Dynamics of Glucose-Lactose Diauxic Growth in E. coli ∗ Zhao Lu and Michael A Lee Department of Physics, Kent State University, Kent, OH 44240, USA Wepresentamathematical modelof glucose-lactose diauxic growthin Escherichia coli including both the positive and negative regulation mechanisms of the lactose operon as well as the inducer exclusion. Tovalidatethismodel,wefirstcalculatedthetimeevolutionofβgalactosidaseforonlythe lactose nutrientand compared thenumericalresultswith experimentaldata. Second,wecompared the calculated cell biomass of the glucose-lactose diauxic growth with the experimental optical density of the diauxic growth for a particular E. coli MG 1655. For both cases, the numerical calculations from this model are in good agreement with these two experiments’data. Thediauxic 7 growth pattern of a wild typeE. coli was also investigated. 0 0 2 I. INTRODUCTION explained by the lactose operon genetic regulatory net- g work and the inducer exclusion. u The complexity of how cells respond to their chang- Quantitative mathematical models of the lactose A ingenvironmentsrequirestheunderstandingofgenereg- operon and diauxic growth have been investigated by 5 ulation and protein expression. An interesting diauxic many authors (Jong [8], Yagil and Yagil [32], Wong et 1 growth pattern of Escherichia coli (E. coli) on glucose al. [31], Kremling and Gilles [11], Kremling et al. [12], and lactose nutrients has been extensively studied and MahaffyandSavev[18],YildirimandMackey[33],Satil- ] wellcharacterizedforalongtime(e.g.,JacobandMonod lan and Mackey [28], Bailey [2], Lee and Bailey [15], Lee T [19], Jacob and Monod [20], Beckwith [1], Nester et al. and Bailey [16], Laffend and Shuler [13], Ozbudak et al. O [23]). Fig. 1 illustrates a biphasic growth pattern of [26]). A recent genetically structured model for the di- o. E. coli in a glucose-rich and lactose-rich medium. Since auxic growth of E. coli on glucose and lactose was de- i extraenergyisrequiredtomakeadditionalenzymes(lac- veloped by Wong et al. [31]. In their work, all known b tose permease and βgalactosidase) for the lactose trans- information including the lactose operon transcription - q portation and metabolization, the utilization of glucose and translation processes, the flux models of unidirec- [ wasalwayspreferred. Thediauxicgrowthpatterncanbe tional glucose transport and bidirectional lactose trans- port,theinducerexclusion,thecataboliterepression,and 1 therepressorDNAlooprepression,wasdescribedbyaset v 3 of nonlinear ordinary differential equations (ODEs). By 9 solving the system ODEs with appropriate experimen- 9 tal parameters, they produced a typical diauxic growth 1 ls curve. However, no comparison was made with exper- 8. Cel II imental data. Kremling and Gilles [11] and Kremling 0 et al. [12] developed another structured mathematical f 7 o model of glucose-lactose diauxic growth and it was vali- 0 r e III dated by their own experiments. : b v m Many other studies of lactose operon modeling were Xi u on the stability analysis of steady states and dynamic N evolutions of E. coli on the lactose nutrient only. Ma- r I a haffy and Savev [18] and Yildirim and Mackey [33] de- veloped their mathematical models including the time delay of translation processes explicitly. Similar to Yagil andYagil[32],asimpleHill’sfunctionwasappliedasthe Time regulation function of the lactose operon. Mahaffy and Savev[18]reportedthattherewasahysteresisofsolution FIG. 1: Diauxic Growth of E. coli on glucose and lactose. I: within a certain range of the parameter space. Yildirim glucosegrowthphase;II:lagphase;III:lactosegrowthphase. andMackey[33]showedabistablesteadystateofthelac- E. coli preferentially takes glucose and when the glucose nu- toseoperon. However,acommonproblemintheirmodel trient is depleted, a short lag phase appears before the cell was the assumption of a constant growth rate. This as- growth resuming on the lactose utilization. Note that the sumption is only valid in the exponential growthperiod, logarithmic scale used in the numberof cells. and may not be true through the period from the initial growth of E. coli to the exponential balanced growth. In this paper, we extended the mathematical model proposed by Wong et al. [31] on one hand by includ- ∗Correspondingauthor;Electronicaddress: [email protected] ing more realistic complexities (for example, the time 2 dtheelayothoefrtrhaannsdla,twioensipmropcliefisesedstohfeiprrmotoedinels(yfnotrheexsiasm);polen, R(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)NA(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)Pσ cAMCPRP R(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)NA(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)Pσ bliynguseitngala.n[1i2n]t)u.itAivseidsekfinnoitwionn, ovfaltihdeatgiroonwathndraptere(dKicrteimon- 5(cid:0)(cid:1)’(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:1)P(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:1)ro(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:1)mo(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:1)te(cid:0)(cid:1)r(cid:0)(cid:1)La(cid:0)(cid:1)cI(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:1)C(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)R(cid:0)(cid:1)P(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:1) S(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)i(cid:0)(cid:1)te(cid:0)(cid:1)P(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)r(cid:0)(cid:1)o(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)m(cid:0)(cid:1)o(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)t(cid:0)(cid:1)e(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)r(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)O(cid:0)(cid:1)p(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)e(cid:0)(cid:1)r(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)a(cid:0)(cid:1)t(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)or(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)L(cid:0)(cid:1)ac(cid:0)(cid:1)Z(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)L(cid:0)(cid:1)ac(cid:0)(cid:1)Y(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)L(cid:0)(cid:1)ac(cid:0)(cid:1)A(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1) 