Una visión de la célula T I-¡a célulae sl a unidadb ásicae nb iologíaC. adao rganismo desdel a cortezad e los árbolesh astae l espermah umano. o bien esu na únicac élulao estáf ormadop or célulasP. or Uno de esosc ientíficosf ue Robert Hooke, conservador lo tanto,ú nicamentep odremosa preciarla sc apacidadeys de instrumentosd e la RoyalS ocietyd e Londres.E n 1965, las limitaciones de los organismosv ivos, tanto animales Hooke empleóu n microscopioc onstruidop or él mismo como vegetaleos microorganismoss,i comprendemolsa para examinars eccionesfi nas de corcho cortadasc on un estructuray la función de lasc élulas. cortaplumasO. bservóu nar edd ep equeñosc ompartimen- Estamose n medio de una revoluciónd e la biologíaq ue tos en forma de cajaq ue le recordarona un panal.H ooke ha traídoc onsigotr emendosa vancees n el entendimientod e denominó a esosp equeñosc ompartimentosc ellulaeu n términod ell atín ques ignifica< pequeñahsa bitaciones>E.l cómo estánc onstruidasla s célulasy de cómo realizanl as término actuald e célulap roceded e estap alabra. complicadafsu ncionesn ecesariapsa ral a vida.L anattraleza En realidad,l o que Hooke observón o eranc élulass ino dinámicad e la célulae sp articularmentes ignificativac, omo Ias paredesc elularesv acíasd e un tejido vegetalm uerto, sep one de manifiestop or su capacidadd e crecerr,e produ- que esl o quer ealmentee sl a cortezad el os árboles.S in em- cirsey especializarsye p, or su habilidadp arar espondear bargo,H ooke no pensóe n sus cellulaec omo estructuras estímulosy adaptarsae cambiose n el medioa mbiente. muertasy a que él no entendíaq ue pudiesene starv ivas. La propia biologíac elulare stác ambiandoa l tiempo Aunques ed io cuentad e quel asc élulase n otros tejidosv e- que científicosd e diversasd isciplinasr elacionadasd irigen getalese stabanll enasd e lo que el llamó <jugos>p, refirió suse sfuerzosh aciae l objetivoc omún de la adecuadac om- concentrarseen lasp rominentesp aredesc elulareqs ueh a- presiónd e cómo funcionanl asc élulasL. a convergencidae bía encontradoi nicialmente. la citologlal,a genéticay la bioquímicah a hechod el a bio- Una de las limitacionesi nherentesa las observaciones logíac elularm odernau na de lasd isciplinasm áse xcitantes de Hooke consistee n que su microscopioa umentabaú ni- y dinámicasd e la biologíac ontemporánea. camente3 0 veceslo s objetosl,o cual dificulta el aprendizaje En estec apítulot rataremosb revementelo s principiosd e dela organizaciónin terna de lasc élulasE. steo bstáculof ue la biologíac elularc omod isciplinaL. uegoc onsideraremolass superadou nos añosm ást arde por Antonie van Leeuwen- tresc orrientesp rincipalesq ueh an dadol ugara la compren- hoek, un comercianteh olandésq ue dedicó gran parte de sión actuald e lo que son las célulasy de cómo funcionan. su tiempo libre a diseñarm icroscopiosV. an Leeuwenhoek fabricó lentesp ulidas a mano que podían magnificar los objetosc asi3 00v ecesU. tilizandoe stasle ntesm ásp otentes, La teoría celular: una historia breve fue el primero en observarc élulasv ivas,i ncluyendoc élulas sanguínease, spermatozoidesy organismosu nicelulares La historia de la biología celular comenzó hace más de 300 presenteesn el aguad el asc harcasC. omunicós uso bserva- años cuando algunos científicos europeos comenzaron a cionesa la RoyalS ocietye nunas eried e artículosd urantee l enfocar sus microscopios a diversos materiales biológicos, ultimo cuarto del siglo xvn. Sus descripcionesd etalladas Lat eoríac elularu: nah istoriab reve Ane xo lJNronnES DE MEDTDAE N BIoLocÍA CELULAR El desafíod e la comprensiónd e la estructuray organización Conociendoq ue realmentes ólo hay dos unidadesú tilesp ara celulars ec omplicap or el problemad el tamaño.L a mayoríad e expresalra dimensiónd e la mayoríad e estructurasq ue nos las célulasy suso rgánuloss on tan pequeñosq ue no puedens er interesany mediantel a ilustraciónd e diversase structurasq ue observadosd irectamentep or el ojo humano.A demás,la s puedens erm edidasa propiadamentec on cadau na de esas unidadese mpleadasp ara medirloss on poco familiaresp ara unidadesE. l micrómetro (¡¿m)e sl a unidad mású til para muchose studiantes¡ por lo tanto, a menudo son difícilesd e expresare l tamañod e las célulasy de los orgánulosm ás apreciarE. l problemap uedea bordarsed e dos maneras: grandes.1 ¡rm (algunasv ecesta mbiénl lamado miua) '10 ¡rm Núcleos f."')