T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI FERTİL VE İNFERTİL SEMEN ÖRNEKLERİNDE ENERJİ ÜRETİMİNDE GÖREV ALAN BAZI SİTOZOLİK VE MİTOKONDRİYAL ENZİM AKTİVİTELERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI Bil.Uzm. Hülya LEVENTERLER DOKTORA TEZİ DANIŞMANI Prof. Dr. Nurten DİKMEN ADANA-2005 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI FERTİL VE İNFERTİL SEMEN ÖRNEKLERİNDE ENERJİ ÜRETİMİNDE GÖREV ALAN BAZI SİTOZOLİK VE MİTOKONDRİYAL ENZİM AKTİVİTELERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI Bil.Uzm. Hülya LEVENTERLER DOKTORA TEZİ DANIŞMANI Prof. Dr. Nurten DİKMEN Bu tez, Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından SBE D-23 nolu proje olarak desteklenmiştir. ADANA-2005 KABUL VE ONAY Biyokimya Doktora Programı çerçevesinde yürütülmüş olan “Fertil ve İnfertil Semen Örneklerinde Enerji Üretiminde Görev Alan Bazı Sitozolik ve Mitokondriyal Enzim Aktivitelerinin Karşılaştırılması” adlı çalışma, aşağıdaki jüri tarafından Doktora tezi olarak kabul edilmiştir. Tez Savunma Tarihi: 28.6.2005 İmza Prof. Dr. Nurten DİKMEN Ç.Ü. Tıp Fakültesi Jüri Başkanı İmza İmza Prof. Dr. Suna SOLMAZ Prof. Dr. Belkıs AYDINOL Ç.Ü. Tıp Fakültesi Dicle Üniversitesi Tıp Fakül. İmza İmza Doç. Dr. Güzide YÜCEBİLGİÇ Doç. D. Soner KOLTAŞ Ç.Ü. Fen-Edebiyat Fakültesi Ç.Ü. Tıp Fakültesi Yukarıdaki tez, Yönetim Kurulunun ………….tarih ve …………..sayılı kararı ile kabul edilmiştir. Prof. Dr. Sait POLAT Enstitü Müdürü ii TEŞEKKÜR Doktora eğitimim sırasında ilgi, sevgi, sabır ve anlayış ile hiçbir zaman yardımını esirgemeyen, her konuda çok büyük desteğini gördüğüm sayın hocam Prof. Dr. Nurten Dikmen’e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmalarım sırasında yardım ve katkılarından dolayı Prof. Dr. Suna Solmaz’a ve anabilim dalı başkanlığı süresince destek ve hoşgörüsünü esirgemeyen sayın hocam Prof. Dr. Levent Kayrın’a teşekkür ederim. Eğitimim sırasında yardımlarından dolayı Biyokimya Anabilim Dalı öğretim üyelerine, çalışanlarına ve beni destekleyen Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı öğretim üyeleri ile çalışanlarına teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmamı SBE D-23 nolu proje ile destekleyen Ç.Ü. Rektörlüğü Araştırma Fonu’na, Sağlık Bilimleri Enstitüsü başkanı Prof. Dr. Sait Polat ve enstitü çalışanlarına teşekkür ederim. Çalışmalarımda yardımlarından dolayı Doç. Dr. Soner Koltaş, Doç.Dr. Davut Alptekin, Öğretim görevlisi Dr. Gülşah Seydaoğlu ve Nükleer Tıp Laboratuvarı çalışanlarına teşekkür ederim. Ayrıca yardım ve katkılarından dolayı Safiye Taga ve Ayşen Durmaz’a teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım süresince beni destekleyen, her zaman yanımda olan aileme, eşime, oğluma ve kızıma sonsuz teşekkürlerimi sunarım. iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay ii TEŞEKKÜR iii İÇİNDEKİLER iv ŞEKİLLER DİZİNİ vii ÇİZELGELER DİZİNİ ix SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ xi ÖZET xiii ABSTRACT xiv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİ 3 2.1. Tarihçe 3 2.2. İnfertilitenin Değerlendirilmesi 6 2.2.1. Kadında İnfertilite Nedenleri 6 2.2.2. Erkekte İnfertilite