3’ are two essential features for any useful mathematical mRNA Transcription mRNA Transcription (cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1) (cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1)(cid:0)(cid:1) model for real biological systems. Therefore, the focus omfatthicisalpmreosdeneltbwyortkwoisptaortviaculildaarteextpheisrimexetnetnsd’eddatma,atahned- RTerparnesslsaotrion Allolactose βg(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)ala(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)Tctro(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)asnidslaasteion Pe(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)Trmra(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)enassleation t(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)raTnr(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)saancs(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)eltayt(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)liaosne predict the diauxic growthpattern of a wild type E. coli FIG. 2: The lactose operon (Nester et al. [23], Beckwith [1], on glucose and lactose in general. Echols [5]) is a segment of DNA molecule in an E. coli cell with its length ∼5000 base pairs (bps). It consists of three genesandthreedifferentregulationsites. Thethreegenesare lacZ, lacY and lacA and their products are βgalactosidase, To construct the mathematical model, we made four lactose permease, and transacetylase respectively. The en- zyme βgalactosidase breaks lactose and allolactose into glu- changestothemodelofWongetal.[31]. First,amodified coseandgalactose,andtransformslactosetoallolactose. Lac- bidirectional flux model based on a simple microscopic tose permease is in charge of transporting lactose intoor out description of the symmetric lactose transport was de- of the cell. The function of transacetylase is not clear in the rived. This change connects the difference of the influx lactoseoperonregulatorynetwork,andthusisnotconsidered and efflux of the lactose transport. Second, the time de- inthisstudy. Threedifferentregulation sitesarecyclicAMP lay of translationprocesseswas consideredexplicitly. As (cAMP) receptor protein (CRP) binding site, promoter, and pointed out by Yildirim and Mackey [33], it was impor- operator. Thesethreebindingsitesprovidephysicallocations tant but failed to appear in Wong’s model. In addition, for three transcription factors: CRP, RNA polymerase, and therateoftranslationwasmodeledbyanempiricalfunc- repressorprotein. Upstreamofthelactoseoperon,arepressor tion of the E. coli growth rate (Bremer and Dennis [3]). gene lacI constitutively expresses therepressor protein. ThethirdchangeconcernedthegrowthrateofE.coli. In our treatment, we used the growthrate that depends on the glucose and lactose uptake rate. This intuitive defi- TABLEI:Effectors,transcriptionfactorsandbindingsitesin nitionlet us eliminate the stiffness ofthe modelofWong thelactose operon system et al. [31]. The last change was on the inducer exclu- sion. A Hill’s function with a higher steepness to model Effector Transcription factor Regulation site the inhibition of lactose permease was employed since it σ RNApolymerase promoter wasreportedby Kimataetal.[9]thatthe inducer exclu- cAMP CRP CRP bindingsite sionmayplay a majorroleinthe glucose-lactosediauxic allolactose repressor operator growth pattern. II. THE MODEL The studies presented here had three parts. In the A. Biological model first part, we defined three levels of βgalactosidase: basal level, partly induced level, and fully induced level. For the lactose nutrient only, we calculated the time Thestructureofthe lactoseoperonsystemisshownin evolution of βgalactosidase and compared it to Knorre Fig. 2. The transcription of the lactose operon is reg- [10] experimental data. In the second part, we studied ulated by the interaction of three transcription factors the diauxic growth of a particular E. coli MG 1655. with their corresponding effectors at their binding sites The cell biomass of E. coli MG 1655 was calculated by in DNA listed in Table I. The σ effector, if associated inputting the same concentrationsof glucose andlactose withtheRNApolymerase,canhelptheRNApolymerase as those in experimental studies by Chang et al. [4] to findits promotersite andprepareto initiate the tran- (http://www.ou.edu/microarray/oumcf/growthtrans.htm). scription. To fit the experimental data, we converted the cell The lactose operon genetic regulatory network has biomass to the corresponding experimental optical den- both positive and negative feedback loops. The catabo- sity (OD), and provided an analysis of the discrepancy lite repressionispositively regulatedby the extracellular between the numerical results and the observed OD glucose. The high level of the extracellular glucose re- in the lactose growth period. The numerical results sults in a low level of cyclic adenosine monophosphate of the mathematical model for both cases are in good (cAMP), so cAMP receptor protein (CRP) is not acti- agreement with these two experiments’ data. In the vated. If the extracellular glucose density is very low, third part, by adjusting the rate of glucose transport, then a high level of cAMP will result in an activation the diauxic growth pattern of a wild type E. coli was of CRP. cAMP as a modulator binds CRP to positively studied. control its DNA binding activation. The complex of 3 (cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)EGLL(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)Iaal(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)IuRccBttc(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)eooLoCpsscsa(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)eerAec