Dévelopement d’outils microfluidiques appliqués à la biologie. Réalisation de dispositifs de tri cellulaire magnétique vertical. Sébastien Cargou To cite this version: Sébastien Cargou. Dévelopement d’outils microfluidiques appliqués à la biologie. Réalisation de dis- positifsdetricellulairemagnétiquevertical.. Microetnanotechnologies/Microélectronique. Université Paul Sabatier - Toulouse III, 2014. Français. ￿NNT: ￿. ￿tel-00996924￿ HAL Id: tel-00996924 https://theses.hal.science/tel-00996924 Submitted on 27 May 2014 HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. 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(cid:53)(cid:41)(cid:181)(cid:52)(cid:38) (cid:38)(cid:79)(cid:1)(cid:87)(cid:86)(cid:70)(cid:1)(cid:69)(cid:70)(cid:1)(cid:77)(cid:8)(cid:80)(cid:67)(cid:85)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:74)(cid:80)(cid:79)(cid:1)(cid:69)(cid:86)(cid:1) (cid:37)(cid:48)(cid:36)(cid:53)(cid:48)(cid:51)(cid:34)(cid:53)(cid:1)(cid:37)(cid:38)(cid:1)(cid:45)(cid:8)(cid:54)(cid:47)(cid:42)(cid:55)(cid:38)(cid:51)(cid:52)(cid:42)(cid:53)(cid:178)(cid:1)(cid:37)(cid:38)(cid:1)(cid:53)(cid:48)(cid:54)(cid:45)(cid:48)(cid:54)(cid:52)(cid:38)(cid:1) (cid:37)(cid:207)(cid:77)(cid:74)(cid:87)(cid:83)(cid:207)(cid:1)(cid:81)(cid:66)(cid:83)(cid:1)(cid:27) UniversitéToulouse3PaulSabatier(UT3PaulSabatier) (cid:49)(cid:83)(cid:207)(cid:84)(cid:70)(cid:79)(cid:85)(cid:207)(cid:70)(cid:1)(cid:70)(cid:85)(cid:1)(cid:84)(cid:80)(cid:86)(cid:85)(cid:70)(cid:79)(cid:86)(cid:70)(cid:1)(cid:81)(cid:66)(cid:83)(cid:1)(cid:27) SébastienCargou le 03Mars2014 (cid:53)(cid:74)(cid:85)(cid:83)(cid:70)(cid:1)(cid:27) (cid:1) Développementd'outilsmicrofluidiquesappliquésàlabiologie. Réalisationdedispositifsdetricellulairemagnétiquevertical. (cid:178)(cid:68)(cid:80)(cid:77)(cid:70)(cid:69)(cid:80)(cid:68)(cid:85)(cid:80)(cid:83)(cid:66)(cid:77)(cid:70) et (cid:1)discipline ou spécialité(cid:27) (cid:1) EDGEET:MicroetNanosystèmes (cid:54)(cid:79)(cid:74)(cid:85)(cid:207)(cid:1)(cid:69)(cid:70)(cid:1)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:73)(cid:70)(cid:83)(cid:68)(cid:73)(cid:70)(cid:1)(cid:27) LAAS-CNRS (cid:37)(cid:74)(cid:83)(cid:70)(cid:68)(cid:85)(cid:70)(cid:86)(cid:83)(cid:9)(cid:84)(cid:10)(cid:1)(cid:69)(cid:70)(cid:1)(cid:702)(cid:210)(cid:84)(cid:70)(cid:1)(cid:27) Mme.Anne-MarieGué Jury: M.GilbertReyne,Rapporteur M.Jean-LouisViovy,Rapporteur M.AliBoukabache M.ThierryParra Mme.KarineReybier Mme.Rose-MarieSauvage ! Table&des&matières& REMERCIEMENTS&.............................................................................................................................&1! GLOSSAIRE&.........................................................................................................................................&2! INTRODUCTION&GENERALE&..........................................................................................................&3! CHAPITRE& 1&:& LE& TRAITEMENT& D’ECHANTILLON& BIOLOGIQUE& APPLIQUE& AU& DIAGNOSTIC&:&ETAT&DE&L’ART&.....................................................................................................&5! Introduction*...................................................................................................................................................*6! 1.1*Le*sang*un*outil*pour*le*diagnostic*............................................................................................................*9! 1.1.1!Le!sang,!un!mélange!complexe!..................................................................................................................!9! 1.1.2.!Les!monocytes!comme!marqueur!de!l’inflammation!.............................................................................!10! 1.2*Les*appareils*pour*le*diagnostic*entre*macro*et*micro*.............................................................................*10! 1.2.1!Les!«!gold!standard!»!de!l’analyse!sanguine!:!la!cytométrie!de!flux!et!l’étude!de!lame!..........................!10! 1.2.2!L’analyse!sanguine!par!microdispositifs!commercialisés!:!une!grande!gamme!de!produits!pour!des! analyses!restreintes!..........................................................................................................................................!13! 1.2.3!Les!microsystèmes!d’analyse!en!recherche!:!une!grande!diversité!.........................................................!15! 1.3*Le*magnétisme*appliqué*à*la*microfluidique*...........................................................................................*17! 1.3.1!Quand!la!microfluidique!utilise!le!magnétisme!.......................................................................................!17! 