MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA SUPLEMENTAÇÃO DE VITAMINA C E EFEITO DA SALINIDADE EM TILÁPIAS DO NILO: DESEMPENHO E EXPRESSÃO GÊNICA CAIO ALEXANDRE SANTOS CAXICO VIEIRA SÃO CRISTÓVÃO – SE 2016 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA Suplementação de vitamina C e efeito da salinidade em tilápias do Nilo: Desempenho e expressão gênica CAIO ALEXANDRE SANTOS CAXICO VIEIRA Dissertação de mestrado apresentada ao programa de Pós graduação em Zootecnia da Universidade Federal de Sergipe como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Zootecnia. Orientador: Prof. Dr. Jodnes Sobreira Vieira Co-Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Del Vesco SÃO CRISTÓVÃO – SE 2016 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE Vieira, Caio Alexandre Santos Caxico V658s Suplementação de vitamina C e efeito da salinidade em Tilápias do Nilo : desempenho e expressão gênica / Caio Alexandre Santos Caxico Vieira ; orientador Jodnes Sobreira Vieira. – São Cristóvão, 2016. 53 f. : il. Dissertação (mestrado em Zootecnia) – Universidade Federal de Sergipe, 2016. O 1. Zootecnia. 2. Piscicultura. 3. Ácido ascórbico. 4. Anti- oxidante. 5. Osmorregulação. 6. Radicais livres. I. Vieira, Jodnes Sobreira, orient. II. Título CDU 639.3.043 Agradecimentos Durante todo este período que cursei o mestrado tenho muito a agradecer a todos aqueles que de alguma forma deram a sua contribuição. Aos meus pais, Maria José e Dalmo Henrique e a minha irmã Lara, pelo incentivo de sempre. A minha querida esposa Jeamylle, por todo esse tempo ao meu lado. Ao Salim, companheiro de todas as horas. Ao orientador Prof. Jodnes Sobreira Vieira, pela oportunidade e desafios lançados. À co-orientadora Profª Ana Paula Del Vesco pela sua participação fundamental sendo disponível sempre que necessitei. . À equipe do LANOAA, em especial a Jeffersson Cartaxo, Geneane Santana, Edinete Oliveira, Mayara Santos, Doroth Miranda e Érika Dórea. À colega Marisa Bastos pela ajuda com a coleta e análises das amostras. Aos amigos Adriano Morais e Daniel Masato pela parceria de sempre. Aos professores do PROZOOTEC, pelos ensinamentos e convivência. Aos colegas do PROZOOTEC, Adriano Silva, José Washington, Anailton Carlos pela convivência dentro e fora das salas de aula. À coordenação do PROZOOTEC, Prof. Gladston Arruda e Prof. Jailson Fagundes e. ao secretário pela Luiz Carlos organização e responsabilidade para com o programa PROZOOTEC. Aos Professores Hunaldo Oliveira, Sidney Tavares e Roberto Schwarz pelas contribuições na banca de Qualificação e Defesa. À professora da UEM Eliane Gasparino pela disponibilização dos Primers. À CAPES pela concessão da bolsa A todos que fazem a Universidade Federal de Sergipe. . SUMÁRIO PÁGINA RESUMO.............................................................................................................................. I ABSTRACT......................................................................................................................... II 1. Introdução Geral.............................................................................................................. 01 2. Referencial teórico .......................................................................................................... 03 2.1 Cultivo de Tilápia em salinidade .................................................................................. 03 2.2 Radicais livres e estresse oxidativo............................................................................... 04 2.4 Sistema de defesa antioxidantes.................................................................................... 05 2.5 Salinidade e estresse oxidativo...................................................................................... 07 3.Referências bibliográficas................................................................................................ 09 Artigo Científico: Suplementação de vitamina C e efeito da salinidade em tilápias do Nilo: Desempenho e expressão gênica Artigo.................................................................................................................................. 13 Resumo................................................................................................................................ 15 1. Introdução....................................................................................................................... 16 2. Material e Métodos ........................................................................................................ 19 3. Resultados ...................................................................................................................... 