\ ¿Ía'l W Mitocondria @ Cloroplasto Célulav egetal Célulaa nimal Bacteria (20 x 30 ¡rm) (20p ,m) (1x 2 p.m) Figura1 A.1 El mundod elm iclómetlo. Casit odasl asc élulasy algunosd e suso rgánulosm ás grandesc,o moe l núcleom, itocondriasy cloroplastosso ne structuracso nd imensioneqsu e puedenm edirsec onvenientemeneten micrómetros. dan testimonio de la calidad de susl entesy de su profunda mayor capacidadd e aumento y a una mejor resolución,d e capacidadd e observación. forma que se pudieron distinguir estructuras separadas Dos factoresr estringieron la comprensión de la natura- únicamente por 1 micrometro (¡-rm).( Un micrómetro es leza de las células.U no fue la resolución de los microsco- igual a 10-6 m, o a la millonésima parte de un metro; véa- pios de la época, que era limitada incluso en los mejores seA nexo 1A para una discusión de las unidadesd e medida instrumentos de van Leeuwenhoek.E l segundof actor,p ro- apropiadase n biología celular.) bablemente más fundamental, fue la naturaleza esencial- El botánico iriglésR obert Brown, a¡rdado por la mejo- mente descriptivad e la biología del siglo xvr. Éstaf ue bá- ra de las lentes,d escubrió que cada planta que observaba sicamenteu na época de observación en la que se dedicó contenía una estructura redondeadaa la que élllamó nu- poco esfuerzoa pensar en explicar los intrigantes detalles cleus,u n término latino derivado del germánico <kernel: estructurales de los materiales biológicos, que estaban grano). En 1838,s u colegaa lemán Matthias Schleidena l- empezando a residir en la capacidadd e las lentes del mi- canzólaimportante conclusión de que todos los tejidos ve- croscopio. getalese stánc ompuestosp or célulasy de que un embrión Pasóm ás de un siglo antes de que la combinación de vegetals eo rigina siemprea partir de una única célula.S ólo microscopistasc on mentes más experimentalesj,u nto con un año más tarde Theodor Schwannc omunicó conclusio- las mejoras de los microscopios,d ieran lugar a una seried e nes semejantesr espectoa los tejidos animales,d esechán- avancesq ue culminaron en el entendimiento de la impor- dose así las especulacionesa nterioresd e que las plantas y tancia de las célulase n la organizaciónb iológica. En Ia dé- los animalesn o sep arecene structuralmente.E s fácil com- cada de 1930,l as mejoras en las lentes condujeron a una prender cómo se pudieron originar esase speculaciones. Capítul1o Unav isiónd el ac élula correspondea la millonésimap arte de I m. En generall as célulasb acterianasti enenu n diámetrod e pocosm icrómetros,y las célulasa nimalesy vegetalesso n de 10 a 20 vecesm ásg randes rfrtrffifftrilffir.J^_ en cualquierad e susd imensionesL. os orgánulosc omo mitocondriasy cloroplastosti endena tener diámetroso süuügg1ügüM longitudesd e unos pocosm icrómetrosy son por lo tanto comparablese n tamañoa las célulasb acterianasc ompletasL. os Membrantaíp ica orgánulosm ásp equeñose stánh abitualmentee n el rango de 0,2-l pm.C omo reglag enerals, i algo sep uedev er con un 25 nm- -l microscopioó ptico,s usd imensionesp uedene xpresarse Ribosombaa cteriano probablementee n micrómetros,y a que el llmite de resolución del microscopioó ptico esa lrededord e 0,2-0,35¡ lm. La Figura 1A.l ilustra diversase structurasq ue usualmentes em iden en t micrómetros. El nanómetro (nm), por otro lado esl a unidad ques ee mplea param oléculasy estructurass ubcelulareqsu e son demasiado I pequeñaso demasiadod elgadasp ara sero bservadacso n un T microscopioó ptico. I nanómetroe su na billonésimap arte de 1 m (10-e).I micrómetroe si guala 1.000n anómetros(.U n término alternativoa nanómetroe sp or lo tanto milimicra,mp). T Como referenciae n la escalad e los nanómetrosu n ribosoma tieneu n diámetrod e unos 25-30n m. Otrase structurasq ue puedens erm edidase n nanómetross onl os microtúbulos, T microfilamentosm, embranasy moléculasd e DNA' En Ia Figura 1A.2s ei ndicanl as dimerrsioneds e estase structuras. Otra unidad usadaf recuentementee n biologla celulare se l 25 nm- ----J 7nm 2nm ángstrom (A) que correspondea 0,1 nm. En particular,I as Microtúbulo Microfilamento Héliced e DNA dimensionesm olecularess ee xpresanfr ecuentementee n ángstrom.S in embargo,d ebido a que el ángstroms ed iferencia Figura1 A.2 Elm undod eln anómetlo' Losr ibosomasm, embranas, del nanómetros olamentep or un factor de 10,a ñadep oca microtúbulosm, icrofilamentoys la dobleh éliced e DNA son flexibilidadp ara expresiónd e dimensionesa nivel celulary por estructuracso n dimensioneqsu es ep uedenm edir lo tanto no seráe mpleadoe n estet exto. convenientemeneten nanómetros. Despuéds et odo,lasp aredesd el asc élulasv egefalecso nsti- 2. La célulae sl a unidad básicad e la estructurad e to- tuyenb arrerase ntrel asc élulasq ues onv isiblesi nclusoc on dosl os organismos. un microscopioo rdinario, mientrasq ue lasc élulasa