocorrido epizootias de pasteurelose em vários países, e o robalo (Dicentrarchus labrax L.) é uma das espécies aquícolas mais afectadas, com perdas económicas avultadas. Neste trabalho avaliamos o efeito da sobrecarga de ferro na susceptibilidade do robalo às infecções. Para obtenção de robalos com sobrecarga em ferro vários animais foram injectados i.p. com Iron Dextran ou alimentados com uma dieta comercial suplementada com 2,5% de Carbonyl Iron. Vários parâmetros envolvidos no metabolismo do ferro foram avaliados durante a sobrecarga com ferro. A avaliação dos níveis hematológicos e histológicos de ferro indica que o robalo atingiu uma situação de sobrecarga em ferro após a injecção de iron dextran e suplementação prolongada com carbonyl iron. Experiências de infecção nos peixes injectados com iron dextran permitiu encontrar uma dose ideal para observação de diferenças nas mortalidades entre animais com sobrecarga em ferro e animais controlo. Na experiência de suplementação da ração com carbonyl iron observaram-se maiores mortalidades nos peixes com sobrecarga em ferro após infecção com Ph. damselae subsp piscicida. Os nossos resultados indicam claramente que a suplementação de ferro aumenta a suceptibilidade do robalo à infecções por Ph. damselae subsp piscicida. Summary: Almost all living organisms require iron to exist. In order to promote health and growth, iron is added to commercial fish feed. In vertebrates iron absorption appears to be primarily controlled by the intestine. In spite of iron metabolism being tightly regulated, episodes of iron overload can occur. In addition, it has been shown that marine fish pathogens have important virulence factors that depend on iron for expression. One l such pathogen is Photobacterium damselae subsp. piscicida (formerly Pasteurella piscicida), causing.pasteurellosis or pseudotuberculosis. In recent years outbreaks of pasteurellosis have occurred in several countries, and sea bass (Dicentrarchus labrax L.) is one of the most affected aquaculture species, with serious economic losses. In the present experiment we evaluated the effect of iron overload on the susceptibility to infection in sea bass. Fish were i.p. injected with Iron Dextran or fed a commercial feed with a supplement of 2,5% carbonyl iron in order to obtain iron overload. Several parameters involved in iron metabolism were measured during the experiments of iron overload. The evaluation of haematological and tissue iron levels indicate that the sea bass have reached an iron overload status after both iron i.p. injection and by prolonged dietary iron supplementation. Challenges with bacteria in iron dextran injected fish were made in order to obtain ideal dosis for the study of differences in mortalities between iron and control fish. In the iron supplementation experiment, higher mortalities were observed in the iron overload fish after challenge with Ph. damselae subsp piscicida. Our results clearly support the idea that the dietary iron overload increases susceptibility of sea bass to Ph. damselae subsp piscicida infection. ii INTRODUÇÃO 1. INTRODUÇÃO O robalo {Dicentrarchus labrax) é uma das espécies piscícolas com maior tradição de consumo na Europa, e em particular nos países Mediterrânicos. Trata-se de uma espécie de elevado valor comercial, cuja produção tem aumentado consideravelmente nos últimos anos. As antigas unidades de policultura extensiva de robalo deram lugar a modernos regimes semi-intensivos e intensivos. Essas unidades situadas nas Regiões Centro e Sul do País têm, em alguns casos, capacidade para estabulação de várias centenas de toneladas de animais/ano (Blanquet, 1998). De acordo com as estatísticas da FAO, a contribuição da aquacultura na produção global continua em crescimento. Mais de 50% desta produção aquícola no ano 2000 deve-se a peixes ósseos. Na Europa, a produção de dourada {Sparus aurata) e robalo (Dicentrarchus labrax) cresceu fortemente na última década. Em Portugal, durante o ano 2000, estas duas espécies atingiram os 63% (dourada) e 23% (robalo) da produção total de peixes ósseos marinhos (do Vale, 2003). O aperfeiçoamento e intensificação da aquacultura têm como objectivo final a produção do número máximo de indivíduos, no mínimo espaço, durante o prazo mais curto e ao melhor preço. Esta concentração cada vez maior de animais implica um aumento no stress e consequente diminuição das defesas. É então óbvio que este aumento nas densidades de cultura implica também um aumento no risco de doença e a sua rápida propagação (Menezes, 2000). As patologias mais comuns na cultura de robalo são de natureza parasitária ou bacteriana. Parasitas ciliados, tremátodes monogénicos e crustáceos são relativamente fáceis de controlar. O problema reside nas patologias bacterianas, onde o tratamento é muitas vezes condicionado pela falta de apetite por parte dos animais infectados, e também pelo aparecimento crescente de resistências aos antibióticos por parte das ictiobactérias. As principais infecções bacterianas que afectam o robalo são: a) Vibrioses por Vibrio anguillarum; b) bactérias filamentosas: Tenacibaculum maritimum (antes Flexibacter maritimus); c) Streptococose por Streptococcus iniae; d) Micobacteriose por Mycobacterium marinum; e e) Pasteurelose por Photobacterium damselae subsp piscicida (Toranzo, 2003). 