Effet antiviral des interférons sur le virus BK Élodie Martin To cite this version: Élodie Martin. Effet antiviral des interférons sur le virus BK. Sciences pharmaceutiques. 2016. ￿dumas-01484552￿ HAL Id: dumas-01484552 https://dumas.ccsd.cnrs.fr/dumas-01484552 Submitted on 7 Mar 2017 HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. Université de Picardie Jules Verne U.F.R. DE PHARMACIE MEMOIRE DU DIPLOME D’ETUDES SPECIALISEES D’INNOVATION PHARMACEUTIQUE ET RECHERCHE TENANT LIEU DE THESE POUR LE DIPLOME D’ETAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE Soutenue publiquement le 20 octobre 2016 Par Elodie MARTIN EFFET ANTIVIRAL DES INTERFÉRONS SUR LE VIRUS BK JURY Président : Monsieur le Professeur Gilles DUVERLIE, Virologie, CHU Amiens Membres : Monsieur le Professeur Christophe CARNOY, Immunologie, Faculté de Pharmacie de Lille Madame le Docteur Claire PRESNE, Néphrologie, CHU Amiens Madame le Docteur Anne-Sophie HURTEL-LEMAIRE, Pharmacologie, CHU Amiens Madame le Docteur Catherine FRANÇOIS, Virologie, CHU Amiens Année 2016 Thèse n°3164 Remerciements Aux membres du jury, Monsieur le Professeur Gilles DUVERLIE Professeur des Universités – Praticien Hospitalier Chef du Service de Virologie du CHU d’Amiens Doyen de la Faculté de Pharmacie Directeur de l’Unité de Virologie UVCF EA4294 Je vous remercie de m’avoir accueillie dans votre laboratoire, de m’avoir ouvert les portes de la recherche et de m’accorder votre confiance quant à la réalisation de mes travaux au sein de votre unité de recherche. Soyez assuré de ma sincère reconnaissance et de mon profond respect. Monsieur le Professeur Christophe CARNOY, Professeur des Universités – Faculté de Pharmacie de Lille CIIL – Center for Infection and Immunity of Lille Lung Infection and Innate Immunity (LI3) INSERM U1019 – CNRS UMR 8204 Vous me faites l’honneur d’accepter de juger cette thèse. Veuillez trouver l’expression de ma reconnaissance et de mes sincères remerciements. Madame le Docteur Anne-Sophie HURTEL-LEMAIRE Praticien Hospitalier Responsable du laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie du CHU d’Amiens Vous avez accepté de participer au jury de cette thèse. Je vous remercie de me faire l’honneur de votre présence. Veuillez trouver ici l’expression de mes sincères remerciements. Madame le Docteur Claire PRESNE Praticien Hospitalier Service de Néphrologie du CHU d’Amiens Vous me faites l’honneur de participer au jury de cette thèse. Veuillez trouver ici l’expression de mes sincères remerciements. Madame le Docteur Catherine FRANÇOIS Maître de conférence des Universités – Praticien Hospitalier Laboratoire de virologie du CHU d’Amiens Unité de Virologie UVCF EA4294 Je te remercie énormément pour la confiance que tu m’accordes, ton soutien, tes conseils et ton aide tout au long de mon travail. Je te remercie également de m’avoir permis de valoriser mes travaux à Lisbonne. Ce fut un très bon moment. L’aventure se poursuit avec ma thèse de sciences. À toute l’équipe du laboratoire de virologie, François HELLE, Etienne BROCHOT, Sandrine CASTELAIN et Abderrahmane BENGRINE Je vous remercie pour vos conseils avisés, votre disponibilité et votre sympathie. Véronique DESCAMPS, Virgine MOREL et Carole FOURNIER Je vous remercie chaleureusement pour m’avoir transmis votre expérience. Je vous remercie également pour votre patience dans mon apprentissage des différentes techniques que vous maîtrisez parfaitement. Barbara DUCLERCQ Je te remercie pour ta gentillesse. Catherine MORISET Je te remercie chaleureusement pour la bonne humeur que tu répands dans tout le labo. Catarina OLIVEIRA Je te remercie pour tous ces moments de complicité et de rires. À notre amitié, même à 2000 km de distance ! Lynda HANDALA Je te remercie pour les bons moments passés ensemble et ceux à venir ! Je remercie tous les membres du laboratoire de virologie pour leur accueil chaleureux et leur convivialité. À l’équipe du laboratoire de biochimie, notamment Coco et Christophe, je vous remercie pour vos conseils précieux dans la réalisation des western-blot. À mes ami(e)s, Hacibou, Cat’ le problème, Minouche, Villa, Nao, Josie, Justine, MJ, Marion, la bande de Bourgneuf et leur folie, Yann & Déborah, Catarina le p’tit chef, Lynda … Merci pour tous les bons moments passés à Paris, à Lille, à Amiens, à la Rochelle ou ailleurs ! Vous êtes formidables ! Je vous aime ! À Adelin, qui a transformé ma vie. Un immense merci pour ton optimisme, ta façon de voir la vie, ta sociabilité et toutes tes innombrables qualités que notre entourage remarque. À mes parents, je ne saurais suffisamment vous remercier pour tout ce que vous avez fait pour moi. Merci de m’entourer de votre amour. Merci pour votre soutien au cours de ces longues années d’études. À toute ma famille, je vous remercie de vos encouragements, de votre compréhension et de votre soutien tout au long de mes études. Sommaire I. INTRODUCTION..................................................................................................................6 A. Le virus BK......................................................................................................................................7 