1 Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Diversidade de bactérias associadas aos cogumelos de Mata Atlântica no Estado de São Paulo Joshua Andrew Halsey Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Microbiologia Agrícola Piracicaba 2012 2 Joshua Andrew Halsey Biólogo Diversidade de bactérias associadas aos cogumelos de Mata Atlântica no Estado de São Paulo Orientador: Prof. Dr. FERNANDO DINI ANDREOTE Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Microbiologia Agrícola Piracicaba 2012 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação DIVISÃO DE BIBLIOTECA - ESALQ/USP Halsey, Joshua Andrew Diversidade de bactérias associadas aos cogumelos de Mata Atlântica no Estado de São Paulo / Joshua Andrew Halsey.- - Piracicaba, 2012. 114 p: il. Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2012. 1. Cogumelos 2. Comunidade bacteriana 3. Mata AtIântica 4. Micosfera 5. Microbiologia do solo 6. Pirosequenciamento I. Título CDD 631.46 H196d “Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor” 3 AGRADECIMENTOS Agradeço todos os mentores e colegas (todos sabem quem são realmente!) que me ajudaram ao longo deste caminho com todos os seus ganhos, quebra-cabeças e conflitos neste projeto complexo, todos os vocês sabem que realmente não conseguiria sem aquela força! Especialmente agradeço Prof. Dr. Fernando Dini Andreote por me dar a oportunidade de trabalhar com ele, por sua orientação, atenção e confiança. Agradeço também a oportunidade de ter acesso ao tesouro de natureza abundante no Parque Estadual da Serra do Mar, espero que suas belezas ficam mantidas por sempre, recebendo o respeito e carinho que se merecem. Em fim, agradeço CAPES e FAPESP pelo apoio financeiro necessário para completar este projeto. 4 5 SUMÁRIO RESUMO .......................................................................................................................... 7 ABSTRACT ....................................................................................................................... 9 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 11 1.1 Objetivos ................................................................................................................... 12 2 DESENVOLVIMENTO ................................................................................................. 13 2.1 Revisão Bibliográfica ................................................................................................ 13 2.1.1 Diversidade de microrganismos no solo ................................................................ 13 2.1.2 A comunidade bacteriana do solo ......................................................................... 14 2.1.3 A comunidade fúngica do solo ............................................................................... 16 2.1.3.1 Os fungos formadores de cogumelos ................................................................. 18 2.1.4 A micosfera ............................................................................................................ 20 2.1.5 A dinâmica na micosfera ....................................................................................... 22 2.1.6 As "highways fúngicas" .......................................................................................... 24 2.1.7 Mata Atlântica ........................................................................................................ 25 2.1.8 Relação entre conservação e diversidade de diversos ambientes ........................ 26 2.1.9 Abordagens moleculares na biodiversidade microbiana ....................................... 27 2.1.10 O papel de dados sob a diversidade microbiana ................................................. 28 2.1.11 Controle de qualidade e possíveis viéses ........................................................... 29 2.2 Material e Métodos ................................................................................................... 30 2.2.1 Amostras de solo micosférico e cogumelos em áreas de Mata Atlântica .............. 30 2.2.2 Extração de DNA das amostras ambientais .......................................................... 32 2.2.3 Identificação dos corpos de frutificação dos fungos (cogumelos) ......................... 33 2.2.4 Análise dos perfis das comunidades bacterianas nos solos micosféricos por meio da técnica de PCR-DGGE ..................................................................................... 36 2.2.5 Análises estatísticas .............................................................................................. 38 2.2.6 Sequenciamento de regiões variáveis do gene 16S DNAr por pirosequenciamento ....................................................................................................... 39 2.3 Resultados e discussão ............................................................................................ 41 2.3.1 Identificação dos corpos de frutificação dos fungos (cogumelos) ......................... 41 2.3.1.1 A influência de fatores ambientais na qualidade das amostras de cogumelos .. 43 2.3.1.2 As análises de árvores filogenéticas de cogumelos da Mata Atlântica .............. 45 2.3.1.3 Família Marasmiaceae ....................................................................................... 45 2.3.1.4 Família Lepiotaceae ........................................................................................... 47 6 2.3.1.5 Outras famílias fúngicas ...................................................................................... 49 2.3.1.6 A região 18S DNAr como complemento na filogenia de cogumelos .................. 52 2.3.1.7 Dados baseados na buscas BLAST ................................................................... 54 2.3.1.8 Nível trófico inferido ............................................................................................ 56 2.3.1.9 Saprofitia entre os cogumelos na Mata Atlântica ................................................ 57 2.3.2 Análise dos perfis das comunidades bacterianas nos solos micosféricos por meio da técnica de PCR-DGGE ...................................................................................... 58 2.3.2.1 Comunidades de α-proteobacteria e β-proteobacteria presentes nas micosferas de três parcelas de estudo ........................................................................... 