eP (cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)MsIse(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)orPrm (cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)+RLe (cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)NCaasAcR(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)e OPP(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1) p+β(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)e gσr(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)oanl(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)ac(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)tCoGe(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)slilld(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1) uGa6(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)srPeo(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)w+(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)tAh(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)llo(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)lGa(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)cltu(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)ocso(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)ese(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)+(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)Ga(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)la(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)ct(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)oEs(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)IeI(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)A~(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)P(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1) tbpdhoieedttatnohiinqfnliaieetaaaseutTfisdsneotetuuahhe,fisorxxbMantraeeeniiioraetcuoccleermaitnedarnpngshngxmesychlererttsaenoamoohbepottlwarwwncloeleeeoum/eadtcntOdllWghsctuhealieoDBiocDidrvlniolsgnlwanv.eECenqrvrmFledioougesyEetWifw..haarMgt.eblttnhti.TtteyhHcsahthea(dot1hiegaetetelWmneodlDhiridct.e.eengyhoeauosCg,[lnmait3nnulntaMirwaWi1igcchgaantm]aeoAeistcdb:lessiitbppocecttleltemyau-agspfrrhlaecrdileatogezousatlnhycm.edroefms.etdeosnesio[xonwite3lttTixsthdngDh1etrwtheute]heaArhrtetlhdcybaheggi.reiilccyellcaailCuuTzfoehlutoualccmceuehlxulooteulasaeiiplrlsssiclorrleenhaleWnuec--rgodqghllt.naawdueeerqaiacconiiatusngffrTttwssnaagoohseiuhtttnetessotriphyeeee)ts---f FIG. 3: The metabolic pathway of glucose-lactose diauxic ρcell = 300 gDCW/L when necessary. The unit of growth in E. coli biomass is gDCW. . 1. Flux model of lactose transport cAMP∼CRP at its binding site facilitates RNA poly- merasebindingatthepromotersiteandhelpsRNApoly- The flux of the lactose transport entering the cell is merase in the transcription of the lactose mRNA. given by, The negative regulation feedback loop is controlled by the interaction between the complex of repressor- dρo (t) ρo (t)−ρ ρi lac =−kt (ρ ρ (t)) lac cell lac , operator and allolactose. If the intracellular allolactose dt lac cell perm ρo (t)+ρ ρi (t)+ρ∗ lac cell lac lac (the nature inducer) is not available, the repressor pro- (1) tein is bound at the operator site tightly, and thus the whereρo ,ρi ,andρ denotethedensitiesoftheex- lac lac perm transcription of RNA polymerase is blocked. If the level tracellularlactose,theintracellularlactose,andtheintra- ofthe intracellularallolactoseishigh,the allolactosewill cellular lactosepermease respectively. The rate constant bindwith the repressorandfree the operatorsothatthe of the lactose transport is kt and the saturation con- lac transcription of the lactose operon can be initiated. It stant of lactose transport is ρ∗ . The flux of the lactose lac was reported by Oehler et al. [25] that the binding affin- transportisproportionaltothethedensityoflactoseper- ity of the complex of repressorprotein andallolactose at mease regulated by the lactose operon. The derivation the operator site was lowered by about a few thousand of Eq. 1 based on the microscopic description is givenin fold. If the transcription of the lactose operon is dere- Appendix B. pressed, then βgalactosidase and lactose permease will Eq. 1 is different from the flux model of the lactose be expressed. transportgivenbyWongetal.[31]. First,thisfluxmodel The glucose-lactose diauxic growth can be explained is proportional to the difference of the extracellular and by the positive and negative regulation feedback loops intracellular lactose densities. Second, there is only one and the inducer exclusion. The mechanism of the lac- saturation constant for both influx and efflux of the lac- tose transporter protein (lactose permease) inhibited by tose transport. In our numerical results shown later, the the interaction between lactose permease and the un- intracellularlactosedensityisverysmallcomparedtothe phosphorylated enzyme type II A subunit (EIIA), a extracellularlactose density. This could explain why the component of phosphoenolpyruvate:sugarphosphotrans- saturationconstantofthe effluxisveryhighintheefflux ferase system (PTS) (Postma et al. [27]), is called the model of the lactose transport by Wong et al. [31]. inducer exclusion, or glucose effects. Fig. 3 illustrates the metabolic pathway of E. coli in a glucose and lac- tose medium. When the extracellular glucose is negligi- 2. Time delay of translation ble,the inducerexclusionandthe positiveregulationare minimized. Because it takes time to induce the lactose operon to make the necessary enzymes βgalactosidase Proteins such as βgalactosidase and lactose permease and lactose permease to transport and metabolize lac- aresynthesizedinthetranslationprocess. Therateequa- 4 tions of them are, modified, dρβdgatl(t) = 41ktsρmRNA(t−τβ)−(µ+dp)ρβgal(t()2) dρoldatc(t) =−kltac(ρcellρperm(t))ρolaρcol(atc)(+t)Rρcieexllρ−ilaρc(cte)llρ+ilaρc∗lac. dρ (t) (4) perm = k ρ (t−τ )−(µ+d )ρ (t),(3) ts mRNA p p perm dt where ρ denotes the density of mRNA molecules. 