1. Découverte et classification........................................................................................................7 2. Epidémiologie.............................................................................................................................7 a) Séroprévalence..............................................................................................................7 b) Distribution mondiale des sous-types............................................................................8 c) Modes de transmission..................................................................................................9 3. Histoire naturelle de l’infection par le virus BK......................................................................10 a) Néphropathie associée au polyomavirus BK...............................................................10 b) Cystite hémorragique..................................................................................................11 c) Sténose uretérale.........................................................................................................11 d) Autres pathologies liées à l’infection par le virus BK.................................................12 e) Oncogénicité...............................................................................................................12 4. Diagnostic.................................................................................................................................12 a) Diagnostic direct.........................................................................................................12 b) Diagnostic indirect......................................................................................................13 5. Traitements...............................................................................................................................13 6. Principales caractéristiques virales...........................................................................................14 a) Structure de la particule virale....................................................................................14 b) Cycle viral...................................................................................................................16 B. L’interféron : acteur majeur du système immunitaire....................................................................19 1. Les interférons (IFN)................................................................................................................19 a) Description et classification........................................................................................19 b) Caractéristiques générales...........................................................................................19 c) Utilisation thérapeutique.............................................................................................20 2. La réponse interféron au sein du système immunitaire............................................................21 3. Les interférons dans la lutte antivirale......................................................................................22 4. Gènes de réponse à l’interféron et activités antivirales............................................................24 5. Place de l’interféron dans la réponse immune à l’infection par le virus BK............................26 II. OBJECTIFS.........................................................................................................................27 III. MATERIELS ET METHODES.........................................................................................29 1. Culture cellulaire......................................................................................................................29 a) Lignées cellulaires.......................................................................................................29 b) Stimulation cellulaire par les IFN...............................................................................29 2. Virus.........................................................................................................................................29 a) Production du virus BK en culture cellulaire..............................................................29 b) Détermination du titre infectieux viral (TCID /ml)...................................................34 50 c) Infections cellulaires avec le virus BK produit...........................................................34 3. Analyse en PCR quantitative en temps réel (qPCR)................................................................34 a) Détection et quantification des ARNm viraux par qPCR............................................34 4. Western-blotting.......................................................................................................................36 a) Anticorps utilisés.........................................................................................................36 