61 2.3.3 Análises estatísticas ............................................................................................... 66 2.3.3.1 Comparando os valores de similaridade dentro e entre amostras compostas ... 66 2.3.3.2 Diversidade beta de comunidades bacterianas, de α-proteobacteria e de β- proteobacteria ................................................................................................................. 67 2.3.4 As comunidades bacterianas nos solos micosféricos via pirosequenciamento ..... 70 2.3.4.1 Diversidade alfa das comunidades bacterianas .................................................. 70 2.3.4.2 Diversidade beta das comunidades bacterianas ................................................ 76 2.3.4.3 UTOs com diferenças significativas entre solos micosféricos e controles .......... 81 2.3.4.4 Teste paired T para diferenças significativas entre os tratamentos .................... 81 2.3.4.5 Teste ANOVA para UTOs significativamente induzidas ou inibidas ................... 83 2.3.4.6 Abundância relativa das UTOs significativas e comparação filogenética ........... 88 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................................... 91 REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 93 ANEXOS ....................................................................................................................... 111 7 RESUMO Diversidade de bactérias associadas aos cogumelos de Mata Atlântica no Estado de São Paulo A imensa diversidade de micro-organismos no solo leva a uma inevitável riqueza de interações entre espécies. Neste intuito, esse projeto é inovador na identificação dos cogumelos da Mata Atlântica, e na descrição da comunidade bacteriana associada às suas micosferas. Usando corpos de frutificação dos fungos (cogumelos) como indicadores para sistemas ricos em nutrientes, as amostras foram coletadas para investigar as interações entre os fungos (maioria do domínio Basidiomycota) e as bactérias presentes no solo em volta das micélios fúngicos (ambiente micosférico). As análises foram feitas com técnicas independentes de cultivo (análise PCR-DGGE, sequenciamento Sanger de fragmentos de ITS/18S e pirosequenciamento de tags da região V4 de 16S DNAr). As famílias fúngicas Marasmiaceae e Lepiotaceae, do domínio Basidiomycota foram as mais abundantes entre os cogumelos amostrados (13 e 5 cogumelos, respectivamente), e estavam presentes entre todas as três parcelas de estudo. As demais amostras foram alocadas dentro das famílias Marasmiaceae, Lepiotaceae, Inocybaceae, Lachnocladiaceae, Bolbitiaceae, Entolomataceae, Hygrophoraceae, Hymenogastraceae, Mycenaceae e Strophariaceae, além de dois do domínio Ascomycota. Baseado na análise de DGGE, é bastante claro que existe uma grande diferença na comunidade bacteriana (de toda a comunidade bacteriana, de α- proteobacteria e de β-proteobacteria) entre os solos associados ou não com os corpos de frutificação. Os dados de pirosequenciamento indicaram que dentro dos tratamentos as amostras se agruparam baseado nas famílias fúngicas ou no substrato onde os cocumeglos ocorrem (solo ou serrapilheira), sendo clara em algumas micosferas as alterações na ocorrência de grupos microbianos. O grupo de UTOs mais induzidas na região da micosfera foi composto dos grupos Burkholderia, Acidobacteria Gp1, Comamonadaceae, Sphingobacteriaceae, Burkholderiaceae, Chitinophagaceae), Schlesneria, Acidobacteria Gp3 e Spartobacteria gênero incertae sedis. Isto indica que existe um processo de seleção para bactérias específicas dependendo das diversas variáveis e fatores ambientais presentes no microhabitat micosfera. Palavras-chave: Cogumelos; Comunidade bacteriana; Pirosequenciamento; Mata Atlântica; Micosfera 8 9 ABSTRACT Bacterial diversity associated with mushrooms of the Brazilian Atlantic Rainforest in the State of São Paulo The immense microbial diversity in the soil leads to inevitable richness in inter-species interactions. For this reason, this is a novel project that focuses on identifying mushrooms and the associated bacterial community with their mycospheres in the Brazilian Atlantic Rainforest. Using fungal fruiting bodies (mushrooms) as indicators of nutrient-rich systems, samples were taken to investigate the interactions between fungi (mostly of the domain Basidiomycota) and bacteria present in the soil surrounding fungal mycelia (mycosphere environment). The analyses were conducted using culture-independent techniques, where isolating DNA of bacteria and/or mushrooms attempts to provide information on microbial functionality. These culture-independent analyses (PCR-DGGE, Sanger sequencing of ITS/18S fragments, and pyrosequencing of tags from the V4 region of 16S rDNA) generated extensive data on the bacterial diversity selected for in the presence of fungal structures in the soil. The fungal families Maramiaceae and Lepiotaceae, of the domain Basidiomycota were the most abundant among the mushrooms sampled (13 and 5 mushrooms, respectively) and were present in all of the three sampling sites. The rest of the mushrooms were found to be within the families Marasmiaceae, Lepiotaceae, Inocybaceae, Lachnocladiaceae, Bolbitiaceae, Entolomataceae, Hygrophoraceae, Hymenogastraceae, Mycenaceae, and Strophariaceae, in addition to two of the domain Ascomycota. Based on DGGE analysis, it is clear that there is a great difference in the bacterial community (entire bacterial community, of α- proteobacteria and of β-proteobacteria) between all fungal fruiting body-associated and non-associated soils. The pyrosequencing data indicated that within each treatment group, the samples did not separate according to fungal families or substrate where the mushrooms were found (in the soil or amoung the leaf litter). However, some mycospheres exhibited clearly altered bacterial communities. The group of OTUs most induced in the mycosphere region consisted of Burkholderia, Acidobacteria Gp1, Comamonadaceae, Sphingobacteriaceae, Burkholderiaceae, Chitinophagaceae), Schlesneria, Acidobacteria Gp3, and Spartobacteria genus incertae sedis. This indicates that there is a selection process for specific bacteria depending on a wide range of variable and environmental factors acting in the mycosphere microhabitat. Keywords: Mushrooms; Bacterial community; Pyrosequencing; Atlantic Rainforest; Mycosphere