Entwicklung und Anwendung analytischer Methoden zum Biologischen Monitoring und Biochemischen Effektmonitoring von aromatischen Aminen im Rahmen arbeits- und umweltmedizinischer Fragestellungen Den naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Tobias Weiß aus Gronau/Leine Als Dissertation genehmigt von den naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universi- tät Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2005 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder Erstberichterstatter: Prof. Dr. R. van Eldik Zweitberichterstatter: Prof. Dr. J. Angerer - 2 - Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin der Friedrich- Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg unter Betreuung von Prof. Dr. Jürgen Angerer in der Zeit von Dezember 1999 bis Januar 2004 angefertigt. Meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Jürgen Angerer danke ich für die freundliche Überlassung der interessanten Themenstellung sowie für die allzeitige Möglichkeit zum intensiven Gedankenaustausch sowohl über chemisch-analytische als auch arbeits- und umweltmedizinische Fragestellungen. Wei- terhin möchte ich mich herzlich bedanken für seine stete Förderung. Herr Prof. Dr. Rudi van Eldik aus dem Institut für Anorganische und Analytische Chemie der Universi- tät betreute diese Arbeit seitens der Naturwissenschaftlichen Fakultät II. Für die regen Diskussionen mit ihm und seinem analytischen Arbeitskreis danke ich herzlich. Darüber hinaus möchte ich mich an dieser Stelle ausdrücklich für seinen Einsatz zur Förderung der interdisziplinären Forschung innerhalb der Universität bedanken. Meinen Doktorandenkollegen möchte ich Dank sagen für die die vielen angeregten Diskussionen und wertvollen Hinweise sowohl in unseren Doktorandenseminaren wie auch sonstigen Gesprächen. Ins- besondere Heiko Udo Käfferlein, Jochen Hart, Bernd Rossbach und Axel Krämer waren mir als Kolle- gen der ersten Zeit eine große Hilfe. Mein ganz besonderer Dank gilt Mariano Gonzales, Holger Koch, Thomas Schettgen und Nicole Gaidischki. Sie begleiteten mich nahezu über die ganze Zeit am Institut und waren stets Ansprech- und Diskussionspartner zu beruflichen wie aber auch privaten Angelegen- heiten. Herrn Johannes Müller gilt mein besonderer Dank. Bei technischen Problemen bzgl. der Kapillar- gaschromatographie und der Massenspektroskopie war er stets eine große Hilfe. Frau Kathleen Meier und Herrn Jan Irmler danke ich für ihre tatkräftige Unterstützung insbesondere bei der routineseitigen Kontrolle der Reagenzienleerwertproblematik. Frau Kerstin Kress danke ich für technische Optimie- rung der Hämoglobinisolierung für die Routine und Frau Annette Braun für Ihre Unterstützung bei der Isolierung des Hämoglobins. Allen anderen Mitarbeitern des Instituts danke ich für die vielfältigsten Unterstützungen und das nette Arbeitsklima. Allen noch einmal herzlichen Dank für die äußerst schöne Zeit! Ich danke dem Forschungszentrum Karlsruhe für die finanzielle Unterstützung im Programm "Leben und Gesundheit (BW-PLUS)", ohne die die Arbeiten dieser Dissertation nicht möglich gewesen wären. - 3 - Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 8 1 Einleitung 10 1.1 Expositionskontrolle 10 1.1.1 Ambient Monitoring 11 1.1.2 Biological Monitoring 12 1.1.2.1 Dosismonitoring 13 1.1.2.2 Biochemisches Effektmonitoring 14 1.1.2.2.1 Biochemisches Effektmonitoring unter Verwendung von Hämoglobin- Addukten im Blut 16 1.1.2.3 Biologisches Effektmonitoring 17 2 Zielsetzung der Arbeit 17 3 Aromatische Amine 18 3.1 Parameterauswahl 19 3.2 Eigenschaften aromatischer Amine 19 3.3 Vorkommen und Verwendung 21 3.4 