UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO LABORATÓRIO DE IMUNOPATOLOGIA KEIZO ASAMI PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA APLICADA À SAÚDE NARA BARBOSA ARAÚJO ANÁLISE DO PERFIL DE METILAÇÃO DO DNA EM PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA RECIFE 2015 NARA BARBOSA ARAÚJO ANÁLISE DO PERFIL DE METILAÇÃO DO DNA EM PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Aplicada à Saúde do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito exigido para obtenção de título de Mestre. Orientação: Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho – Programa de Pós-Graduação em Biologia Aplicada à Saúde, LIKA/UFPE. Co-orientação: Prof(a). Dr(a). Danyelly Bruneska Gondim M artins – Programa de Pós-Graduação em Biologia Ap licada à Saúde, LIKA/UFPE. RECIFE 2015 Catalogação na Fonte: Bibliotecário Bruno Márcio Gouveia, CRB-4/1788 Araújo, Nara Barbosa Análise do perfil de metilação do DNA em pacientes com câncer de mama / Nara Barbosa Araújo. – Recife: O Autor, 2015. 67 f.: il. Orientadores: José Luiz de Lima Filho, Danyelly Bruneska Gondim Martins Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Pós-graduação em Biologia Aplicada à Saúde, 2015. Inclui referências 1. Mamas – Câncer 2. Genética médica I. Lima Filho, José Luiz de (orient.) II. Martins, Danyelly Bruneska Gondim (coorient.) III. Título. 616.994 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2015-109 NARA BARBOSA ARAÚJO ANÁLISE DO PERFIL DE METILAÇÃO DO DNA EM PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Aplicada à Saúde do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito exigido para obtenção de título de Mestre. Aprovado em 31 de Março de 2015. BANCA EXAMINADORA _______________________________________________ Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho Orientador _______________________________________________ Prof. Dr. Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão Membro Membro interno _______________________________________________ Dr(a). Carla Limeira Barreto Membro externo RECIFE 2015 AGRADECIMENTOS Agradeço sobretudo a Deus, por sempre me dar forças nos momentos mais difíceis e por me fazer acreditar que tudo o que me reserva é o melhor para mim; Aos meus pais por todo o apoio que sempre recebi, por sempre caminharem ao meu lado nas situações mais prazerosas e também nas mais difíceis, por vibrarem comigo em cada conquista alcançada e sofrerem junto por cada lágrima derramada. A vocês, o meu amor incondicional! À minha irmã, por todo o amor e cuidado de irmã mais velha e por ser minha amiga ―de sempre‖, mesmo sendo o oposto de mim; Ao meu namorado, Jean, pelo amor que tem por mim, por ser meu exemplo de dedicação, pela compreensão nos momentos em que não pude dar atenção, principalmente na fase final deste trabalho, e por me ensinar a ser um pouco mais racional nos momentos necessários; Ao meu orientador, Prof. José Luiz, por ter me acolhido de volta ao LIKA, por ter aceitado me orientar e por ter me confiado a realização deste trabalho. Para mim é uma honra tê-lo como orientador! À minha co-orientadora, Prof.(a) Danyelly Bruneska, pela orientação do dia-a-dia a qual possibilitou o desenvolvimento deste trabalho; À Prof.(a) Maria da Paz, minha querida orientadora de IC e minha ―mãe‖ no LIKA, por todo o carinho ao longo desses anos e por sempre rezar por mim; À Roberta, por todos os momentos compartilhados ao longo desses dois anos, desde as risadas (que foram muitas), até os aperreios (que também foram muitos). Você foi para mim não apenas uma amiga, mas uma irmã, pois ninguém é capaz de entender melhor o que o outro passa do que um irmão; A toda a equipe de mastologia do Hospital Barão de Lucena, especialmente ao Dr. Darley Ferreira, pela parceria firmada com o LIKA, por ter nos acolhido da melhor forma e por nos possibilitar a rica experiência da rotina no serviço e da vivência com as pacientes; A todos os residentes da mastologia, especialmente Eduardo, pelo acolhimento, pelo interesse demostrado pela pesquisa e pela incomensurável ajuda na obtenção das amostras e dos laudos; A todas as pacientes que aceitaram participar dessa pesquisa, doando não só suas amostras, mas também parte do seu tempo durante aquele momento tão difícil e sofrido que estavam vivendo. Especialmente a Sílvia, que como tantas outras, nos deram uma lição de vida, mostrando que é possível sorrir, mesmo diante das dificuldades; À Elisa e Lígia pela disponibilidade e pela valiosa colaboração para o desenvolvimento experimental desse trabalho; À Sandra, pela imensa disponibilidade em sempre nos ajudar, pela amizade, pela torcida para que tudo desse certo e pelos momentos leves e alegres vividos no laboratório; A todos os colegas e amigos que fazem parte do grupo Prospecmol, especialmente Fabrício, Monique e Taciana, pelas experiências compartilhadas e pela disponibilidade em ajudar; À Eliete pela amizade, pelos avisos em relação aos prazos, pelas informações e por ser para sempre PPGBAS; Aos meus queridos amigos do mestrado, especialmente Matheus e Thiago, pelo companheirismo e pelos prazerosos momentos vividos ao longo desses dois anos; Às queridas amigas e colegas de profissão, Aleide, Fernanda e Rosário, pela certeza de que posso sempre contar com vocês; A todos os meus amigos, em especial Ylissa e Abdiel que, mesmo sem entender o que eu faço, valorizam, acreditam, torcem e vibram por