4. Growth Rate mRNA τ and τ are the time delay constants of βgalactosidase β p and lactose permease respectively. These two constants The doubling time may be defined as the time needed are the results due to the finite speed of producing for a cell absorbing the number of glucose molecules polypeptidesattheribosomesites. Thefactor 1 inEq. 2 (Ncell) to make a cell. To find this number Ncell, the 4 glu glu accounts for a βgalactosidasemolecule consisting of four yieldcoefficientofglucose(Y )andanaverageE. coli x/glu monomers. The number of proteins produced per unit cell biomass were used. The doubling time is thus given time, i.e., the rate of translation constant, is kts. This as a function of the flux of glucose or lactose transport, rate is dependent on the growth rate ([3, 16]). Here, the relationship between kts and the growth rate µ(t) was T =Ncell/dNglu, assumed to be, d glu dt k = ktesff(µµ0)m1 +ktbsasal µ≤µ0, acenldlultahrelagcrtoowstehanradtealliosladcetfionseedisahsyµdr=olylzTned2d.inTtohegliunctorase- ts (ktesff +ktbsasal µ>µ0. and galactose, and galactose is then converted into glu- cose. We simply used one lactose molecule contributing where µ0 is the growthrate correspondingto a one-hour two glucose molecules. The growth rate is thus given, doubling time. Ifthere is nolactoseinthe nutrientpool, thenthelactoseoperonismaintainedatitsbasallevelby µ(t) = ln2 (kt ρoglu(t) the stochastic and rare transcription. Thus, the rate of N′cell gluρo (t)+ρ∗ glu glu glu translationk wasassumedtobekbasal. Iflactosenutri- ts ts R ρo (t)−ρi (t) ent is available, then the rate of translation is increased +2kt ρ (t) iex lac lac ). (5) until µ > µ0. The higher the steepness parameter m is, lac βgal ρolac(t)+ρilac(t)+ρ∗lac the faster the rate of translation k returns to its nor- ts Therateoftheglucosetransportandthesaturationcon- mal level from kbasal. The protein degradation time of ts stant of the glucose transport are denoted as kt and βgalactosidase and lactose permease is d . glu p ρ∗ respectively. Note that the unit of N′cell is now glu glu mol/gDCW. The expression of the growth rate shows thatµ(t)dependsontheextracellularglucoseandlactose 3. Inducer Exclusion densities as well as the inducer exclusion. This intuitive definitionofthegrowthrate(Kremlingetal.[12])avoids When a glucose molecule is transported into a cell, it the stiffness resultingfromthe assumptionofthe growth is phosphorylated into a glucose-6-phosphate by a phos- rate depending on the level of glucose-6-phosphate and phorylated EIIA. The unphosphorylated EIIA inhibits theextraburdenofthelactoseoperon(Wongetal.[31]). thelactosepermeaseandthuspreventsthelactosetrans- port. This inhibition is currently known only for the ex- tracellular lactose. Therefore, in the expression of the III. RESULTS flux model of the lactose transport, an inhibition factor is attached to the influx of the extracellular lactose den- TosolvethedynamicsofE. coligrowthonglucoseand sity. We used a similar Hill’s function (Wong et al. [31]) lactosenutrients,the rateequationsinAppendix Awere but with a higher steepness for modeling the inducer ex- integrated by the fourth-order Runge-Kutta algorithm. clusion process in this study. It was reported by Kimata All the parameters used in the rate equations are listed et al. [9] that glucose effects may play an important role in Table II. in the diauxic growthpattern. To incorporatethis infor- We first assumed the volume of the glucose or lactose mation, the inducer expression is modeled by, nutrient pool to be infinite but their densities were kept as constants all the time during the cell growth. This K2 R = iex . corresponds to the average cell growth studies without iex K2 +ρo (t)2 consideringthechangeoftheextracellularglucoseorlac- iex glu tose densities. Second, we took the volume of glucose or where the inhibition constant is K and the extracel- lactose pool as 1 l, but the extracellular glucose and lac- iex lular glucose density is ρo . The total flux of lactose tosedensitieswerevariedwithtime. Thedynamicsofthe glu coming into the cell with the inducer exclusion is now glucose-lactosediauxicgrowthweretheninvestigated. In 5 ssρρ(t)/ ββ gal gal 001...680 cb3ttkttreihe1tbloasmelae5lncs0IaebcIlOllaeoβ,luvsrwDgρarelaaamβeElllsgrsaalospaex.cafllvoatdteniochsjTldstu.eioh2ssdNst.leae1ateesocdb×xedtato2eam,ssnna1×easodl0ilot−fe1lyeepec80wsveu−tbrmeli9eonmelsnouoMazlmp/ftweeegre.atdroDrhs,icFecsCleaaueilrrWslnclsashdetit,xft,ethspw1hwoaeoahlnermfvtiiecmootlhtderrlheteanieectnsthtqushiseuallneaebawdtslopuieeyoutxercsnoert--- done within a range of the extracellular lactose densities from 1×10−3 M to 4×10−2 M. The calculated results 0.4 of βgalactosidase were normalized by their steady state values respectively. In Fig. 4, the numerical curves of 0.2 βgalactosidase for four different levels of the extracellu- larlactosewereplottedandcomparedtoKnorre’sexper- 0 imental data ([10]). At the very beginning (less than 25 0 50 100 150 200 Time (min) minutes) of the cell growth on lactose only, the sigmoid shape of these calculated curves can be seen in Fig. 4. FIG. 4: Calculated curves (solid line) from the ex- This is in contrast to the hyperbolic shape given in the tended mathematical model, from top to bottom, ρo = lac previous study by Satillan and Mackey [28]. The rea- 40,4,2,1mM, were compared to Knorre’s experimental data sonfor this changeis mainly due to the change we made (open circle). on the growth rate µ, i.e., µ(t) is the time-dependent growth rate while it was assumed to be a constant in the previous study (Satillan and Mackey [28]). Other both numerical calculations, the repressor density was changes such as the time delay of the protein transla- assumed to be a constant, which is roughly 15 repressor tionandthe time-dependenttranslationrate(depending proteins per cell. Finally, we studied the diauxic growth on the growth rate µ(t)) also played some roles. The pattern of a wild type E. coli by adjusting the rate