1.3.2!La!manipulation!magnétique!:!une!question!d’intégration!.....................................................................!19! 1.4*Positionnement*du*travail*de*thèse*........................................................................................................*20! 1.4.1!Quelques!dispositifs!qui!valent!le!détour!.................................................................................................!20! 1.4.2!Les!travaux!de!la!thèse!.............................................................................................................................!24! CHAPITRE&2&:&CONCEPTION,&SIMULATION&ET&OPTIMISATION&DE&L’ACTIONNEUR& MAGNETIQUE&.................................................................................................................................&27! Introduction*.................................................................................................................................................*28! 2.1*La*force*magnétique*:*l’association*d’un*objet*paramagnétique*et*d’un*champ*magnétique*...................*29! 2.1.1!Propriétés!magnétiques!des!matériaux!et!billes!magnétiques!................................................................!29! 2.1.2!Création!d’un!champ!magnétique!:!aimant!permanent!et!électroaimant!...............................................!34! 2.1.3!Force!magnétique!ou!interaction!entre!champ!et!particule!....................................................................!37! 2.2*Conception*des*bobines*d’actionnement*................................................................................................*39! 2.2.1!Travaux!antérieurs!...................................................................................................................................!39! 2.2.2!Approfondissement!de!l’étude!des!structures!.........................................................................................!41! 2.3*Optimisation*des*structures*....................................................................................................................*44! 2.3.1!Diminution!du!plot!central!.......................................................................................................................!44! 2.3.2!Augmentation!du!nombre!de!spires!........................................................................................................!47! 2.3.3!Ajout!d’un!matériau!ferromagnétique!.....................................................................................................!48! 2.4*Bobines*en*visLàLvis*et*perspectives*........................................................................................................*50! Conclusion*....................................................................................................................................................*56! CHAPITRE& 3&:& MANIPULATION& D’ECOULEMENTS& FLUIDIQUES& DANS& DES& GEOMETRIES&3D&ORIGINALES&EN&SU8&...................................................................................&57! Introduction*.................................................................................................................................................*58! 3.1*Procédé*de*fabrication*............................................................................................................................*59! 3.1.1!La!photolithographie!................................................................................................................................!59! 3.1.2!La!SU8!:!un!matériau!incontournable!......................................................................................................!61! 3.1.3!Technologie!de!structuration!de!la!SU8!...................................................................................................!63! 3.1.4!Le!procédé!de!laminage!:!réaliser!un!puce!tout!en!SU8!..........................................................................!65! 3.1.5!Amélioration!du!procédé!de!fabrication!..................................................................................................!66! 3.2*Le*laminage*une*technique*irremplaçable*...............................................................................................*67! 3.2.1!Quelques!difficultés!liées!à!l’utilisation!du!laminage!...............................................................................!67! 3.2.2!Optimisation!du!procédé!de!laminage!.....................................................................................................!69! 3.2.3!Autres!moyens!de!faire!du!3D!:!................................................................................................................!69! 3.3*L’écoulement*en*microfluidique*..............................................................................................................