nima- Menosd e 20 añosd espuéss ea ñadióu n tercerp rinci- les,q ue carecend e paredc elular,s on mucho más difíciles pio. Éstes e generóa partir de la descripcióno riginal de de distinguir en una muestrad e tejido. IJnicarnentec uan- Brown de los núcleos,s uplementadap or Kart Nágelip ara do Schwanne xaminóc élulasd e cartílagos e convenciód e incluir suso bservacionesso brel anaturalezad e la división las similitudesf undamentalese ntre los tejidos animalesy celular.H acia 1855,e l fisiólogoa lemánR udolf Virchow vegetalesy,a quel asc élulasd el cartílagoa, l contrario quel a concluyóq ue las célulass e generanú nicamentem ediante mayorlad el asc élulasa nimalest,i enenl lmitesb ien estable- la división de otrasc élulasp reexistentesV.i rchow describió cidos por depósitosg ruesos de fibras de colágeno. estac onclusióne n la ahoraf amosaf rased el latín omnisc e- Schwannr eunió todas estaso bservacionese n una teorla llula e cellula,c uya traducción se convierte en el tercer unificadad e la organizaciónc elular,q ue seh a mantenido principiod el a teorlac elularm oderna: antel a pruebad el tiempo y que continúas iendol a based e nuestro entendimientod e la importancia de las célulasy 3. Todasl as célglass eo riginan únicamentea partir de de la biologíac elular. célulasp reexistentes. La teoria celular tal y como fue originariamentep ostu- Asl, la célulan o ess ólo la unidad básicad e la estructu- ladap or Schwannt iene dos principios importantes: ra de todosl os organismoss ino tambiénl a unidadb ásica 1. Todosl os organismosc onsistene n una o más cé- de reproducción.E n otras palabras,t odas las formas de lulas. vida tienen una basec elular.E ntoncesn, o resultas orpren- Lat eoríac elulanu nah istoriab reve denteq ue el entendimientod e las célulasy de susp ropie- Los logros recientese n la rama de la genéticain cluyen dadess eat an fundamentalp ara la apreciaciónc orrectad e la secuenciaciódne los genomasintegro(sto do el DNA) del otrosa spectodse la biología. hombrey de otrase specieys e l clonaje(p roducciónd e or- ganismosi dénticosg enéticamented) e mamíferosi nclui- dos ovejasy gatos. La emergencia de la teoría celular El entendimientod e la biología celular actuals upone, moderna por lo tanto,l a apreciaciónd e susd iversasra ícesy de la im- portancia de las contribucionesq ue cada una de las co- La teoríac elularm odernai mplica el entretejidod e tresh e- rrientesq ue la componenh an realizadop ara nuestro en- braso ramasd iferentese n una única cuerda.C omo ilustra tendimiento de lo que una célula es y de lo que puede la Figural .l, cadau na de estasra mast ieneo rígenesh istó- hacerA. continuacións ed iscuted e manerab revec adau na ricos diferentesy, la mayor parte de su entrelazamientos e de lasc orrientesh istóricasd e la biologíac elulars i bien ob- ha producido úriicamentee n los últimos 75 años. Cada tendremosu na apreciaciónm ásc ompletac uandoe xplore- rama debes er apreciadain dependientementdee que cada mos diversosa spectosd e la estructura,l a función y Ia ge- una aporta una contribución independientey significati- néticac elulare n otros capítulos. va.L osb iólogosc elularesc ontemporáneodse benc onocer adecuadamentec ada una de las ramas, independiente- La ramad e la citologfae stud¡al a estructurac elular mented e susi nteresesin mediatos. La primera de esasr amash istóricase sl a citología, que Hablandoe strictamentela, citologíae s el estudiod e las principalmente se preocupa de la estructura celular. (El células( de hecho,e l significadoli teral de la palabrag rie- prefijo griego cyto-,a l igual que el sufijo -cito significac é- ga cytos< recipienteh ueco>,e ncajab ien con la impresión lula). Como ya hemosv isto,l a citologíat iene suso rlgenes inicial de Hooke de las células).S in embargo,h istóri- hacem ás de 300 añosy su desarrolloi nicial dependióe n camentel a citologías e ha ocupadop rincipalmented e granm edidad el a microscopíaó ptica.L ai ncorporaciónd e estructurac elular,f undamentalmentea travésd el uso de la microscopíae lectrónicay de diversasté cnicasó pticasr e- técnicasó pticas.A quí se describenb revementea lgunos lacionadasc on éstah a conducidoa un considerablein cre- aspectosd e la microscopíaq ue han sido importantese n mento de la actividady el entendimientod e la citolología. biologíac elularV. éasee l apéndicep arau na discusiónm ás Lasc ontribucionesd e la bioquímica a nuestroe ntendi- detallada. miento de la función celularr epresentala segundara ma.L a mayorp arted e los avancees n estec ampos eh an producido Elm icroscopióop tico. El microscopioó ptico fue la prime- en los riltimos 75 