con- sigmoidshape of βgalactosidasecouldpartly explain the stant of the glucose transport. lagphaseoftheglucose-lactosediauxicgrowthbeforethe cell growth switched on lactose. If both glucose and lactose are present in an infinite A. Lactose growth pool, then the extracellular lactose and glucose densities are to be assumed to be fixed all the time during E. coli Theinductionstatusofthelactoseoperoninthisstudy growth. In this situation with the initial cell biomass or is described by the basal level, partly induced level, and cell number assumed to be very small, bistability of the fully or completely induced level. The fully induced sta- lactose operon can be studied. A numerical study of the tusisdefinedasthemaximallevelofβgalactosidasewhen lactoseoperonbistabilitywithfullconsiderationofinter- the lactoseoperonworksatits maximaltranscriptionef- actions of regulation sites on DNA with their effectors ficiency. It was reported that the repression level of the and transcription factors has been given by Satillan and lactose operon increased 2400 - 3000 fold for 10 - 15 re- Mackey [28]. In their study, the level of βgalactosidase pressor proteins per cell ([30]). Therefore, we defined was taken as the order parameter to indicate the lac- the basal level of ρbasal as about one 2700th of ρmax. tose operon transition from the uninduced state to the βgal βgal The maximal value of βgalactosidase was obtained by induced state. When the extracellular lactose density letting the extracellular lactose density be very high. A increased up to a threshold value, the level of ρβgal in- partly induced lactose operon was defined as being be- creaseddiscontinuouslyfromzerotoafinitevalue. When tween the observable induction level and the maximal the process was reversed, the level of βgalactosidase de- induction level of βgalactosidase. Similar to Ozbudak creased continuously through that threshold value. et al. [26], this observable induction level was defined as In this study, we did the numerical calculations on one 100th of ρmax. If the induction level of the lactose both increasinganddecreasingextracellularlactoseden- βgal operon falls between the basal level and the observable sity. However, we did not find discontinuation of ρ . βgal level, the lactose operon is not induced. If the induction A possible reason of failing to see the bistability is due levelis abovethe observablelevelbutless thanthe max- to the growth rate µ. The growth rate in our study is imal levels, then the lactose operon is partly induced. time dependent and less than the constant growth rate In the numerical calculations, the maximal level of used in Satillan and Mackey [28]. Moreover, the tran- βgalactosidase, lactose permease, intracellular lactose scription efficiency of the lactose operon in their calcu- and allolactose were obtained by letting ρo = 4 × lation was carried out by the partition function which lac 10−2 M or above, because the maximal transcription was different from our approach. For lactose only in a efficiency was saturated at the very high extracellular nutrient pool, we found the threshold value to turn on lactose density. By using the parameters listed in Ta- thelactoseoperonattheobservableinductionleveltobe 6 101 crease from 0.1 to 0.6, and is linearly related to the cell OD Exp. biomass. If OD is higher than 0.6, the true OD should ODEs be higher than that observed in the experimental mea- surement, and the linear relationship is no longer valid. The real OD can be corrected by a standard curve in a specific experiment. Since the rate of glucose uptake 100 depends on the extracellular glucose density, the num- ber of EIIBC, and the dwelling time associated with the phosphorylation process, different species of E. coli may havedifferentnumbersofEIIBCanddwellingtime. This results in the different growth rate and doubling time. 10−1 The typical doubling time in glucose exponential growth of E. coli MG 1655 is about 60 minutes (http://www.genome.wisc.edu/resources/strains.htm). To fit the experimental data given by Chang et al. [4], therateconstantofglucosetransport,kt ,wastakenas glu 2.1×10−4 mol glu/gDCW/minwhile a typicalrangeof 10−20 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 thisrateconstantis1.0-3.2×10−4molglu/gDCW/min. Time (min) The rate constant of glucose transport determines the doubling time of the cell growth on glucose (see Eq. FIG. 5: Comparison of the calculated optical density (solid A1). line)withtheexperimentalopticaldensityofE.coli MG1655 The calculated OD in Fig. 5 is in good agreement (open circles). withtheexperimentalODduringtheglucosegrowthand the lag phase, but it is higher during the lactose growth. This discrepancy can be explained by the OD measure- ∼ 3.6 µM. If the extracellular lactose density is lower ment mentioned before. Since the OD during the lac- thanthisvalue,thenthelactoseoperonisnotinduced;if tose growth is greater than 0.6, the real OD should be thelactosedensityishigherthanthisvalue,thenthelac- higher than the experimental measured OD (Lawrence tose operon is partly induced. The fully induced lactose and Maier [14]), and a standard calibration can be ap- operon can only be reached by a high level of the extra- plied to correct the measurement due to the insensitiv- cellular lactose density. Ozbudak et al. [26] studied the ity of the light scattering. This statement actually con- bistability of the lactose operon when both glucose and firmsthatthehighercalculatedcurveofODisconsistent thio-methylgalactoside (TMG) were used as substrates. with the analysis of the real OD measurement. Because The threshold value to turn on the lactose operon was the initial cell mass given in this study is very small, estimated as 3 µM with only TMG. 10−3 gDCW, we have shifted the time and used a pro- portionalconstantbetweenthecellbiomassandtheOD. The proportional constant between the OD and the cell B. Glucose-lactose diauxic growth biomassis2.62,i.e,OD =2.62X. InFig. 