24 4. Discussão ....................................................................................................................... 26 5. Conclusão. ...................................................................................................................... 29 6. Referências bibliográficas .............................................................................................. 30 Anexos................................................................................................................................ 33 1. Normas da revista Aquaculture...................................................................................... 33 2. Sistema experimental de recirculação............................................................................ 46 LISTA DE TABELAS PÁGINA TABELA 1. Composição nutricional da ração basal utilizada para alimentação das tilápia.............................................................................................................................. 18 TABELA 2. Primers utilizados nas reações de amplificação pelo método qRT- PCR................................................................................................................................. 21 TABELA 3. Valores médios dos Parâmetros físico-químicos da água do cultivo experimental de Tilápias do Nilo submetidas a diferentes salinidades e alimentadas com diferentes concentrações de vitamina C em14 dias de experimento................................22 TABELA 4. Valores médios de Ganho de peso e sobrevivência de Tilápias do Nilo submetidas a diferentes salinidades e alimentadas com diferentes concentrações de vitamina C em14 dias de experimento........................................................................... 23 LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1. Efeito da salinidade e suplementação de vitamina C sobre a expressão do gene HSP70 (Heat Schok Protein 70) no fígado de O. niloticus no período de 24 horas e no período de 14 dias.......................................................................................................23 FIGURA 2. Efeito da salinidade e suplementação de vitamina C sobre a expressão do gene CAT (Catalase) no fígado de O. niloticus no período de 24 horas e no período de 14 dias..................................................................................................................................24 FIGURA 3. Efeito da salinidade e suplementação de vitamina C sobre a expressão do gene GSR (Glutationa Redutase) no fígado de O. niloticus no período de 24 horas e no período de 14 dias.............................................................................................................25 FIGURA 4. Efeito da salinidade e suplementação de vitamina C sobre a expressão do gene GPX (Glutationa Peroxidase) no fígado de O. niloticus no período de 24 horas e no período de 14 dias............................................................................................................25 FIGURA 5. Efeito da salinidade e suplementação de vitamina C sobre a expressão do gene GSR (Glutationa Redutase) no fígado de O. niloticus no período de 24 horas e no período de 14 dias.............................................................................................................26 FIGURA 6. Comparação ente médias de expressão de mRNA de CAT, HSP, GPX, GSRR e GSS entre os períodos de 24 horas e 21 dias no fígado de O. nilóticus submetidas a diferentes salinidas e sulplementação de vitamina C na dieta...........................................26 RESUMO VIEIRA, Caio A.S.C. Suplementação de vitamina C e efeito da salinidade em Tilápias do Nilo: Desempenho e expressão gênica.Sergipe: UFS, 2016. 45p. (Dissertação - Mestrado em Zootecnia) Em organismos aquáticos, mudanças de salinidade na água provocam uma variedade de respostas fisiológicas, assim, este estudo objetivou avaliar o efeito da salinidade da água sobre o ganho de peso, a sobrevivência e a expressão dos genes Catalase (CAT), Glutatona Redutase (GSR), Glutationa Sintetase (GSS), Glutationa peroxidase (GPX) e o da proteína de choque térmico (HSP70) no fígado de Tilápias do Nilo (Oreocrhomis niloticus). Para a condução do experimento foram utilizadas 160 tilápias com peso médio 20,8 g (± 4,02). O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado (DIC) compostos por quatro tratamentos e quatro repetições, sendo: T1 = Tratamento 1 (salinidade 0 + dieta basal); T2= Tratamento 2 (salinidade 7 + dieta basal); T3= Tratamento 3 (salinidade 21 + dieta basal ); T4 = tratamento 4 (salinidade 21 + dieta com 1500 mg de vitamina C/ kg de ração). Os parâmetros de qualidade de água foram monitorados diariamente e se mantiveram