años,a unqued e nuevo,s uso rlgenesr e- ra herramientad e los citólogosy continúat eniendou n pa- trocedenm ucho máse n el tiempo.E l desarrollod e técnicas pel fundamental en nuestra elucidaciónd e la estructura comol a ultracentrifugaciónla, cromatografiay Ia electrofo- celular.L a microscopíaó ptica posibilitó a los citólogosl a resis,h a sido especialmentiem portante para la separación identificación de estructurasr odeadasp or membranas de los componentesc elularesy molecularesL. a utilización como núcleosm, itocondriasyc loroplasfoesn diversosd e ti- de compuestosm arcadosra dioactivamenteen el estudiod e pos celulares.E stase structurass e denominan orgánulos reaccionecsa talizadaesn zimáticamentye de rutasm etabó- (<pequeñoósr ganos>y) su presenciae su na característica licash a supuestoo tra contribuciónm uy significativad e'la prominented e la mayorp arted e célulasa nimalesy vegeta- bioqulmica a nuestro entendimientod e cómo funcionan les( peron o de bacterias). lasc élulasE. n capítuloss ucesivodse tallaremosé stasy otras Otros avancess ignificativosi ncluyen la invención del técnicasr elevantesc uandos u entendimientos ean ecesario micrótomo en 1870y la disponibilidadm, ás o menosa l para explorard iversosa spectosd e la estructuray función mismo tiempo,d e diversosti ntesy colorantesU. n micróto- celular.V éasela Guía de Técnicasy Métodosa djuntap ara mo esu n instrumentoq ue permite obteners eccionefsin as Tocalizadr iscusionesso bret écnicase specíficas. a partir de muestrasb iológicas,n ormalmented espuésd e La tercerar ama es la genética.S u recorrido histórico que éstash an sido deshidratadaes incluidase n parafinao retrocedem ásd e 150a ñosh astaG regorM endel.S in em- plástico.L a técnicap osibilita la preparaciónr ápida y efi- bargo,d e nuevo gran parte de nuestro entendimientoa c- ciented e seccionesfi nas de tejido de un grosoru niforme. tual de la genéticah a surgidod urantel os últimos 75 años. Losc olorantesq,u eh and esempeñaduon papelt an impor- La demostraciónd e que el DNA (ácido desoxiribonuclei- tante en la tinción y la identificaciónd e estructurass ubce- co) es el portador de la información genéticae n la mayor lulares,f ueron desarrolladosp rincipalmentee n la segunda parte de las formas de vida, y especificae l orden de subu- mitad del siglox x por químicosi ndustrialesa lemanestr a- nidadesy, de ahí lasp ropiedadesd e lasp roteínasr esponsa- bajandoc on derivadosd el alquitrán. bles de la mayoríad e las característicafsu ncionalesy es- Éstosy otros avancesre lacionadosj,u nto con la mejora tructuralesd e lasc élulasc, onstituyóu n hito especialmente de la ópticay la generaciónd e lentesm áss ofisticadasc,o n- importantee n'lar amad el a genética. dujeron a la microscopíaó ptica tan lejos como podía ir, Capitul1o Unav isiónd el ac élula cÉLULAB IoLÓG¡CA Espectroscopidae masase mpleada Se desarrollala bioinformática oarae studiaro roteomas Daraa nalizarl os datos de secuenciación 2000 Secuenciaciódne l genomah umano- Spae reamg pelneearl aa rei mstáegreeon-emstri cidrolmsceonpsíeiaol encatlreósnica Utilizaciónd e la proteínaf luorescentev erde Se clona la oveja Dolly oara detectaro roteínasf uncionalese n célulasv ivas AIleny Inouép erfeccionaron Producciónd e los primerosa nimalestr ansgénicos la vídeo-microscopídae contraste Se desarrollaronlo s métodos Heuser,R eesey colaboradoresd esarrollan 19 75 de secuenciaciódne l DNA last écnicasd el grabadop or congelación Berg,B oyery Cohend esarrollan last écnicasd e clonaciónd el DNA Se elucidae l códigog enético Palade,S jostrandy Porterd esarrollan Kornbergd escubrel a DNAp ollmerasa técnicasd e microscopíeal ectrónica Watsony Crickp roponenla dobleh élicep arae l DNA 19 50 Avery,M acleod y McCartym uestranq ue el Hersheyy Chasee stablecenq ue el DNAe s el materiagl enético DNAe s el agented e transformaciógne nética Claudea íslal as primerasfr accionesm ltocondriales Krebsd escubree l ciclod e losT CA lnvenciónd el microscopioe lectrónico Svedbergd esarrollal a ultracentrífuga Leveneo ostulao ue el DNAt iene una estructurar epetidad e tetranucleótldos 1925 Embdeny Meyerhodf escriben la víad e la glucolisis Morgany colaboradoredse sarrollan la genéticad e Drosophila 19 00 Corrensv,o nT schermayk d e Vries Buchneyr Buchnedre muestralan Suttofno rmulala redescubrelans l eyesd e Mendel fermentaciócno ne xtractocse lulares Se describe teorÍacr omosóm¡ca el complejo !u^c tt^d hI t^g.t^g^t^ i^tuta ¡vlva lv}nvl'nvi' Rouxy Weissman: los cromosomass on 1875 lnvención portadoresd e la del micrótomo informaciógne nética Miescherd escubree l DNé. Mendelf ormulas us leyes