1 INTRODUÇÃO 2. METABOLISMO DO Fe 2.1 INTRODUÇÃO O Ferro (Fe) é um elemento essencial para quase todos os organismos vivos. No entanto quando em excesso torna-se tóxico. Devido a este paradoxo entre escassez e excesso de Fe, os organismos desenvolveram mecanismos para regular o seu metabolismo. A regulação inicia-se a nível da absorção, sendo o ferro depois transportado através das células para a circulação, e finalmente armazenado dentro do organismo. 2.2 IMPORTÂNCIA DO Fe O Fe é um elemento vital para a quase totalidade dos organismos vivos, pois é essencial para múltiplos processos metabólicos, que incluem transporte de oxigénio, síntese de ADN, transporte de electrões (Lieu et ai., 2001) e também para a proliferação das células envolvidas nos processos imunológicos (Weiss er ai., 1995). Com a excepção dos lactobacilos, que utilizam manganésio e cobalto como biocatalizadores em substituição do Fe, todos os microorganismos que foram devidamente analisados requerem Fe para viver (Guerinot, 1994; Andrews, 2000). Um organismo deve ser capaz de garantir um balanço óptimo de Ferro como forma de manter a concentração deste metal em níveis aceitáveis, acima e abaixo dos quais efeitos deletérios podem ocorrer. As propriedades químicas do Fe têm duas limitações no comportamento biológico deste elemento: 1- embora abundante, o metal é encontrado mais frequentemente sob a forma de Fe(lll) hidróxido. Por isso, os organismos tiveram que desenvolver mecanismos para obter o Fe a partir do meio ambiente; 2- é potencialmente tóxico. Fe(ll) e Fe(lll) podem originar radicais livres de oxigénio tóxicos para o organismo. Consequentemente, ao mesmo tempo que o Fe é acumulado em quantidades suficientes para o metabolismo, os organismos têm que assegurar que a concentração intracelular de Fe "livre" não alcance níveis tóxicos. Isto é assegurado, a nível celular, por uma regulação coordenada de proteínas capazes de se ligar ao Fe para o armazenar, capturar e transportar. Células diferentes variam grandemente na sua capacidade de armazenar Fe em excesso sem comprometer a sua função (de Freitas and Meneghini, 2001). 2 INTRODUÇÃO 2.3 ABSORÇÃO DO Fe 2.3.1 Absorção do Fe HÉMICO O Fe sob a forma hémica é absorvido mais eficazmente da dieta e por uma via diferente do Fe inorgânico. A digestão proteolítica da mioglobina e hemoglobina resulta na libertação do grupo heme, que é mantido numa forma solúvel, podendo assim estar disponível para absorção. Desta forma, substâncias quelantes que possam diminuir ou aumentar a absorção de Fe inorgânico têm pouca eficácia na absorção do Fe hémico. O Fe entra assim nas células responsáveis pela absorção como uma metaloporfirina, podendo esta entrada ser facilitada por um sistema de transporte vesicular (Uzel and Conrad, 1998). As proteínas envolvidas na captura do Fe hémico estão ainda por identificar (Conrad and Umbreit, 2000). Já no interior da célula o anel de porfirina é clivado pela hemo-oxigenase. A transferência deste Fe das células da mucosa ocorre competitivamente com o Fe da dieta que entrou nas células responsáveis pela absorção como Fe inorgânico, pois ambos partilham uma via comum dentro da célula intestinal (Uzel and Conrad, 1998). Dois terços (2/3) do Fe corporal são derivados do heme, pois muito do Fe não- hémico da dieta liga-se a quelantes no lúmen do intestino, tomando-o indisponível para absorção. O grupo heme é solúvel a pH alcalino e precipita em condições ácidicas. (Bezkorovainy, 1987; Conrad and Umbreit, 2000). 2.3.2 Absorção do Fe NÃO-HÉMICO A pH fisiológico e na presença de oxigénio o Fe existe predominantemente sob a forma altamente insolúvel Fe(lll) (férrica), enquanto que os sistemas de transporte de Fe captam Fe(ll) (ferroso), o qual é muito instável e rapidamente oxida a Fe férrico. A absorção do Fe ocorre e é regulada no intestino proximal, onde se sabe que o Fe sob a forma de ião ferroso é mais facilmente absorvido do que ião férrico. A absorção do Fe a nível celular pode ser modificada por saturação dos locais de ligação de Fe, tanto por Fe como por proteínas que se ligam ao Fe. Os mecanismos que influenciam a transferência de Fe das células responsáveis pela absorção para o plasma são ainda desconhecidos (Conrad and Umbreit, 2000). Recentes experiências revelaram que na solha o local preferencial de absorção in vivo de Fe sob a forma de ião ferroso é o intestino posterior. O mesmo estudo revela que tal facto ocorre apesar de existirem concentrações extremamente elevadas de carbonatos no lúmen, onde é esperada a redução da biodisponibilidade dos catiões divalentes como resultado de precipitação como carbonatos (Bury et ai., 2001). 3