Nedenleri 7 2.3. Semen Analizi 10 2.3.1. Sperm Örneğinin Alınması 10 2.3.2. Semen Örneğinin Değerlendirilmesi 10 2.3.3. Semenin Makroskopik İncelemesi 11 2.3.4. Semenin Mikroskopik İncelemesi 12 2.3.5. Spermatogenez 16 2.3.6. Semen 19 2.4. Malat Dehidrogenaz (MDH) ve Malik Enzimler (ME) 22 2.4.1. MDH (EC 1.1.1.37) 23 2.4.2. MDH1 Geni İçin Gen Kartı 23 2.4.3. Amino Asit Dizi Benzerliği 26 2.4.5. Substrat Özgünlüğünün Düzenlenmesi 26 2.5. Malik Enzim 27 2.5.1. Malik Enzim 1 (ME1) 28 2.5.2. Malik Enzim 2 (ME2) 28 2.5.3. Malik Enzim 3 (ME3) 28 iv 2.5.4. MDH ve ME’in Klinik Olarak Önemi 34 2.6. Laktat Dehidrogenaz ve C4 İzoenzimi 35 2.6.1. Ontogen ve Testiste Yerleşim 36 2.6.2. LDH-C4’ün Kinetiği 37 2.6.3. Substratlar (Metabolik Önemi) 37 2.6.4. İnhibitörler 39 2.6.5. Moleküler Özellikleri 40 2.6.7. Testis Hasarı ve İnfertilitede Bir “Marker” Olarak LDH-C4 41 2.7. Reaktif Oksijen Türleri ve Antioksidan Koruma 42 2.7.1. Reaktif Oksijen Türleri ve Oksidatif Stres 42 2.7.2. Oksidatif Stres ve Lökositler 42 2.7.3. Oksidatif Stres ve Sperm Fonksiyonu 43 2.7.4. Lipit Peroksidasyonu 43 2.7.5. Antioksidan Korumalar 44 2.7.6. Glutatyon 45 2.7.7. Fosfolipit Hidroperoksit Glutatyon Peroksidaz 48 2.8. Seminal Sıvıda Fruktoz ve Glukoz 50 2.9. Leptin 53 2.10. Testosteron 58 2.10.1 Testosteron Sentezi 58 2.10.2. Testosteron Etki Mekanizmaları 59 2.10.3. Testosteron ve İnfertilite 60 2.10.3.Seminal Plazmada Hormonal Steroidler 61 3.GEREÇ VE YÖNTEMLER 62 3.1. Cihazlar 62 3.2. Örneklerin Temini ve Gruplandırması 63 3.3. Sperm Homojenizasyonu 66 3.4. Sperm Yıkama (Swim up) 67 3.5. Analiz Yöntemleri 68 3.5.1. Malat Dehidrogenaz (MDH) Aktivite Tayini 68 3.5.2. Laktat Dehidrogenaz (LDH) Aktivite Tayini 71 3.5.3. Redükte Glutatyon (GSH) Tayini 73 v 3.5.4. Glukoz Tayini 75 3.5.5. Fruktoz Tayini 77 3.5.6. Serbest Testosteron Tayini 79 3.5.7. Leptin Tayini 80 4. BULGULAR 81 5. TARTIŞMA 82 5.1. Örnek Seçimi ve Spermiyogram Özelliklerine Göre Değerlendirme 120 5.2. MDH Aktivitesi İle İlgili Değerlendirme 121 5.3. LDH Aktivitesi İle İlgili Değerlendirme 127 5.4. GSH Düzeyi İle İlgili Değerlendirme 129 5.5. Fruktoz ve Glukoz Düzeyi İle İlgili Değerlendirme 131 5.6. Hormonlar ve Erkek Üreme Sistemi 134 5.6.1. Leptin Düzeyi İle İlgili Değerlendirme 135 5.6.2. Testosteron Düzeyi İle İlgili Değerlendirme 136 5.6.3. Seminal Sıvıda NAD-MDH Aktivitesi <20mU/ml Olan Örneklerin Değerlendirilmesi 138 6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 139 7. KAYNAKLAR 142 8. ÖZGEÇMİŞ 151 vi ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1. Antony Van Leeuwenhoek 3 Şekil 2. Antony Van Leeuwenhoek’un spermatozoa gözlemleriyle ilgili çizimleri 4 Şekil 3. Antony Van Leeuwenhoek’un sperm şekliyle ilgili olarak ilk düşünceleri 5 Şekil 4. Makler sperm sayım kamerası 12 Şekil 5. Makler sperm sayım kamerasının yakın görünümü 12 Şekil 6. Makler kamerasında semen örneğinin damlatılarak hazırlanması 13 Şekil 7. Makler kamerasında spermlerin görüntüsü 13 Şekil 8. Normal morfolojiye sahip, olgun sperm örneği 15 Şekil 9. Normal ve anormal morfolojiye sahip sperm görüntüleri 16 Şekil 10. Erkek üreme sistemi 17 Şekil 11. Testislerin yapısı 19 Şekil 12. 