Pasteuurn eo rganismos Desarrolldoe Flemmlngid entifica fundamentaledse la genética vivosa procesoes specíficos tintesy colorantes los cromosomas Virchowc: ada KóllikerdescribeG ENÉTICA 18 50 célulap rocede las mitocondrias de otrac élula en célulasm usculares Scheleiden y Schwannf ormulan la teoríac elular 1825 Brownd escribe losn úcleos BIOQUIMICA 18 00 17 00 Van Leeuwenhoekm ejoral as lentes Hooked escribel as .células" 16 00 CITOLOGiA Figura1 .1 La línead el tiempo en biolo$a celular. Aunque la citología, la bioquímica y la genéticac omenzaron como disciplinas separadas, seh an ido uniendo progresivamented esdee l segundoc uarto del siglo rr. Lae mergencdieal at eoríace lulamr oderna hastal os límites de la resolución determinadosp or la lon- i0 m gitud de onda de la luz visible.T á1yc omo see mplea en mi- croscopía, el límite de resolución hace referencia a cómo de separadost ienen que estar los objetos adyacentesp ara r' '. ser distinguidos como entidades separadas.P or ejemplo, "' Longitudd e algunas afirmar que el límite de resolución de un microscopio esd e célulasn erviosas 400 nanómetros (nm) significa que los objetos necesitan ,y, *I. ,t^u^D.,utu^r-d^t^vJ estar separadosa l menos 400 nm para ser reconocidos 0,1m como entidadess eparadasm, ientras que una resolución de 200 nm significa que se pueden distinguir objetos separa- dos tan sólo por 200 nm (un nanómefroe s 10 e metros; 1 nm : 0,001¿ rm).C uanto más pequeño ese l límite de re- 1 cm solución de un microscopio, mayor es su poder de resolu- ción. Expresadoe n términos de ,1,l a longitud de onda de la luz usadap ara iluminar la muestra, el límite de resolución 1 mm teórico para el microscopio óptico es d,eA l2. EI límite de resolución parala luz visible, en un rango de longitudes de onda de 400-700n m, es de alrededord e 200-300n m. La Figura 1.2 ilustra el rango útil del microscopio óptico I roopm compara su poder de resolución con el del ojo humano y el del microscopioe lectrónico. Células eucarióticas Visualizaciódne célulasv ivas, El tipo de microscopía des- 10¡ rm Núcleo crito hastaa hora se denomina microscopíad e campoc laro, Mayoría porque la luz blancap asad irectamentea travésd e Ia mues- de bacterias tra, Ia cual puede estart eñida o no, dependiendo de las ca- Mitocondria = racterísticase structuralesq ue vayamosa examinar.U na li- E. mitación significativa de esta aproximación es que las F muestrasd eben estar fijadas (preservadas)d, eshidratadas, LJIJ LIJ e incluidas en parafina o en plástico.L a muestra por lo tan- to no estaráv iva, lo que conlleva la posibilidad de que al- ño- gunas de las característicaso bservadasc on este método, U) puedan ser artefactoso distorsionesd ebidasa l procesod e c fijación, deshidratacióno de inclusión. Para solventare sta = desventaja,s e han desarrollado diversast écnicas ópticas especialesq ue hacenp osible observard irectamentec élulas vivas. Entre éstas,s e incluyen la microscopía de contraste de fase,l a microscopía de contraste de interferencia dife- Hequenas .41 v renciall a microscopíad e fluorescencial,a microscopíac on- motecutas focal y Ia videomicroscopía digital. La Tabla 1.1 muestra imágeneso bservadasc on cada una de esast écnicasy las 0,1n m compara con imágenes observablesc on microscopía de Flgura1 "2 Microscopeíale ctrónicdae b anido. Seu tilizóu n campo claro para muestras teñidas y sin teñir. Cada una microscopieol ectrónicdoe b arridop arav isualizacré lulads e de estast écnicass e discutirá en el apéndice;e n este mo- neuroblastomhau mano( a)y un granod ep olen( b). mento nos conformaremos con una breve descripción de cadau na de ellas. La microscopíad e contrasted e fase y de contrasted e in- que sep uede cambiar de un modo de uso a otro intercam- terferenciad iferencialh acen posible observar claramente biando componentesó pticos. célulasv ivas (véaseTabla1 . 1) . Estasd os técnicasi ncremen- La microscopíad ef luorescenciaposlbilitaa los investiga- tan y amplifican los pequeños cambios de fase de la luz dores detectar proteínas específicasu otras moléculas al trasmitida,c uando éstaa traviesau na estructuraq ue tiene hacerlasf luorescentesm ediante el acoplamientod e un co- distinto índice de refracción que el medio que la rodea.L a Iorante fluorescente.S e puede estudiar la distribución de mayoria de los microscopiosó pticos actuales,a demásd e la diferentest ipos de moléculase n Ia misma célula mediante simple transmisión deluz, están equipados con contraste el uso simultáneo de dos o más de estosc olorantes,c ada de fase y contraste de interferencia diferencial, de forma uno acopladoa un tipo de