b) Etapes..........................................................................................................................36 5. Analyse transcriptionnelle par qPCR.......................................................................................36 6. Test de l’indoleamine 2,3-dioxygènase....................................................................................37 1 a) Blocage de l’activité enzymatique de IDO..................................................................37 b) Mesure de la viabilité cellulaire..................................................................................37 7. Test de la pyridone...................................................................................................................37 8. Analyses statistiques.................................................................................................................37 IV. RESULTATS.....................................................................................................................38 1. Effet antiviral des IFN sur le virus BK.....................................................................................38 a) Effet antiviral des IFN sur l’expression des ARNm viraux précoces (Ag-T) et tardifs (VP1) 38 b) Effet antiviral des IFN sur l’expression de la protéine virale VP1..............................39 2. Implication de la voie de signalisation cellulaire Jak-STAT....................................................42 a) Détection de la protéine P-STAT1..............................................................................42 b) Détection de la protéine STAT-1................................................................................43 c) Inhibition de la voie Jak-STAT...................................................................................44 3. Etude transcriptionnelle des ISG induits..................................................................................46 4. Etude d’un candidat : IDO........................................................................................................49 a) Expression de VP1 en présence de L-Trp...................................................................50 b) Inhibition pharmacologique de l’activité enzymatique d’IDO....................................51 V. DISCUSSION.....................................................................................................................53 VI. CONCLUSION ET PERSPECTIVES...............................................................................58 VII. BIBLIOGRAPHIE............................................................................................................60 VIII. ANNEXES......................................................................................................................68 2 Index des figures et des tableaux Figure 1 : Séroprévalence du virus BK en fonction de l’âge [10]..............................................8 Figure 2 : Distribution des sous-types du virus BK dans le monde [15]...................................9 Figure 3 : Evolution de l’infection à virus BK après transplantation rénale [29]....................11 Figure 4 : Structure de la particule virale de la famille des Polyomaviridae...........................14 Figure 5 : Génome du virus BK [50]........................................................................................15 Figure 6 : Le cycle de multiplication du virus BK [9].............................................................17 Figure 7 : Voie de signalisation Jak-STAT des interférons de type I, II et III[79]..................23 Figure 8 : Cibles de quelques protéines antivirales induites par les IFN au cours du cycle viral. ..................................................................................................................................................25 Figure 9 : Production du virus BK en culture cellulaire..........................................................31 Figure 10 : Particules de virus BK dans les cellules Véro 3 mois après la transfection..........32 Figure 11 : Détection de l’Ag-T dans les cellules Véro au microscope à fluorescence...........33 Figure 12 : Détection de VP1 dans les noyaux des cellules Véro au microscope à fluorescence..............................................................................................................................34 Figure 13 : Expression relative des ARNm viraux précoces (Ag-T) et tardifs (VP1) en présence des différents types d’IFN dans les cellules Véro infectées......................................39 Figure 14 : Expression de la protéine virale VP1 en présence d’IFN......................................41 Figure 15 : Expression de la protéine P-STAT1 (Y 701) en présence d’IFN..........................43 Figure 16 : Expression de la protéine STAT1 en présence d’IFN...........................................44 Figure 17 : Expression de la protéine VP1 en présence d’IFN-gamma +/- pyridone..............45 Figure 18 : Expression relative des ARNm de différents ISG en présence des différents types d’IFN dans les cellules 293FT.................................................................................................47 Figure 19 : Expression relative des ARNm des 5 ISG fortement induit par l’IFN-gamma, un peu par l’IFN-alpha, et pas par l’IFN-lambda. (Extrait de la Figure 18).................................48 Figure 20 : Schématisation des activités antimicrobienne et immunomodulatrice de IDO. (d’après Greco et al.