*72! 3.3.1!L’écoulement!mis!en!équation!.................................................................................................................!72! 3.3.2!Analogie!avec!les!circuits!électriques!.......................................................................................................!75! 3.3.3!Les!phénomènes!de!diffusion!:!A!ne!pas!toujours!négliger!.....................................................................!75! 3.4*CoLécoulements*dans*les*structures*3D*...................................................................................................*76! 3.4.1!Principe!de!fonctionnement!....................................................................................................................!76! 3.4.2!Modélisation!des!écoulements!dans!les!structures!3D!............................................................................!77! 3.4.3!Validation!expérimentale!.........................................................................................................................!80! 3.4.4!Vers!le!concept!de!mulTsensor!................................................................................................................!85! 3.4.4!Application!à!l’étude!de!l’agrégation!d’amyloïde!beta!............................................................................!89! Conclusion*....................................................................................................................................................*95! CHAPITRE& 4&:& CONCEPTION& ET& REALISATION& DE& DISPOSITIF& DE& SEPARATION& MAGNETIQUE&.................................................................................................................................&96! Introduction*.................................................................................................................................................*97! 4.1*Conception*du*module*de*tri*magnétique*vertical*...................................................................................*98! 4.1.1!Design!des!micro!bobines!........................................................................................................................!98! 4.1.2!Design!des!micro!canalisations!................................................................................................................!99! 4.2*Fabrication*............................................................................................................................................*101! 4.2.2!Comportement!de!la!SU8!non!réticulée!................................................................................................!102! 4.2.3!Etapes!de!fabrication!.............................................................................................................................!107! 4.2.4!Minimisation!des!contraintes!mécaniques!............................................................................................!117! 4.3*Connectiques*fluidiques*et*électriques*..................................................................................................*118! 4.3.2!La!connectique!fluidique!........................................................................................................................!118! 4.3.3!La!connexion!électrique!.........................................................................................................................!121! Conclusion*..................................................................................................................................................*122! CHAPITRE&5&:&MANIPULATION&DES&MICROBILLES&MAGNETIQUES&............................&123! Introduction*...............................................................................................................................................*124! 5.1*Présentation*du*banc*de*caractérisation*...............................................................................................*125! 5.1.1!Contrôle!des!fluides!...............................................................................................................................!125! 5.1.2!Contrôle!électrique!:!..............................................................................................................................!126! 5.1.3!Système!d’observation!...........................................................................................................................!127! 5.2*Séparation*verticale*de*microbilles*magnétiques*..................................................................................*128! 5.2.1!Bilan!des!forces!:!un!équilibre!vite!renversé!..........................................................................................!128! 