molécula. Capítu1lo Unav isiódne l ac élula Tabla1 .1 Comparacieónnt red istintotsi posd em ictoscopóiap tica Campo claro (muestras in teñir): Contrasted e fase:i ncrementae l la luz pasad irectamentea travésd e contrasted el asc élulass in teñir la muestra;l a imagent ienep oco amplificando1 asv ariacionese n el contrastea no serq ue seau na céiula índice de refracciónd entro de la pigmentadao que set iña muestra;e se specialmentúet il para examinarc élulasv ivass in artificialmente. pigmentación. Campo claro (muestrat eñida): Contraste de interferencia la tinción con diversosc oiorantes üferencial: empleat ambién incrementae l contrastep ero los modificacionesó pticasp ara protocolosd e tinción requierenq ue exageralra s diferenciasd e los las célulase sténf ijadas índicesd e refracción. (preservadas). Fluorescenciam: uestraI a Confocal empleal uz lásery un localizaciónd e moléculase specíficas sistemaó ptico especiapl ara en la célula.L ass ustancias iluminar un único plano dentro de fluorescenteasb sorbenr adiación la muestra.S eo btieneni mágenes ultravioletay emitenl uz visible.L as únicamented e las regiones moléculasfl uorescentepsu eden contenidase n una profundidad de eústir de maneran atural en la foco estrechaL. asr egionesp or muestra,p ero a menudos eg eneran encimay por debajod el plano de uniendo coloranteso anticuerPos l_bUp m visión seleccionadoa parecene n fluorescenteas lasm oléculasd e negroy no desenfocadas. interés. Fuente:tomadod e Campbelly Reec e,B iologfa,s extae dición (SanF ranciscoB: enjamínC ummings'2 002)'p . I l0 Una limitación inherentea la microscopíad e fluores- célulasd urantep eriodosp rolongadosd e tiempo,u sando cenciae sq ue el observadorú nicamenteP uedee ñfocaru n nivelesm uybajosd e iluminación.E stai ntensificaciódne la plano de la muestrae n un momento determinado,a unque imagen es particularmenter ltil para la visualizaciónd e todo el espesodr e Ia muestrae mital uz fluorescenteC. omo moléculasf luorescentees n célulasv ivasc on un microsco- consecuenciala, imagenv isible esb orrosap or la luz emiti- pio de fluorescencia. da desder egionesd e la muestraP or encimay por debajo delp lanod ef oco,loq ueh istóricamentleim itó estat écnica El micloscopieol ectlónico.A pesard e los avancese n las al estudio de célulasa planadasc on un espesorm ínimo. técnicasó pticasy en el incrementoe n el contraste,I a mi- Estep roblemas eh a solucionadoe n gran medidam edian- croscoplaó pticae stál imitada inevitablementep or el lími- tela microscopícao nfocael n la que see mpleau n haz de luz te de resolución,d eterminadop or la longitud de ondad e la láserp arai luminar en un momento determinadou n único luz empleadap aral a visualizaciónd e la muestra.I nclusol a plano de la muestra.E sta aproximaciónc onfiere mucha utilización de radiación ultravioleta, con longitudes de mejor resoluciónq ue la microscopíad e fluorescenciatra- onda más cortas,i ncrementanl a resoluciónú nicamente dicional,c uandos ee mpleae n muestrasg ruesasc omo cé- por un factord e uno o dos. lulasc ompletasA. demáse, l hazd el uz lásers ep ueded irigir El desarrollod el microscopio electrónico, inventado secuencialmentae planosd e foco sucesivosg enerandod e en Alemaniae n 1932y ctryau tilización en estudiosd e bio- esta forma seriesd e imágenesq ue se pueden combinar logía se extendióa principios de la décadad e los años5 0, para obteneru na imagent ridimensionald e la célula. trajo consigou n adelantod ecisivoe n el poder de resolu- Otro avancer ecientee n microscopiaó ptica esla video- ción. En lugar de luz visibley lentesó pticas,e l microscopio microscopíadigitaql,u ee mpleac ámarasd ev ídeoy almace- electrónicoe mpleau n haz de electronesq ue esd esviadoy namientoi nformático,ypermitee l procesamientdoe imá- enfocadop or un campoe lectromagnéticoD. ebido a quel a genesd igitalizadasp arao ptimizar y analizati mágenesE. l longitudd eo ndad el ose lectroneess m uchom ásc ortaq ue acoplamientod e cámarasd e vídeo de alta sensibilidadlu - la de los fotonesd e la luz visible,e l límite de resoluciónd el mínica a los microscopiosh, acep osiblel a observaciónd e microscopioe lectrónicoe s mucho meior que el del mi- Lae mergencdieal at eoríace lulamr oderna croscopioó ptico:a lrededodr e 0,1-0,2n m parae l micros- Lasm uestrasq ues ep reparanp aram icroscopíae lectró- copioe lectrónicoe n comparaciónc on2 00-350n m parae l nica debens ere xtremadamentfein as debidoa l bajo poder microscopioó ptico. de penetraciónd e los electronesE. l instrumento que se Pesea todo, el límite de resoluciónp rácticop aram ues- emplea para este fin se denomina