Entwicklung und Charakterisierung von organotypischen Cornea- Konstrukten mit unterschiedlichen Epithelien für In-vitro-Permeations- und Zytotoxizitätsuntersuchungen Von der Fakultät für Lebenswissenschaften der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte D i s s e r t a t i o n von Stefanie Döhring aus Itzehoe 1. Referentin: Professor Dr. Christel C. Müller-Goymann 2. Referent: Professor Dr. Manfred Kietzmann eingereicht am: 17.12.2008 mündliche Prüfung (Disputation) am: 09.04.2009 Druckjahr 2009 Für meine Eltern Vorveröffentlichungen Vorveröffentlichungen der Dissertation Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Fakultät für Lebenswissenschaften, vertreten durch die Mentorin der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht: Publikationen Reichl S, Döhring S, Bednarz J, Müller-Goymann CC (2005) Human cornea construct HCC - an alternative for in vitro permeation studies? A comparison with human donor corneas; Eur. J. Pharm. Biopharm. 60:305–308 Tagungsbeiträge Döhring S, Reichl S, Müller-Goymann CC (2004) Comparison of the in vitro permeation of different ophthalmic drugs through a human cornea construct (HCC) and human donor corneas (Poster), International Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, Nürnberg Döhring S, Reichl S, Müller-Goymann CC (2005) Eignung humaner organotypischer Permeationsmodelle für Zytotoxizitätsuntersuchungen (Poster), 9. GD-Jahrestagung, Wien Döhring S, Reichl S, Müller-Goymann CC (2006) Qualification of human permeation models for cytotoxicity assays – A comparison of traditional monolayer studies with human cornea constructs (HCC) (Poster), 5th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, Genf Döhring S, Reichl S, Müller-Goymann CC (2006) 3D human cornea-constructs for cytotoxicity studies (Vortrag), 10th Congress of the International Society of Ocular Toxicology, Bonn-Königswinter Danksagung Danksagung Die vorliegende Arbeit entstand unter Anleitung von Frau Prof. Dr. Christel C. Müller- Goymann am Institut für Pharmazeutische Technologie der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig. Frau Prof. Dr. Christel C. Müller-Goymann danke ich herzlich für die Zuweisung des Themas, die Unterstützung bei dessen Bearbeitung sowie für die ständige Diskussionsbereitschaft und die persönliche Betreuung. Herrn Prof. Dr. M. Kietzmann danke ich für die Anfertigung des Zweitgutachtens. Ich möchte mich bei allen technischen und wissenschaftlichen Mitarbeitern des Institutes für die besonders freundliche Arbeitsatmosphäre und die gute Zusammenarbeit sowie für hilfreiche Unterstützung und fachliche Diskussionen, die zum Gelingen der Arbeit beigetragen haben, bedanken. Besonders möchte ich mich bei Frau Dagmar Hahne, Frau Britta Meier, Frau Ulrike Kruse und Frau Lucia Albrecht für ihre tolle Unterstützung und ihren Einsatz im Zellkulturlabor bedanken. Herrn Dr. Stephan Reichl und Frau Dr. Christine Hoffmann danke ich für die Einführung in die Zellkultur und die anregenden fachlichen Diskussionen. Herrn Christian Weber möchte ich für die Unterstützung bei den HPLC-Messungen danken. Weiterhin danke ich: den Hornhautbanken der Medizinischen Hochschule Hannover und des Uniklinikums Eppendorf Hamburg für die Unterstützung mit humanen scleralen Ringen und Spenderhornhäuten Herrn Dr. Jürgen Bednarz, Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde des Uniklinikums Eppendorf Hamburg, für die Überlassung der humanen cornealen Endothelzelllinie der Firma Nestec, insbesondere Frau Dr. Elizabeth Offord-Carvin vom Nestle Research Center in Lausanne, für die zur Verfügungstellung der CEPI 17 CL 4 Zelllinie Danksagung Zum Abschluss danke ich Herrn Andreas Melhorn für die tatkräftige Unterstützung bei der Erstellung dieser Arbeit. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung........................................................................................................... 1 2 Allgemeiner Teil................................................................................................. 3 2.1 Das Auge..................................................................................................... 3 2.1.1 Die äußere Augenhaut.......................................................................... 3 2.1.2 Die mittlere Augenhaut.......................................................................... 4 2.1.3 Die innere Augenhaut ........................................................................... 4 2.1.4 Die vordere und hintere Kammer.......................................................... 5 2.2 Die Cornea.................................................................................................. 5 2.2.1 Das Epithel............................................................................................ 7 2.2.2 Die Bowman-Membran ......................................................................... 