Aufnahme, Verteilung, Metabolismus 25 3.5 Toxikologie 33 3.5.1 Akute und chronische Toxizität 33 3.5.2 Mutagenität 35 3.5.3 Kanzerogenität und Blasenkrebs 35 3.6 Bestimmung aromatischer Amine im Urin 38 3.6.1 Grundlage des Verfahrens 38 3.6.2 Geräte, Chemikalien und Lösungen 38 3.6.2.1 Geräte 38 3.6.2.2 Chemikalien 39 3.6.2.3 Lösungen 40 3.6.2.4 Vergleichsstandards 41 3.6.2.5 Qualitätskontrollmaterial 42 3.6.2.6 Interne Standards 43 3.6.3 Probennahme und Probenvorbereitung 43 3.6.3.1 Probennahme und Lagerung 43 3.6.3.2 Probenaufarbeitung 43 3.6.4 Gaschromatographisch-massenspektroskopische Arbeitsbedingungen 45 - 4 - Inhaltsverzeichnis 3.6.5 MS – Arbeitsbedingungen 45 3.6.6 Analytische Bestimmung 46 3.6.7 Kalibrierung 48 3.6.8 Berechnung des Analysenergebnisses 48 3.6.9 Standardisierung und Qualitätssicherung 48 3.6.10 Beurteilung des Verfahrens 49 3.6.10.1 Präzision 49 3.6.10.2 Richtigkeit 50 3.6.10.3 Nachweisgrenzen 51 3.6.10.4 Störeinflüsse 51 3.6.11 Diskussion der Methode 53 3.7 Bestimmung aromatischer Amine im Blut als Addukte am Hämoglobin 59 3.7.1 Grundlage des Verfahrens 59 3.7.2 Geräte, Chemikalien und Lösungen 59 3.7.2.1 Geräte 59 3.7.2.2 Chemikalien 60 3.7.2.3 Lösungen 61 3.7.2.4 Vergleichsstandards 62 3.7.2.5 Interne Standards 64 3.7.3 Probennahme und Probenvorbereitung 65 3.7.3.1 Probennahme 65 3.7.3.2 Lagerung 65 3.7.3.3 Erythrozytenisolierung 65 3.7.3.4 Hämoglobin-Isolierung 66 3.7.3.5 Probenaufarbeitung 67 3.7.4 Gaschromatographisch-massenspektroskopische Arbeitsbedingungen 68 3.7.5 MS – Arbeitsbedingungen 68 3.7.6 Analytische Bestimmung 69 3.7.7 Kalibrierung 70 3.7.8 Ermittlung der Reagenzienleerwerte 71 3.7.9 Berechnung des Analysenergebnisses 71 3.7.10 Standardisierung und Qualitätssicherung 71 3.7.11 Beurteilung des Verfahrens 72 - 5 - Inhaltsverzeichnis 3.7.11.1 Präzision 72 3.7.11.2 Richtigkeit 73 3.7.11.3 Nachweisgrenzen 74 3.7.11.4 Störeinflüsse 74 3.7.12 Diskussion der Methode 76 3.8 Methodenanwendung bei beruflich exponierten Arbeitnehmern 84 3.8.1 Biologisches Monitoring als Instrument zur Etablierung von Schutzmaßnahmen bei beruflicher Belastung durch 4,4’-Methylendianilin (MDA) 84 3.8.1.1 Einleitung 84 3.8.1.2 Kollektive und Methoden 84 3.8.1.3 Ergebnisse und Diskussion 85 3.8.2 Untersuchungen zur Frage der inneren 2-Naphtylaminbelastung bei Arbeitern aus der Strangpechherstellung unter Anwendung von Biologischem Monitoring und Biochemischen Effektmonitoring 88 3.8.2.1 Einleitung 88 3.8.2.2 Kollektive und Methoden 88 3.8.2.3 Ergebnisse und Diskussion 90 3.8.3 Untersuchungen zur Effektivität von Schutzmaßnahmen bei beruflicher Belastung durch Trinitrotoluol (TNT) 96 3.8.3.1 Einleitung 96 3.8.3.2 Kollektive und Methoden 96 3.8.3.2.1 Analytik aromatischer Amine im Urin (Biologisches Monitoring) 98 3.8.3.2.2 Analytik der Hämoglobin-Addukte aromatischer Amine (Biochemisches Effektmonitoring) 98 3.8.3.2.3 Biologisches Effektmonitoring 100 3.8.3.3 Ergebnisse und Diskussion 100 3.9 Methodenanwendung bei umweltbedingten Expositionen 106 3.9.1 Belastung der Bevölkerung der Bundesrepublik Deutschland mit aromatischen Aminen 106 3.9.1.1 Einleitung 106 3.9.1.2 Kollektive und Methoden 111 3.9.1.2.1 Kollektive 111 3.9.1.2.2 Analytik aromatischer Amine im Urin (Dosismonitoring) 111 - 6 - Inhaltsverzeichnis 3.9.1.2.3 Analytik von Cotinin im Urin (Dosismonitoring) 111 3.9.1.2.4 Analytik der Hämoglobinaddukte aromatischer Amine (Biochemisches Effektmonitoring) 112 3.9.1.2.5 Auswertung 112 3.9.1.3 Ergebnisse und Diskussion 112 3.9.1.3.1 Biological Monitoring (Dosismonitoring) 112 3.9.1.3.2 Biochemical Effect Monitoring 121 3.9.1.3.3 Korrelation Biochemical Effect