ultramicrótomo.E stá tras biológicasn ormalmenten o esm ejor de 2 nm, debido equipadoc on una cuchillad e diamantey puedec ortar sec- a problemasd e contrastey de preparaciónd e la muestra. cionest an finas como 20 nm. Tambiéns ep uedene studiar Sin embargoe, l microscopioe lectrónicot ienea lrededord e muestrass ustancialmentem ás gruesasm ediantem icros- 100v ecesm ásp oderd e resoluciónq uee l microscopioó p- copíae lectrónicap ero entoncese sn ecesariou n mayorv ol- tico (véaseF igura1 .2).C omo resultado,lac apacidadú til tajep arai ncrementara decuadamenteel poder de penetra- dea umentare st ambiénm ayor:h asta1 00.000ve cesp arae l ción de los electronesE. stos microscopioesl ectrónicods e microscopioe lectrónicoc, omparadoc on 1.000-1.50v0e - alto voltajeusanv oltajesd e aceleraciónd e hastav ariosm i- cesp arae l microscopioó ptico. lesd ek ilovoltios( kV), comparadocso ne l rangod e 50-1 00 Existend os diseñosb ásicosd e microscopioe lectróni- kV comúnmentee mpleadoe n la mayoríad e los instru- co: el microscopio electrónicod e transmisión (TEM) y el mentosc onvencionalesC. on el instrumentod e alto voltaje microscopio electrónico de barrido (SEM). Los dos se sep uedene studiars eccionedse h asta1 p rmd eg rosory esto describend etalladamenteen e l apéndiceL.o sm icroscopios nos permite examinare n mayor profundidad orgánulosy electrónicods e transmisióny de barrido son similaresy, a otrase structurasc elulares. quea mbose mpleanu n hazd ee lectronesp,e rou sanm eca- Actualmentes ee mpleand iversasté cnicase specializadas nismos diferentesp ara la formación de la imagen.C omo de microscopíae lectrónicad e transmisión,p ara las cuales su nombre implica, el TEM forma la imagen a partir de sep reparanl asm uestrasd e forma alternativaE. ntree llass e electronesq ue se transmiten a través de la muestra.E n incluyenl a tinciónn egativae, ls ombreado,lcar iofracturay el cambio,e l SEMe scaneala superficied e la muestray forma grabadop or congelación,lacsu alesp ermitenl a visualización una imagenp or a partir de los electroneds esviadods e la de muestrase n tres dimensionesL. a técnicad enominada superficiee xternad e la muestra.L a microscopíae lectróni- ,estereo-microscoepleíac tróniceas u na técnicaa decuadap ara ca de barrido es una técnícae specialmentee spectacular estep ropósitoy en ellal a muestrae sf otografiadad esded os por la sensaciódne p rofundidadq ued a a lasm uestrasb io- ángulosli geramented iferentesu sandou n soporteq uep ue- lógicas( Figura 1.3).L a mayor parte de las micrograflas de ser inclinado con respectoa l haz de electronesE. stas electrónicasd e estel ibro han sido obtenidasm ediantel a técnicass ed escribene n detallee n el apéndice. utilización del TEM o el SEM y se identifican al final de La microscopíae lectrónicah a revolucionadon uestro cadap ie de figura mediantel a abreviaturad e tresl etras. entendimientod e Ia arquitecturac elularh aciendop osible (a)C éluladse neuroblastomhuam ano ' Sopm (b) Granod e polen - 10lrm-"------t Figura1 .3 Microscopeíale ctrónicdae b anido,Seu tilizó un microscopio electrónico de barrido para visualizar célulasd e neuroblastoma humano( a) y un granod e polen( b). Capítul1o Unav isiónd el ac élula investigacioneus ltraestructuralesd etalladasA. lgunos or- cesp or las vías metabólicasq ue llevan sus nombres.P or gánulos( como los núcleoso las mitocondrias) son sufi- ejemplo,l a vla Embden-Meyerhodfe la glucolisiss upuso cientementeg randesp ara ser observadosc on un micros- un gran triunfo de la investigaciónd e los principios de los copio óptico pero puedens er estudiadosc on mucho más años 30. Poco despuésf ue seguidop or el ciclo de Krebs detalle con un microscopio electrónico'A demás,l a mi- (también conocido como el ciclo de los TCA). Estasd os croscopíae lectrónicah a puestod e manifiestol a existencia vías son importantesp or su implicacióne n el proceso de estructurasc elularesq ue son demasiadop equeñasp ara mediantee l cuall asc élulaso btienene nergíaa partir de sus. sero bservadaas microscop ia óptica.E stasin cluyenr iboso- nutrientes. Aproximadamente al mismo tiempo, Fritz mas,m embranas,m icrotúbulos y microfilamentos( véase Lipmann, un bioquímico americano, describió que el Figura1 A.2e np ágina3 ). compuestod e alta energíaa denosinatr rfosfato( ATP)e s el principal compuestod e almacenamientod e energíae n la mayoríad e lasc élulas. La bioquÍmicae stud¡ala químicad e la estructuta Cuando se empezaron a usar isótopos radioactivos y la funciénb iológica como 3H, lac o 32Pp anam aÍcar el destino de átomosy En el momento en el que los citólogose stabanc omenzan- moléculase specíficasse p rodujo un avanceim portante en do a explorar la estructurac elular con sus microscopios, el estudiod e las reaccionesy las víasb ioqulmicas.