5.2.2!Mise!en!œuvre!expérimentale!...............................................................................................................!132! 5.2.3!Caractérisation!de!la!fonction!de!piégeage!avec!des!billes!magnétiques!..............................................!134! 5.2.4!Caractérisation!de!la!fonction!de!séparation!avec!des!billes!magnétiques!...........................................!137! 5.3*Etude*de*l’échauffement*.......................................................................................................................*148! 5.3.1!Partie!expérimentale!..............................................................................................................................!148! 5.3.2!Partie!théorique!.....................................................................................................................................!152! Conclusion*..................................................................................................................................................*154! CHAPITRE& 6&:& MANIPULATION& D’ELEMENTS& BIOLOGIQUES&=& SEPARATION& MAGNETIQUE&DE&MONOCYTES&...............................................................................................&155! Introduction*...............................................................................................................................................*156! 6.1*Culture*des*monocytes*.........................................................................................................................*157! 6.1.1!Les!monocytes!de!culture!THP1!.............................................................................................................!157! 6.1.2!Le!milieu!de!culture!................................................................................................................................!157! 6.1.3!Culture!des!monocytes!..........................................................................................................................!159! 6.2*Billes*magnétiques*et*fonctionnalisation*...............................................................................................*161! 6.3*Marquage*des*monocytes*.....................................................................................................................*163! 6.3.1!Marquage!magnétique!des!monocytes!.................................................................................................!163! 6.3.2!Marquage!fluorescent!des!monocytes!..................................................................................................!165! 6.4*Séparation/déviation*bille*+*monocytes*................................................................................................*167! 6.4.1!Bilan!des!forces!avec!monocytes!...........................................................................................................!167! 6.4.2!Piégeage!des!billes!et!monocytes!..........................................................................................................!170! 6.4.3!Séparation!en!dispositif!3D!....................................................................................................................!171! Conclusion*..................................................................................................................................................*173! CONCLUSION&GENERAL&ET&PERSPECTIVES&........................................................................&174! Une*séparation*magnétique*verticale*performante*et*prometteuse*...........................................................*174! Le*design*de*deuxième*génération*n’a*pas*livré*tous*ses*secrets*.................................................................*175! Des*designs*imaginés*et*réalisés*mais*non*encore*exploités*........................................................................*176! Une!séparation!horizontale!avec!un!design!en!2D!.........................................................................................!176! De!nouvelles!options!avec!des!bobines!en!vis`à`vis!........................................................................................!178! Les*approches*hybrides*:*voir*l’aimant*permanent*comme*un*atout*...........................................................*178! Les!avantages!de!la!combinaison!aimants!permanents!et!microbobines!.......................................................!178! Les!avantages!d’ajout!d’aimants!permanents!pour!notre!étude!....................................................................!180! BIBLIOGRAPHIE&..........................................................................................................................