7 2.2.3 Das Stroma........................................................................................... 8 2.2.4 Die Descemet-Membran....................................................................... 8 2.2.5 Das Endothel......................................................................................... 9 2.3 Ausgewählte Erkrankungen des Auges und ihre Therapie.................... 9 2.3.1 Das Glaukom...................................................................................... 10 2.3.2 Entzündliche Erkrankungen des Auges.............................................. 13 2.4 Zellkulturen............................................................................................... 16 2.4.1 Corneale Zellkulturen.......................................................................... 18 2.4.2 Organotypische Zellkulturmodelle und deren Verwendung................. 21 2.5 Corneale Absorption von Arzneistoffen................................................. 24 2.6 Tierversuche und Zellkultursysteme als Alternativmethoden ............. 27 2.6.1 Draize-Test.......................................................................................... 29 2.6.2 Alternative Zytotoxizitätsuntersuchungen............................................ 31 3 Material und Methoden................................................................................... 34 3.1 Material...................................................................................................... 34 3.1.1 Biologisches Material.......................................................................... 34 3.1.2 Arzneistoffe......................................................................................... 34 3.2 Methoden.................................................................................................. 35 3.2.1 Zellkulturen.......................................................................................... 35 3.2.2 Aufbau des Cornea-Konstrukts........................................................... 39 Inhaltsverzeichnis 3.2.3 Histologische Untersuchungen............................................................ 42 3.2.4 Permeationsuntersuchungen.............................................................. 43 3.2.5 HPLC-Bestimmung der Arzneistoffe................................................... 44 3.2.6 Physikalische Bestimmungen.............................................................. 45 3.2.7 Zytotoxizitätsuntersuchungen.............................................................. 46 3.2.8 Statistische Auswertung der Messdaten............................................. 52 4 Versuchsergebnisse und Diskussion............................................................ 53 4.1 Kultivierung und Charakterisierung der humanen cornealen Zellen... 53 4.1.1 Kultivierung der cornealen Zelllinien................................................... 53 4.1.2 Wachstumsverhalten der cornealen Zellen......................................... 57 4.1.3 Zusammenfassende Diskussion zur Kultivierung und Charakterisierung der humanen cornealen Zelllinien ..................................................................... 61 4.2 Aufbau des humanen Cornea-Konstrukts ............................................. 62 4.2.1 Humanes Cornea-Konstrukt aus Endothelzellen, Fibroblasten und Epithelzellen der Zelllinie CEPI......................................................................... 62 4.2.2 Humanes Cornea-Konstrukt aus Endothelzellen, Fibroblasten und Epithelzellen der Zelllinie HCE-T....................................................................... 65 4.2.3 Zusammenfassende Diskussion zum Aufbau der Cornea-Konstrukte 66 4.3 Permeationsuntersuchungen.................................................................. 68 4.3.1 Vergleichende Permeationsuntersuchungen durch humane Cornea- Konstrukte mit CEPI-Epithel und humane Spenderhornhaut............................. 69 4.3.2 Permeationsuntersuchungen durch humane Cornea-Konstrukte mit HCE-T-Epithel................................................................................................... 74 4.4 Zytotoxizitätsuntersuchungen an Zellmonolayern................................ 81 4.4.1 Morphologische Veränderung der Zellen durch Einwirkung von zytotoxischen Substanzen................................................................................. 82 4.4.2 Vergleichende Untersuchungen zum zytotoxischen Potential ausge- wählter Substanzen an den verschiedenen Zelllinien mittels MTT-Test............ 85 4.4.3 Vergleichende Zytotoxizitätsuntersuchung von SDS am Zellmonolayer mittels Neutralrot-Test....................................................................................... 95 4.4.4 Zusammenfassende Diskussion zu den vergleichenden Untersuchungen zum zytotoxischen Potential ausgewählter Substanzen an den verschiedenen Zelllinien.................................................................................... 97