( Como otros científicose stabanh aciendoo bservacionesq ue co- podrá recordard e la química,d istintos átomosd e un ele- menzarona explicary a clarificarl a función celular.G ran mento puedent ener el mismo número atómicoy casip ro- parte de lo que ahoras ed enominab ioquímicap roceded e piedadesid énticasp ero diferir en el número de neutrones un descubrimientod escritop or el químico alemánF rie- ¡ por lo tanto,e n el pesoa tómico;w isótopos er efierea los drich Wóhler en 1828.W óhler fue contemporáneo(a sí átomosc on un número específicod e neutronesy con ello como compatriota)d e Schleideny SchwannÉ. l revolucio- un pesoa tómico particular.U n isótopo radioactivo,o ra- nó nuestrop ensamientoa cercad e la biologíay la química dioisótopoe, s un isótopo inestable,q ue emite partículas mediantel a demostraciónd e que la urea, un compuesto subatómicas[p artículasa lfao beta] y en algunosc asosr' a- orgánicod e origen biológico,p odría ser sintetizadae n el yos gamma, mientras se convierte espontáneamentee n laboratorio partiendo de un material inorgánicoc omo el una forma estable.)M elvin Calvin y susc olegasd e la Uni- cianato de amonio. Hasta entonces's e habla mantenido versidadd e California en Berkeleyf ueron pionerose n este que los organismosv ivos constitulan un mundo aislado, campo altrazare l destinod el dióxido de carbonom arcado no gobernadop or lasl eyesd e la químicay de la flsica,q ue con i4C, r4CO2e, n algasi luminadasq ue estabant ealizan- rigen el mundo inerte. Mediantel a demostraciónd e que do la fotosíntesisa ctivamenteS. ut rabajo,d esarrolladoa fi- un compuestoh echop or organismosv ivos -<bioqulmi- nalesd el osa ños4 0y principiosd el os5 0,c ondujoa la elu- co>- podría ser sintetizadoe n un laboratorio igual que cidación del ciclod e Calvin,n ombre que recibel a vía más otros compuestosq ulmicos, Wóhler ayudó a romper la común del metabolismof otosintéticod el carbono.E l ciclo distinciónc onceptuael ntrel os mundosv ivo e inertey a di- de Calvin fue la primera vla metabólicad escubiertam e- siparl a nociónd e quel osp rocesobsi oquímicose staband e diantee l usod e un radioisótoPo. algunaf orma exentosd e las leyesd e la químicay la física. La bioquímicad io otro gran pasoa delantec on el de- Otro gran avancev ino 40 añosm ást arde,c uandoL ouis sarrollo de la centrifugaciónc omo método para separary Pasteuru nió la actividadd e los organismosv ivos a Proce- aislare structurass ubcelulareys macromoléculase n basea sos especlficosm, ostrando que para llevar a cabo la fer- su tamaño, forma, y/o densidad,p roceso denominado mentación del azlcar en alcohole rann ecesarialse vaduras fraccionamiento subcelular. Las técnicasd e centrifuga- vivas.E stao bservaciónf ue seguidae n 1897p or el descu- ción usadasp arae steo bjetivoi ncluyenl a centrifugaciónd i- brimiento de Eduardy Hans Buchnerd e que la fermenta- ferencialy la centrifugacióne n gradiented e densidad,q u.e ción podía tener lugar también a partir extractosd e leva- separano rgánulosy otras estructurass ubcelularees n base duras, es decir, las células intactas no eran necesarias. a diferenciase n tamañoy /o densidad,ylac entrifugacióne n Inicialmente,e stose xtractoss ed enominaron< fermentos>, equilibriod e densidade,s u na técnicap oderosap aras epa- pero gradualmentes ef ue clarificandoq ue los agentesa cti- rar orgánulosy macromoléculase n basea las diferencias vos en los extractose ran catalizadorebsi ológicose specífi- de densidadC. adau na de estasté cnicass ed escribed etalla- cosq ue desdee ntoncess eh an denominadoe nzimas' damentee n el Anexol2Ae n lasp áginas3 22-326L. a ultra- En lasd écadasd e 1920y 1930s ep rodujo un progreso centrífuga,d esarrolladae n Sueciap or TheodorS vedberga significativoe n nuestroe ntendimientod e la función celu- finalesd e los años2 0, ese specialmentúet il para la resolu- lar al elucidar las vías bioquímicasd e la fermentacióny ción de pequeñoso rgánulosy macromoléculasU. na ultra- otrosp rocesosc elularesre lacionadosE.s tep eriodoe stuvo centrífugae s capazd e desarrollarv elocidadesm uy altas dominado por los bioquímicos alemanesc omo Gustav -más de 100.000rp m- y puedep or lo tanto someterla s Embden,O tto Meyerhof,O tto Warburgy HansK rebs.A l- muestrasa fuerzasq ue superan5 00'000v ecesla fuerzad e gunosd e ellos han quedadoi nmortalizadosd esdee nton- la gravedad( g). En gran medida la ultracentrífugae s tan Lae mergencdieal at eoríace lulamr oderna