mim; A todos vocês, os meus sinceros agradecimentos. “Por mais inteligente que alguém possa ser, se não for humilde, o seu melhor se perde na arrogância. A humildade ainda é a parte mais bela da sabedoria.” Autor Desconhecido RESUMO O câncer de mama é o câncer mais comum e a principal causa de morte por câncer entre as mulheres, em todo o mundo. Diferentes mutações têm sido relacionadas ao câncer, mas apenas as mutações não conseguem esclarecer a heterogeneidade do câncer de mama. Desta forma, eventos epigenéticos têm sido estudados em tecido mamário cancerígeno. A metilação do DNA é a regulação epigenética mais estudada e bem compreendida, sendo catalisado pelas enzimas da família das DNA Metiltransferases; principalmente DNMT1, DNMT3A, e DNMT3B. Além disso, DNMT2 (TRDMT1), inicialmente considerada como um membro desta família foi mais tarde descrita como uma tRNA metiltransferase e, até o momento, pouco se sabe sobre a sua função. O objetivo deste estudo foi determinar o perfil de metilação do DNA em 31 pacientes com câncer de mama ductal invasivo e 04 tecidos saudáveis obtidos a partir da mama oposta. Os níveis globais de metilação foram observados por meio de um ensaio de ELISA, enquanto que os níveis de expressão das DNMTs (DNMT1, DNMT2 e DNMT3B) foram determinados por PCR em tempo real. Os níveis de expressão gênica também foram analisados para BRCA1, BRCA2, ERBB2 e ERBB4. Todos estes parâmetros foram correlacionados com os dados dos pacientes e as características intrínsecas dos tumores. Nossos resultados mostram que a metilação global em tumores de mama é significativamente menor em comparação com os tecidos saudáveis da mama (p = 0,0034). DNMT1 e DNMT3B foram mais expressos no tecido de carcinoma mamário (p = 0,0034; p = 0,0031, respectivamente), sendo o nível de DNMT3B significativamente maior (p = 0,0391) do que o nível de DNMT1. Apenas DNMT1 exibiu uma correlação com a metilação global, apesar de ser inversa. Além disso, a expressão das DNMTs apresentou uma forte correlação positiva com BRCA1 e apenas a DNMT2 mostrou estar relacionada com BRCA2. Pacientes submetidos a terapias adjuvantes apresentaram uma diminuição significativa na expressão de DNMT2 (p = 0,0013), indicando uma redução dos níveis de metilação em moléculas de tRNA. História familiar de câncer de mama foi a única variável independente que se correlacionou com os níveis de DNMT1 (p = 0,0043), sendo maior em pacientes com risco hereditário. Nossos resultados apontam para um importante papel das DNMTs no câncer de mama e mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos subjacentes envolvidos no processo de metilação que contribuem para o desenvolvimento e progressão do câncer de mama. Palavras-chave: câncer de mama; DNA metiltransferases; metilação do DNA; metilação global ABSTRACT Breast cancer is the most common cancer and the leading cause of cancer deaths among women worldwide. Different mutations were related to breast cancer, but only their presence cannot explain de heterogeneity of this cancer. Then, epigenetic events have been studied in breast cancer tissues. DNA methylation is the most studied and well-understood epigenetic regulation, being catalysed by DNA methyltransferases family; mainly DNMT1, DNMT3A, and DNMT3B. Besides, DNMT2 (TRDMT1), initially thought to be a member of this family, was later described as a RNA methyltransferase and so far, little is known about its function. The aim of this study was to determine the DNA methylation profile in 31 patients with Invasive Ductal Breast Cancer and 04 healthy tissues obtained from the opposite breast. Tests were performed for global methylation levels through an ELISA assay and for the expression levels of DNMTs (DNMT1, DNMT2 and DNMT3B) by real-time PCR. Gene expression was also analysed for BRCA1, BRCA2, ERBB2 and ERBB4. All these parameters were correlated with patient‘s data and intrinsic characteristics of the tumours. Our results show that global methylation in breast tumours is significant lower compared to breast healthy tissues (p= 0.0034). DNMT1 and DNMT3B (p=0.0034; p=0.0031, respectively) showed high expression in breast cancer tissue, being DNMT3B level significantly higher (p=0.0391) than DNMT1 level. Only DNMT1 exhibit a correlation with the global methylation, despite inversely related. In addition, DNMTs presented a tightly positive correlation with BRCA1 and only DNMT2 seems to be related with BRCA2. Patients submitted to adjuvant therapies showed a significant decrease in DNMT2 expression (p=0.0013), indicating reduced methylation levels in tRNA molecules. Family history of breast cancer was the only independent variable that correlated to DNMT1 level (p=0.0043), being higher in patients with hereditary risk. Our results points to an important role of DNMTs in breast cancer and further studies are necessary to elucidate the underlying mechanisms involved in methylation process, contributing to breast cancer development and progression. Keywords: breast cancer; DNA methylation, DNA methyltransferases; global methylation LISTA DE QUADROS Quadro 1: Incidência dos principais tipos de câncer em todo mundo ......... Erro! Indicador não definido. Quadro 2: Mortalidade dos principais tipos de câncer em ambos os sexos Erro! Indicador não definido. Quadro 3: Mortalidade dos principais tipos de câncer, em todo o mundo, em mulheres. . Erro! Indicador não definido.