5thelagphase was estimated to be 32 - 38 minutes. If the glucose and lactose nutrient pool is finite, then the extracellular glucose and lactose densities will be changedduring the growthperiodof E. coli. There have C. Diauxic growth pattern of a wild type E. coli beenmanyexperimentalworksontheglucose-lactosedi- auxic growth pattern, and most experimental data have The doubling time of the typical wild type E. coli is been given in terms of OD rather than the cell biomass usually within 20 to 40 minutes, which is lower than the (e.g., [9], [4]). [4] studied the glucose-lactose diauxic doublingtime ofE. coliMG1655. Toreflectthischarac- growth; the experimental OD was measured at 600 nm teristic, we increased the rate constant of glucose trans- for the E. coli MG 1655. The MG 1655 was cultured port(kt =3.2×10−4 mol glu/gDCW/min)for a wild glu in 1 liter with a medium containing 0.5 g/l glucose and type E. coli. 1.5 g/l lactose. To monitor the cell growth, the OD at In the numerical calculations, four levels of the initial 600 nm was measured. extracellular glucose and lactose were set as: ρo (t = glu In numerical calculations, the glucose and lactose ex- 0) = ρo (t = 0) = 1, 2, 3, 4 mM. The initial levels lac tracellular densities (0.5 g/l and 1.5 g/l) correspond to ofmRNA, βgalactosidase,andlactosepermeasewereset ρo (t = 0) = 2.78 mM and ρo (t = 0) = 4.38 mM, to their basal levels. The biomass was initially used as glu lac respectively. It was reported that the lag phase or the 10−5 gDCW. All other quantities were zero initially. transition between the glucose growth and the lactose In Fig. 6 we plotted time courses of cell biomass, growth lasted about 36 minutes. The OD discussed by growthrate,mRNA,βgalactosidase,intracellularlactose, Lawrence and Maier [14] is accurate when its values in- extracellular lactose and glucose. The diauxic growth 7 101×(gDCW) patterns (logarithmic scale used in the cell biomass) on 100 glucose and lactose are shown in Fig. 6 (a). The slopes X: Biomass 1100−−21 ofFthroemceFlligb.io6m(abs)s,dreuprrinesgenthtedeiffxeproennetngtiraolwgtrhowratthesp.eriod of glucose, the growth rate µ(t) was almost a constant. 10−3 However, when the level of the extracellular glucose de- 10−4 creased after 500 minutes, the growth rate µ(t) dropped 10−50 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Time (min) rapidly. In the following lag phase, the growth rate was (a)Cellbiomass negligibleorlessthanthethresholdvalueofdetectingcell growth. After the lagphase, E. coli restartedthe lactose 2.5(10−2min−1) utilization and the growth rate increased rapidly. When 2.0 the lactose nutrient was almost used up the growth rate µ(t) 1.5 dropped quickly again. In Fig. 6 (b), during the lactose growth period, the 1.0 growth rate µ(t) never reached a constant, so no ex- 0.5 ponential growth was reached. This is accounted for 00 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 by the high cell biomass accumulated after the glucose (b)Growthrate Time (min) growthperiod. The base cellbiomass wasnow (5×10−2 - 2×10−1 gDCW. Therefore,during the lactose growth period, there were no enough lactose nutrient supplied × 10 nmol/gDCW 2.5 before the lactose exponential growth was reached. 2.0 ρbgal(t) Fig. 6 (c) shows how protein βgalactosidase changed with time. The protein expression increased rapidly 1.5 once the lactose utilization started. However, the 1.0 βgalactosidase took a long time to decrease to zero even 0.5 if there were no lactose nutrient available. This can be 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 explained by the protein degradation time which is ap- Time (min) proximately 100 minutes. The time evolution of lactose (c)βgalactosidase permease was the same as βgalactosidase except at the level four times greater than the level of βgalactosidase. 0.14(× nmol/gDCW) The level of mRNA is shown in Fig. 6 (d). The zya 0.12 ρmRNAzya(t) mRNAzya molecules increased and decreased similar to 0.10 the growth rate µ(t) during the lactose growth period. 0.08 ThepeakdensitiesofmRNA inFig. 6(d)wereabout zya 0.06 15 - 18 molecules per cell. The level of the intracellular 0.04 lactose in Fig. 6 was very low and it had the same time 0.02 evolution as mRNA . The time courses of the extra- 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 zya Time (min) cellular glucose and lactose densities during the glucose- (d)mRNAzya lactose diauxic growth are plotted in Fig. 6 (f). From this figure, the extracellular lactose was not transported 3.5(× 102nmol/gDCW) intothe cellbeforethe glucosewasusedup, andthis can ρilac(t) be attributed to the inducer exclusion. 2.5 1.5 IV. SUMMARY 0.5 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Wehavepresentedanextendedmathematicalmodelof Time (min) the glucose-lactosediauxic growthin E. coli. The math- (e)Intracellular lactose ematicalmodelmadewithfourchangeswasvalidatedby two experiments’ data. For the lactose nutrient only in ×(mM) aninfinite pool,the numericalresultoftime evolutionof 4 a βgalactosidase was compared with Knorre’s experimen- 3 b ρoglu(t) ρolac(t) tal data. For both glucose and lactose nutrients in an finite pool, the dynamics of the cell biomass were con- c 2 verted to the experimentalOD of E. coli MG 1655. The 1 d discrepancybetweenthecalculatedODandtheobserved experimentalODintheperiodofthe lactosegrowthwas 00 100 200 300 400 500 600 700 800Time9 0(m0in) 1000 analyzed. ThediauxicgrowthpatternofawildtypeofE. (f)Extracellularlactoseandglucose FIG.6: DiauxicgrowthpatternofwildtypeE.coliwithfour levels of the extracellular glucose and lactose (ρo (t = 0) = glu ρo (t=0)=1, 2, 3, 4 mM). lac 8 coli was studied. The extended mathematical model in APPENDIX A: RATE EQUATIONS thisworkshowsthatdiauxicgrowthpatternsofdifferent species of E. coli can be quantitatively investigated and understood well by integrating all available information The nonlinear ODEs (Wong et al. [31]) used to solve of the involved biological