2. kromozom üzerinde MDH1 geninin yerleşimi 25 Şekil 13. Halofilik bir archaebacteria olan Haloarcula marismortui’de MDH yapısı 25 Şekil 14. İnsanda mNADME kompleksi 30 Şekil 15. Malik enzimin aktif bölgesi 31 Şekil 16. Malatın enzim üzerinde aktif bölgeye bağlanması 32 Şekil 17. Malik enzimin katalitik mekanizması 33 Şekil 18. LDH molekülünün yapısı 40 Şekil 19. Sistein 46 Şekil 20. Glutatyon sentezi 47 Şekil 21. Sertoli hücrelerinde de novo sentez ve glutatyon döngü sistemi 48 Şekil 22. Polyol yolu 50 Şekil 23. Leptin molekülünün 3 boyutlu moleküler yapısı 53 Şekil 24. Leptin reseptör izoformları 54 Şekil 25. Leptinin gonadal organlar üzerine etkisi 54 Şekil 26. Leptin hipotalamik-hipofiz-testiküler aks 56 vii Şekil 27. Leptinin spermatojenik hücrelerin farklılaşması ve yenilenmesi üzerinde etkileri 57 Şekil 28. Testosteronun yapısı 58 Şekil 29. FSH ve LH’ın hedef dokudaki etkinlikleri 61 Şekil 30. Fruktoz standart eğrisi 78 Şekil 31. Homojenizasyon öncesinde spermlerin morfolojik görünümü 81 Şekil 32. Homojenizasyondan sonra spermlerin morfolojik görünümü 82 Şekil 33. Spermiyogram değerlendirmesine göre grupların karşılaştırılması 114 Şekil 34. Seminal sıvıda NAD-MDH ve NADP-MDH aktiviteleri 115 Şekil 35. Seminal sıvıda LDH aktivitesi 116 Şekil 36. Seminal sıvıda GSH düzeyi 116 Şekil 37. Seminal sıvıda glukoz düzeyi 117 Şekil 38. Seminal sıvıda fruktoz düzeyi 117 Şekil 39. Seminal sıvıda serbest testosteron düzeyi 118 Şekil 40. Seminal sıvıda leptin düzeyi 118 Şekil 41. Sperm homojenatlarında NAD ve NADP bağlı MDH aktiviteleri 119 Şekil 42. Sperm homojenatlarında LDH aktivitesi 119 viii ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1. Sperm üretimi için ihtiyaç duyulan hormonlar ve etkileri 9 Çizelge 2. İnsanda seminal plazmada bulunan çeşitli maddelerin konsantrasyonları 21 Çizelge 3. İnsan semeninde bulunan steroidler 61 Çizelge 4. Grup A- Olgu yaşı, semen hacmi ve spermiyogram değerleri 84 Çizelge 5. Grup B- Olgu yaşı, semen hacmi ve spermiyogram değerleri 85 Çizelge 6. Grup C- Olgu yaşı, semen hacmi ve spermiyogram değerleri 86 Çizelge 7. Grup D- Olgu yaşı, semen hacmi ve spermiyogram değerleri 87 Çizelge 8. Grup E- Olgu yaşı, semen hacmi 87 Çizelge 9.Grup A- Seminal sıvı örneklerinde MDH (NAD/NADP) ve LDH aktiviteleri 88 Çizelge 10.Grup B- Seminal sıvı örneklerinde MDH (NAD/NADP) ve LDH aktiviteleri 89 Çizelge 11. Grup C-Seminal sıvı örneklerinde MDH (NAD/NADP) ve LDH aktiviteleri 90 Çizelge 12. Grup D- Seminal sıvı örneklerinde MDH (NAD/NADP) ve LDH aktiviteleri 91 Çizelge 13.Grup E-Seminal sıvı örneklerinde MDH (NAD/NADP) ve LDH aktiviteleri 91 Çizelge 14.Grup A- Seminal sıvı örneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz düzeyleri 92 Çizelge 15.Grup B- Seminal sıvı örneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz düzeyleri 93 Çizelge 16.Grup C- Seminal sıvı örneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz düzeyleri 94 Çizelge 17.Grup D- Seminal sıvı örneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz düzeyleri 95 Çizelge 18.Grup E- Seminal sıvı örneklerinde GSH, glukoz ve fruktoz düzeyleri 96 ix