Monitoring, Biological Monitoring 131 3.9.1.3.4 Quellenbetrachtung und Modellrechnung 134 3.9.1.3.5 HERP-Index 144 3.9.1.4 Schlussfolgerungen 147 4 Gesamtzusammenfassung 151 5 Literatur 156 Anhang - 7 - Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 2NA 2-Naphtylamin 34DClA 3,4-Dichloranilin 35DClA 3,5-Dichloranilin 3ClA 3-Chloranilin 4A26DNT 4-Amino-2,6-dinitrotoluol 4A5NT 4-Amino-5-nitrotoluol 4ADP 4-Aminodiphenyl 4ClA 4-Chloranilin AA Aromatische Amine ADI Acceptable daily intake BAT Biologischer Arbeitsstofftoleranzwert BgVV Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinär- medizin (Jetzt Bundesamt für Risikobewertung (BfR) BLW Biologischer Leitwert DNA Desoxyribonukleinsäure DTA Duldbare tägliche Aufnahme ECD Elektroneneinfangdetektor ED Elektrochemischer Detektor EI Elektronenstoßionisation EKA Expositionsäquivalente für krebserzeugende Arbeitsstoffe g Erdbeschleunigung GC Gaschromatographie, Gaschromatograph HFBA Heptafluorbuttersäureanhydrid HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie HRMS Hochauflösende Massenspektrometrie IS Interner Standard KG Körpergewicht MAK Maximale Arbeitsplatzkonzentration MS Massenspektroskopie MSD Massenselektiver Detektor m-T m-Toluidin, 2-Methylanilin MW Mittelwert - 8 - Abkürzungsverzeichnis n Anzahl NA Naphtylamine NAT N-Acetyltransferase NCI Negative chemische Ionisation NR Nichtraucher o-A o-Anisidin, 2-Methoxyanilin o-T o-Toluidin, 1-Methylanilin PFPA Pentafluorpropionsäureanhydrid PSM Pflanzenschutzmittel p-T p-Toluidin, 3-Methylanilin R Raucher RT Raumtemperatur SIM Single Ion Monitoring SPE Festphasenextraktion TRGS Technische Richtlinie für Gefahrstoffe TRK Technische Richtkonzentration TIC Total Ion Count UBA Umweltbundesamt - 9 - Expositionskontrolle 1 Einleitung 1.1 Expositionskontrolle Die Arbeits- und Umweltmedizin hat vornehmlich die Aufgabe der gesundheitlichen Prävention von Arbeitnehmern am Arbeitsplatz bzw. von beruflich unbelasteten, aber über die Umwelt Schadstoff-exponierten Menschen. Um diese Aufgabe zu erfüllen, bedient sich die Arbeits- und Umweltmedizin verschiedener Strategien zur Expositi- onskontrolle. Im Bereich der arbeits- und umweltmedizinischen Toxikologie stellt das Biological Monitoring eine Maßnahme der Individualprävention dar, bei der das Ausmaß der Schadstoffbelastung des Menschen und der daraus resultierenden gesundheitlichen Beanspruchung abgeschätzt wird (Zielhuis 1980; Angerer & Gündel 1996; Kommis- sion Human-Biomonitoring des Umweltbundesamtes 1996; Schaller & Angerer 1998). Beim Biological Monitoring unterscheidet man heute zwischen dem Dosismonitoring, dem Biochemischen Effekt Monitoring und dem Biologischen Effektmonitoring. Das Dosismonitoring befasst sich mit der Bestimmung der Schadstoffe bzw. ihrer Metabo- liten in Körperflüssigkeiten. Als biochemisches Effektmonitoring wird die Quantifizie- rung von Reaktionsprodukten mutagener Substanzen mit der Erbsubstanz bezeich- net. Als Surrogat für die DNA werden dabei Proteine bzw. deren Addukte mit muta- genen Substanzen betrachtet. Von einem biologischen Effektmonitoring sprechen wir, wenn erste Reaktionen des Körpers auf die Schadstoffbelastung messbar sind, z.B. die Veränderung von Enzymaktivitäten (Induktion/Inhibition) oder auch geneti- sche Parameter. Abbildung 1 gibt einen Überblick über die verschiedenen Mess- und Kontrollstrategien der Arbeits- und Umweltmedizin. Dabei steigt die prädiktive Bedeu- tung innerhalb des Biological Monitoring im Hinblick auf die gesundheitlichen Auswir- kungen vom Dosismonitoring über das biochemische Effektmonitoring zum biologi- schen Effektmonitoring an (Angerer 2001, Angerer 2003). - 10 -