processes with different time thedynamicsofthediauxicgrowthwiththefourchanges scales. made in this study are: dρo (t) ρo (t) glu = −ρ kt glu , (A1) dt cell gluρo (t)+ρ∗ glu glu dρo (t) ρo (t)R −ρ ρi lac = −kt (ρ ρ (t)) lac iex cell lac , (A2) dt lac cell perm ρo (t)+ρ ρi (t)+ρ∗ lac cell lac lac dρ (t) mRNA = k P ρ −(µ(t)+d )ρ (t), (A3) tc laczya mRNA mRNA dt dρ (t) 1 βgal = k ρ (t−τ )−(µ(t)+d )ρ (t) (A4) ts mRNA β p βgal dt 4 dρ (t) perm = k ρ (t−τ )−(µ(t)+d )ρ (t), (A5) ts mRNA p p perm dt dρi (t) ρo (t)−ρ ρi (t) lac = kt ρ (t) lac cell lac dt lac perm ρo (t)+ρ ρi (t)+ρ∗ lac cell lac lac ρi (t) −kalloρ (t) lac lac βgal ρi (t)+K lac lac ρi (t) −kcatρ (t) lac −µρi (t), (A6) lac βgal ρi (t)+K lac lac lac dρ (t) ρ (t) allo = kcatρ (t) allo −µ(t)ρ (t), (A7) dt allo βgal ρ (t)+K allo allo allo dρ (t) K cAMP cAMP = k dt cAMPK +ρo (t) cAMP glu −(k +µ(t))ρ (t), (A8) ex cAMP dX(t) = µ(t)X(t). (A9) dt Eq. A1describesthefluxofglucosetransportentering is ∼ 37 nm and the elongation rate of mRNA molecule thecell. Theextracellularglucosedensityisρo (t). The is about 50 bps/s. glu rateofglucosetransportandthe saturationconstantare The factor P, representing the transcription efficiency kgtlu and ρ∗glu respectively. of the lactose operon,is decomposedinto P =P1×P2× Eq. A2 describesthe flux oflactosetransportentering P3. P1 is the probability of the complex of RNA poly- the cell. The extracellular lactose density is ρolac(t), and merase with the σ factor at the promoter site; P2 is the the intracellular lactose density is ρi (t). The cell den- probability of the complex cAMP and CRP at the CRP lac sity ρcell is used for converting the unit (mol/gDCW) binding site; and P3 is the probability of the empty op- of the intracellular quantities having the same unit (M) erator site. The calculations of P1, P2 and P3 are given as the extracellular lactose density. The rate of lactose in Appendix C. transport and the saturation constant are kt and ρ∗ Eqs. A4 and A5 describe the rate changes of lac lac respectively. βgalactosidase and lactose permease. The rate of trans- Eq. A3 describes the transcription process of the lac- lation is kts and it depends on the growth rate µ(t). tose operon. The densities of mRNA and the lactose The degradation rate is dp. Time delay constants of genes are ρmRNA(t) and ρlaczya. The degradation rate βgalactosidase and lactose permease are τβ and τp re- and the rate of transcription are d and k respec- spectively. mRNA tc tively. Themaximaltranscriptionratek isestimatedas Eqs. A6 and A7 describe the rate changes of the in- tc 2/s, for the size of mRNA polymerase with the σ factor tracellular lactose and allolactose. The hydrolysis of lac- 9 toseandallolactosewasassumedtofollowtheMichaelis- The total glucose flux becomes, Mentenmechanism. The saturationconstantsofthe lac- Ne tose and allolactose hydrolyzation are K and K . J =K ρo (t) tot . lac allo cell c glu 1+t K ρo (t) The rate constants of transforming lactose or allolactose s c glu to glucose and galactose are klcaact and kacallto respectively. If the characteristic density ρ∗glu is defined as, ρ∗glu = Eq. A8 describes the catabolite repression regulated 1/(t K ) and 1/t = k is identified as the rate of s c s g by cAMP. The cAMP synthesis constant and inhibition the complex of EIIBC and glucose releasing the glucose constant are k and K respectively. Eq. A9 cAMP cAMP molecule into the cell, thenthe totalglucoseflux coming describes the dynamics of the cell biomass. The values into an average cell is, ofallparametersinthe rateequationsaregiveninTable II. J =k Ne (t) ρoglu(t) . Table II inserted here. cell g tot ρo (t)+ρ∗ glu glu This is the flux model usually used in modeling glucose APPENDIX B: DERIVATION OF THE FLUX transport. The characteristic glucose density actually is MODEL OF THE LACTOSE TRANSPORT the saturationconstant of glucose transportthrough EI- IBC.The equationof describing the rate ofthe extracel- The microscopic description of bidirectional lactose lular glucose density is then, transportissimilartothatoftheglucosetransport;how- dρo (t) ρo (t) ever,thelactosetransportismorecomplicated. Forsim- gdlut =−ρcellkgtluρo (gtl)u+ρ∗ plicity, we first derived the flux model of glucose trans- glu glu port and then the flux model of bidirectional lactose where kt is the rate constant of the glucose transport glu transport. including the contributionsofallglucosetransporterson Glucose is transported by the glucose transporter en- the E. coli cell plasma membrane. zyme type II BC (EIIBC), a component of PTS. In this Thetransportoflactoseissimilartotheglucosetrans- study we assumed two states of EIIBC: either free or port. However,the lactosetransportis bidirectionaland occupied. If the EIIBC subunit is occupied by a glu- cotransported with a proton ion through lactose perme- cose molecule, then it can not accept any more glucose ase. Here the kinetic constant in the lactose transport molecules until it is free again. The total number of EI- was assumed to include the effect caused by the electric IBC on the plasma membrane of E. coli is given at time potential across the cell plasma membrane. The lactose t, permease was assumed to have three states: free (f), oc- Ne (t)=Ne(t)+Ne(t), cupiedbylactosefromoutsidethecell(oo),andoccupied tot f o by lactose from inside the cell (oi). Symmetrical lactose wherenumbersoffreeandoccupiedbyglucoseareNfe(t) transportwasalsoassumed. Thetotalnumberoflactose and Ne(t) respectively. The total flux of nutrients into permease in average cell is given as, o the cell depends on the number of free EIIBC and the Nl (t)=Nl(t)+Nl (t)+Nl (t). extracellular glucose density, tot f oo oi Jo =NeK ρo (t). By using the same argumentas in the glucosetransport, cell f c glu the flux of lactose entering an averagecell is now, K is the proportionalconstant characterizedby the na- c ture of biochemical reactions of glucose and EIIBC. At J =kNl (t) ρolac(t)−ρcellρilac , any instant time, Ne(t) glucose