dentro da faixa de conforto para a espécie. Para as análises de expressão gênica foram coletadas amostras do fígado de tilápias em dois períodos distintos, 24 horas e 14 dias após o início do experimento. A quantificação da expressão gênica foi realizada por qRT-PCR. Houve efeito significativo dos tratamentos sobre o ganho de peso, tilápias do tratamento 1 (4,10g) e tratamento 2 (6,42 g) obtiveram os maiores ganhos de peso. Animais do tratamento 4 (salinidade 21 + acréscimo de vitamina C na ração) tiveram maior ganho de peso que os animais do tratamento 3 (salinidade 21 + dieta basal). Maior sobrevivência foi observada no tratamento 2 seguido pelo controle. HSP 70 e GSS foram mais expressos no período de 24 h e GSR sendo mais expressa no período de 14 dias, enquanto que CAT e GPX não diferiram de um período para o outro. A variação de salinidade teve efeito sob a expressão dos genes avaliados no fígado de O.niloticus com exceção da catalase para o período de 24 horas. Após 14 dias de avaliação animais criados em salinidade 21 e alimentados com suplementação de vitamina C apresentaram maior expressão de GPX, GSR e GSS, sugerindo que animais criados nesse nível de salinidade, tiveram maior necessidade de ação do sistema glutationa, e que a suplementação de vitamina C nessas condições permitiu maior expressão desses genes. Conclui-se que a salinidade apresentou efeito sobre a expressão dos genes do sistema de defesa antioxidantes avaliados, os quais variaram bastante no período de 24 horas e apresentaram um padrão mais definido no período de 14 dias. A suplementação de vitamina C contribuiu em partes, para melhor desenvolvimento das tilápias criadas em salinidade 21, o que pode ser observado, pelos resultados de ganho de peso e expressão gênica. Palavras-chave: Ácido Ascórbico; Antioxidante; Osmorregulação, Piscicultura, Radicais Livres; I ABSTRACT VIEIRA, Caio A.S.C. Vitamin C supplementation and salinity effect in Nile Tilapia: Performance and gene expression. Sergipe: UFS, 2016. 45p. (Dissertation - Master in Zootecnia) In aquatic organisms, changes in salinity in water provoke a variety of physiological responses, so this study aimed to evaluate the effect of water salinity on weight gain, survival and expression of the genes Catalase (CAT), Glutathione Reductase (GSR), Glutathione Synthase (GSS), Glutaione peroxidase (GPX), and heat shock protein (HSP70) in the liver of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). For the conduction of the experiment, 160 tilapias with a mean weight of 20.8 g (± 4.02) were used. The experiment was conducted in a completely randomized design (DIC) composed of four treatments and four replicates, being: T1 = Treatment 1 (salinity 0 + basal diet); T2 = Treatment 2 (salinity 7 + basal diet); T3 = Treatment 3 (salinity 21 + basal diet); T4 = treatment 4 (salinity 21 + diet with 1500 mg of vitamin C / kg of feed). The parameters of water quality were monitored daily and were kept within the range of comfort for the species. For the analysis of gene expression samples of liver of tilapia were collected in two distinct periods, 24 hours and 14 days after the beginning of the experiment. Gene expression quantification was performed by qRT-PCR. There was a significant effect of the treatments on weight gain, treatment 1 (4.10 g) and treatment 2 (6.42 g) had the highest weight improve. Animals from T4 had greater weight gain than animals from T3. Higher survival was observed in treatment 2 followed by control (T1). HSP 70 and GSS were more expressed in the 24 h period and GSRR was more expressed in the 14 day period, whereas CAT and GPX did not differ from one period to the other (P <0.05). The salinity variation had an effect under the expression of the genes evaluated in the liver of O. niloticus with the exception of catalase for the 24 hour period. After 14 days of evaluation, animals raised in salinity 21 and fed with vitamin C supplementation presented greater expression of GPX, GSR and GSS, suggesting that animals raised at this level of salinity had greater need of action of glutathione system, and that the supplementation of vitamin C under these conditions allowed greater expression of these genes. It was concluded that salinity had an effect on the expression of the antioxidant defense system genes evaluated, which varied considerably over the 24-hour period and presented a more defined pattern in the 14-day period. Supplementation of vitamin C contributed, in parts, for better development of tilapia created in salinity 21, which can be observed, through the results of weight gain and gene expression. Keywords: Ascorbic acid; Antioxidant, Osmoregulation, Fishculture, Free Radicals. II