[110]).......................................................................................................49 Figure 21 : Expression de la protéine VP1 en présence d’IFN-gamma +/- L-Trp...................50 Figure 22 : Expression de la protéine VP1 en présence d’IFN-gamma +/- 1-DL-MT............51 Tableau 1 : Exemples de quelques PRR et PAMP viraux associés [75]..................................21 Tableau 2 : Exemple de quelques protéines antivirales dont l’expression est induite par les interférons.................................................................................................................................24 Tableau 3 : Séquences des amorces utilisées en PCR..............................................................35 3 Abréviations Ag-T : Antigène grand T Ag-t : Antigène petit t BKV : BK virus cDNA : ADN complémentaire CSK : 10 Mm PIPES pH 6,8 ; 100 mM NaCl; 300 mM sucrose; 3 mM de MgCl ; 1mM 2 d’EDTA DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DOC : acide désoxycholique EDTA : Ethylène diamine tétra acétique acide EiF2α : Eukaryotic initiation factor 2 alpha FITC : isothiocyanate de fluoréscéine GAS : interferon Gamma Activated Sequence = Séquence d’activation de l’interféron gamma HRPTEC : cellules épithéliales tubulaires proximales rénales humaines IDO : indoleamine 2,3 dioxygénase IFN : Interféron IFNAR / IFNLR / IFNGR: Interferon Alpha/Lambda/Gamma Receptor IFITM : Interferon Induced Transmembrane Il : Interleukine IRF : Interferon Regulatory Factor = facteur de régulation de l’interféron ISG : Interferon Stimulated Genes = gene de réponse à l’interféron ISRE : Interferon-Stimulated Response Element Jak-STAT : Janus kinase-Signal Transducers and Activators of Transcription LyT : lymphocyte T LyTh17 : lymphocyte T helper = auxiliaire, caractérisé par la production d’interleukine-17 LyT : lymphocyte T régulateur rég OAS : Oligoadenylate Synthetase MOI : Multiplicity Of Infection = multiplicité d’infection p53 : protéine 53 pRb : protéine du Rétinoblastome PAMP : Pathogen Associated Molecular Patterns PBS : Phosphate buffered saline : tampon phosphate salin PCR : Polymerase Chain Reaction = Réaction de polymérisation en chaîne PFA : paraformaldéhyde PKR : Protéine Kinase R 4 PRR : Pathogen Recognition Receptor P-STAT1 : forme phosphorylée de la protéine STAT1 RE : réticulum endoplasmique RIPA : Radio ImmunoPrecipitation Assay SDS-Page : Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis STAT 1/2 : Signal Transducer and Activator of Transcription 1/2 SVF : Sérum de Veau Fœtal TCID : Tissue culture infectious dose 50 = dose infectant 50% des cultures en cellules 50 TLDA : TaqMan Low Density Array TLR : Toll-Like Receptor Trp : Tryptophane VP1/2/3 : Viral Protein 1/2/3 = protéine virales 1/2/3 5 I. INTRODUCTION Le virus BK est un pathogène ubiquiste. Il établit une infection persistante asymptomatique dans les voies rénales de 80% de la population humaine. Son pouvoir pathogène se manifeste essentiellement chez les transplantés rénaux, pour lesquels l’immunosuppression induite par les traitements immunosuppresseurs favorise la réplication virale. Il est responsable de néphropathies chez environ 10% des transplantés rénaux [1]. Il s’agit d’une complication sévère car évoluant vers une dégradation progressive de la fonction du greffon jusqu’à sa perte chez 30 à 80% des patients présentant une infection active [2-4]. Du fait de l’absence de traitements antiviraux spécifiques, la prise en charge repose sur la réduction des traitements immunosuppresseurs mais le risque de survenue de rejet immunologique du greffon est alors augmenté. Devant cette problématique et dans le contexte d’un nombre croissant de transplantations rénales, les recherches menées sur le virus BK se sont multipliées ces dernières années. L’augmentation des pathologies associées au virus BK en même temps que l’utilisation de traitements immunosuppresseurs de plus en plus puissants souligne un lien étroit entre la réponse immunitaire de l’hôte et la réactivation virale. Cependant la réponse immune à l’infection par le virus BK est peu documentée. Les interférons (IFN), connus pour leurs propriétés antivirales sont des acteurs majeurs du système immunitaire. Ils interviennent en première ligne de défense en réponse à une infection virale et ils sont essentiels à la mise en place de la réponse immune adaptative. Dans ce travail, nous étudions l’effet antiviral des IFN sur l’infection par le virus BK en culture cellulaire. Dans une première partie je détaillerai les caractéristiques du virus BK et les pathologies associées puis dans une deuxième partie je présenterai les différents types d’IFN et leur action antivirale en terminant par leur place dans la réponse immune à l’infection par le virus BK. 6