transporters are occu- cell l tot ρo (t)+ρ ρi (t)+ρ∗ o lac cell lac lac pied by glucose molecules and if the time for a glucose ∗ where ρ is the characteristic constant or saturation molecule to be completely transportedinto the cell is t , lac s constant of the lactose transport. wethen expectthe numberofglucosemoleculesper unit The argument of two different time scales discussed time entering the cell to be, aboveisinessencetheequilibriumassumptionoftheglu- Ne cose and lactose transportation at the longer time scale Ji = o cell t of changingthe density of nutrienttransporters. Indeed, s thetotalnumberofglucosetransportersismaintainedat The time t for transporting a glucose molecule into cell s a constant number because the degradation is balanced maybeassociatedwiththephosphorylationprocess,and withtheexpressionoftheglucosetransporter. Thenum- the time scale of this transportation process is ∼ ms. ber of lactose transporters is regulated by the lactose Because it is very small compared to the time scale of operon so that the net number of lactose permeases is changingthedensityofEIIBC,whichis∼s,thesefluxes gradually increasing. Although the total number of the must be equal. This gives us the number of free EIIBC lactose permeases is not a constant at the longer time as, scale of changing the density of lactose permease, it can Ne(t)= Nteot(t) . beviewedasaconstantattheshortertimescaleoftrans- f 1+t K ∗ρo (t) porting lactose into the cell. s c glu 10 APPENDIX C: CALCULATION OF equilibriumofthe lactoseoperonwasassumed. The bio- TRANSCRIPTION EFFICIENCY chemicalreactionsassociatedwiththisrapidequilibrium are written as, The transcription initiated by mRNA polymerase will not start until the lactose operon is activated. The acti- ρ +ρ ⇋C1 ρ x1 x2 x1x2 vation ofthe lactoseoperonis mainly determined by the transcription efficiency (Bailey [2]). Presently, three ap- ρx1+ρx3 ⇋C2 ρx1x3 proachesareavailable. ThefirstistouseaHill’sfunction ρ +ρ ⇋C3 ρ asthe regulationfunctionandignorethe detailedmolec- x1 x4 x14 ular biochemical informationof the lactose operon. This ρ +ρ ⇋C4 ρ x1x2 x3 x1x2x3 approachhas been developed for a long time to simulate the regulationprocess of the lactose operon. The second ρx1x2+ρx4 ⇋C5 ρx1x2x4. approach is based on the assumption of fast equilibrium approximation; the transcription efficiency is treated as The equilibrium constants C1, C2, C3, C4, and C5 are the product of three binding probabilities: the probabil- listed in Table III. The x1, x2, and x3 are transcription ity (P ) of mRNA polymerase associated with σ factor factor, effector, and response element respectively (see 1 binding at the promoter site; the probability (P2) of a Table I). x4 stands for the nonspecific DNA sites in E. complex of CRP and cAMP binding at the CRP site; coli. If the mass balance law is implied at any time, we and the probability (P ) of the free operator. From the have the following equations, 3 mass balance law and given detailed biochemical reac- tions of the lactose operon, a set of nonlinear algebra ρ (tot) = ρ +ρ +ρ +ρ +ρ +ρ x1 x1 x1x2 x1x3 x1x4 x1x2x3 x1x2x4 equationscanbe constructedwithallkinetic parameters ρ (tot) = ρ +ρ +ρ +ρ x2 x2 x1x2 x1x2x3 x1x2x4 from the experimental studies. The third approach is ρ (tot) = ρ +ρ +ρ through identifying all possible states occurring in the x3 x3 x1x3 x1x2x3 ρ (tot) = ρ +ρ +ρ . binding sites and then giving a partition function con- x4 x4 x1x4 x1x2x4 sidering the statistical mechanics with the rapid equilib- rium approximation. The transcription efficiency, or the Since the number of nonspecific sites of DNA is much induction probability, is calculated by the states allowed greaterthanthatofregulationsites,ρx4 isapproximated for transcription to all possible states. as the total number of DNA sites, ρx4(tot) = ρntootn. The The last two approaches are better than the first one combinations of x1, x2, x3, x4 represent the complexes because the genetic structured information of the lac- of them. In this study, only complexes like x1x2, x1x3, tose operon is incorporated. Therefore an accurate de- x1x4, x1x2x3, and x1x2x4 exist. scription of the growth pattern based on the more de- Table III inserted here. tailed genotype information is expected. Nonetheless, a By using equilibrium relationships, ρx1x2 = C1ρx1ρx2, large set of kinetic parameters limits the application of ρx1x3 = C2ρx1ρx3, ρx1x4 = C3ρx1ρx4, ρx1x2x3 = the last two approaches for calculating the transcription C4ρx1x2ρx3, and ρx1x2x4 = C5ρx1x2ρx4, three nonlinear efficiency. In this study, we used the second approach algebraic equations with three unknown quantities, ρx1, but only the main operator was considered. In addition, ρx2, and ρx3 are given, weassumedno dependence amongthesethree processes. The total induction probability is thus, ρx1(tot) = ρx1+C1ρx1ρx2+C2ρx1ρx3+C3ρx1ρx4 +C C ρ ρ ρ +C C ρ ρ ρ P =P ×P ×P , 4 1 x1 x2 x3 5 1 x1 x2 x4 1 2 3 ρ (tot) = ρ +C ρ ρ +C C ρ ρ ρ x2 x2 1 x1 x2 4 1 x1 x2 x3 where +C C ρ ρ ρ 5 1 x1 x2 x4 ρ (tot) = ρ +C ρ ρ +C C ρ ρ ρ ρ(mRNAp,σ,p) x3 x3 2 x1 x3 4 1 x1 x2 x3 P = , 1 ρ(p) The ρ (tot), ρ (tot), and ρ (tot) are input densities, x1 x2 x3 which can be constant values (see table II), or predicted ρ(CRP,cAMP,CRPsite) by the differential equations [13], whereas ρx1, ρx2, and P2 = ρ(CRPsite) , ρx3 are free parts of them. The transcription efficiency P =P ×P ×P canbecalculatedbysolvingthreesetsof 1 2 3 the abovethree nonlinearalgebraequationsrespectively. ρ(o,free) For P1, ρx1 = ρrtontap, ρx2 = ρσtot, and ρx3 = ρptot; for P2, P3 = ρ(o,tot) . ρx1 = ρctortp, ρx2 = ρcAMP(t), and ρx3 = ρctortpsite; for P3, ρ = ρ , ρ = ρ (t), and ρ = ρo . The x1 repressor x2 allo x3 tot SimilartoLeeandBailey[15],LaffendandShuler[13], densities of cAMP and the intracellular allolactose are andWongetal.[31],the transcriptionefficiencywascal- providedbythe nonlinearordinarydifferentialequations culated by three fractions. At any instant time, rapid in Appendix A.