&181! ANNEXE&A&:&CONFERENCE,&POSTER,&BREVET&.....................................................................&188! ANNEXE& B&:& TRI& HYDRODYNAMIQUE& POUR& LA& SEPARATION& EN& TAILLE& ET& AMELIORATION&...........................................................................................................................&190! ANNEXE&C&:&MARQUAGE&SUR&PUCE&........................................................................................&198! ANNEXE&D&:&LA&VISUALISATION&EN&3D&:&OBSERVATION&SUR&LA&TRANCHE&.............&200! ! ! Remerciements& ! J’ai!commencé!ma!thèse!il!y!a!plus!de!trois!ans!maintenant!et!je!n’aurais!jamais!pu!imaginer!la!moitié! de!ce!que!j’ai!vécue!durant!ces!années!au!LAAS.!! ! Je!suis!aujourd’hui!bien!différent!que!quand!j’ai!commencé,!et!tant!!mieux,!mais!finalement,!n’est!ce! pas!le!propre!du!chercheur,!d’apprendre,!comprendre!et!pousser!plus!loin!?!J’ai!appris!énormément! d’un!point!de!vue!scientifique!et!bien!plus!encore!d’un!point!de!vue!personnel.!! ! J’ai!beaucoup!apprécié!de!travailler!au!LAAS,!rendant!plus!difficile!le!moment!du!départ!et!plus! grande!la!peur!de!ne!plus!retrouver!pareil!merveille.!Je!ne!suis!pas!sûr!que!tout!le!monde!ici!se!rende! compte!de!la!chance!de!pouvoir!travailler!dans!un!tel!endroit,!tant!le!lieux!est!propice!au!travail,!à! l’échange!mais!aussi!à!une!bonne!ambiance.!! ! J’ai!parlé!de!bonne!ambiance!et!elle!est!beaucoup!due!au!gens!que!nous!pouvons!rencontrer,!de!ce! fait,!il!y!a!beaucoup!de!personnes!que!j’aimerais!remercier!ici.!D’autant!plus!que!j’ai!eu!la!chance!de! pouvoir!interagir!avec!beaucoup!de!gens!et!des!gens!formidables.!«!Vous!côtoyer!au!laboratoire! ferais!croire!que!tout!le!monde!est!génial!mais!c’est!faux!c’est!vous!qui!êtes!génial!».!J’ai!prononcé! cette!phrase!lors!de!mon!pot!de!thèse!et!je!le!pense!sincèrement!alors!merci!à!vous!(je!m’excuse!si! l’ordre!des!remerciement!ne!convient!pas!à!tous!le!monde!et!surtout!si!j’ai!oublié!des!gens)!:! Stéphane,! Vincent,! Hubert,! Ana,! Marc,! Joris,! Loïc,! Catherine,! Sébastien,! Charline,! Céline,! Aliki,! Sandrine,!Anaëlle,!Sabeha,!Cloé,!Medhi,!Guilhaume,!Ludo,!Mathilde,!Aurélien,!Pierre,!Marie,!Anne,! Georges,!Marie`Laure,!Hakim,!Georgina,!Maud,!Fabien,!Sabri,!Denis,!Pattamon,!Maeva,!François,! Lamine,!JohnJohn,!Jo…! ! J’aimerais!aussi!remercier!des!gens!extérieures!au!laboratoire!mais!qui!compte!pour!moi.!Je!pense! d’abord!à!mes!amis!certains!d’enfance!comme!Sébastien!qui!a!toujours!était!présent!durant!toutes! ces!années.!Je!pense!aussi!aux!cygnes,!Coline,!Emilie!et!Sébastien,!vous!êtes!tellement!important!à! mes!yeux,!je!ne!vous!oublie!pas.!Aux!vo!sinh!du!club!de!Toulouse,!aux!improvisateurs!de!la!LUDI!et! aux!rencontres!plus!ou!moins!fortuites.! ! Finalement,!comment!ne!pas!parler!de!ma!famille!et!notamment!de!mes!deux!frères!Laurent!et!Cyril! et!de!ma!belle!sœur!Marine,!toujours!partant!pour!me!changer!les!idées.! Un! dernier! merci,! à! vous! mes! parents! pour! votre! soutient! infaillible! et! ces! week`end! de! ressourcement!à!Bordeaux.! ! & & 1! ! ! Glossaire& ! ADN! Acide!DésoxyriboNucléique! Pr! Nombre!de!Prandlt! BNC! Bayonet!Neill`Concelman! PSM! Poste!de!Sécurité!Microbiologique! BSA! Bovine!Serum!Albumin! Re! Nombre!de!Reynolds! CD! Cluster!of!Differentiation! SDS! Sodium!DodécylSulfate! CMS! Composant!Monté!en!Surface! SVF! Sérum!de!Veau!Fœtal! Cp! Capacité!thermique!massique! η! Viscosité!dynamique! CTC! Cellules!Tumoral!Circulantes! θ! Angle!de!contact! CTE! Coefficient!Thermique!d'Expansion! μ! Perméabilité!magnétique!relative! r D! Coefficient!de!diffusion! χ! Susceptibilité!magnétique! D ! Diamètre!hydraulique! h DLD! Deterministic!Lateral!Displacement! ! ! DLS! Dynamic!Light!Scattering! ! ! DMSO! Dymethysulfoxyde! ! ! DRX! Diffraction!Rayon!X! ! ! EDC! 1`ethyl`3`(3`dimethylaminopropyl)!cabodiimide! ! ! EDTA! Acide!Ethylène!Diamine!Tétraacétique! ! ! ELISA! Enzyme!Linked!Immuno!Sorbent!Assay! ! ! EMCCD! Electron!Multiplying!Charge!Coupled!Device! ! ! FACS! Fluorescence!Activated!Cell!Sorter! ! ! Fc! Fragment!Cristallisable! ! ! FFC! Flat!Flexible!Cable! ! ! FITC! Fluorescein!Isothiocyanate! ! ! HEPA! Haute!Efficacité!pour!les!Particules!de!l'Air! ! ! IRM! Imagerie!par!Résonance!Magnétique! ! ! k! Conductivité!thermique! ! ! ! ! k ! Constante!de!Boltzman! B LOC! Lab!On!Chip! ! ! MEB! Microscope!Electronique!à!Balayage! ! ! MEMS! MicroElectroMechanical!Systems! ! ! MES! 2`(N`Morpholino)ethanesulfonic!acid!! ! ! Nu! Nombre!de!Nusselt! ! ! PBS! Phsophate!Buffered!Saline! ! ! PCB! Printed!Circuit!Board! ! ! PDMS! PolyDiMéthylSiloxane! ! ! Pe! Nombre!de!Peclet! ! ! PEB! Post!Exposure!Bake! ! ! PET! PolyEthylène!Téréphtalate! ! ! PGMEA! Propylène!Glycol!Monoethyl!Ether!Acetate! ! ! Po! Nombre!de!Poiseuille! ! ! POC! Point!Of!Care! ! ! ! ! ! ! 2! !