UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE – FURG PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS – FISIOLOGIA ANIMAL COMPARADA DESACOPLAMENTO MITOCONDRIAL E ESTRESSE OXIDATIVO EM ESPERMATOZOIDES SUÍNOS RESFRIADOS ESTELA FERNANDES E SILVA Orientadora: Prof. Dra. Carine Dahl Corcini Co orientadora: Prof. Dra. Francieli Moro Stefanello Rio Grande, Março 2014 DESACOPLAMENTO MITOCONDRIAL E ESTRESSE OXIDATIVO EM ESPERMATOZOIDES SUÍNOS RESFRIADOS ESTELA FERNANDES E SILVA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, Fisiologia Animal Comparada da Universidade Federal do Rio Grande, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre. Orientadora: Prof. Dra. Carine Dahl Corcini Co orientadora: Prof. Dra. Francieli Moro Stefanello Rio Grande, Março 2014 2 AGRADECIMENTOS A Deus por me manter firme e me auxiliar em cada momento da realização deste trabalho e em todos os outros momentos da vida. Aos meus pais Volnei e Luisa por toda a dedicação e carinho, por terem ajudado em todos os momentos. A minha irmã Paula por ter sido crucial para o desenvolvimento dessa pesquisa ajudando desde a confecção de reagentes até a formatação do trabalho. A minha grande amiga Tainã o meu muito obrigada por ajudar em todos os momentos sem exceção, se dedicando como se fosse seu próprio trabalho e por me ensinar a ser mais perseverante e confiante. A minha orientadora Carine por todo o apoio, paciência, ensinamentos que tenho certeza me conduzirão por um caminho de sucesso pessoal e profissional. Ao professor Antonio Sergio muito obrigada por tudo, mas principalmente por tornar possível as análises do citômetro sacrificando suas férias de inverno. A minha co orientadora Francieli que desde a graduação é um exemplo de profissional e que não mede esforços para me auxiliar. A amiga Pathise, muito obrigada pelo auxílio nas análises bioquímicas, pela boa vontade e simpatia. Aos meus avós: Ignácio, Maria e Jozephina, por todas as lições de vida e pela confiança a mim investida e orações. Ao Amilton Seixas pelo auxílio com a utilização da centrífuga. Ao meu Tio Sergio pelo auxílio nas questões técnicas de armazenamento de amostras. A Dra Ligia pelo empréstimo da centrífuga. A minha madrinha Eulália por conseguir mudar um pouco minha maneira de pensar e me fez ser menos desesperada. A minha prima Juliana por todo o auxílio nos cálculos de molaridade, por me acompanhar na utilização de alguns equipamentos e pelas palavras de apoio nos momentos de desespero. A Daiane pelo apoio e orações que foram reconfortantes 3 A minha amiga Karine que apesar da distância continua sendo uma pessoa especial que contagia com sua calma e bom humor. Ao meu ex colega e amigo Gustavo pela sua boa vontade no auxílio na utilização dos equipamentos na Biotecnologia. Aos pesquisadores Ana Kalb e Josencler por todo auxílio em questões técnicas sempre com muito boa vontade. A minha amiga Thais Figueiredo pelo auxílio incansável nas análises bioquímicas, pela alegria contagiante que diminuiu meu pessimismo. A minha amiga Stela Gheller por estar sempre disposta a ajudar e ser uma pessoa tão querida com todos. Aos estagiários e colegas de pós-graduação do grupo de Reprodução Animal Comparada da FURG em especial a estagiária Clarissa Freitas que tem muita disposição e alegria em ajudar. Ao professor Marcelo Alves Vargas pela orientação no estágio de docência que foi desafiador e contribuiu fundamentalmente para meu crescimento pessoal e profissional. Aos professores do grupo de Núcleo de Pesquisa, Ensino e Extensão em Reprodução Animal da Faculdade de veterinária da UFPel por cederem o espaço permitirem a utilização do citômetro de fluxo. Aos professores do programa de pós graduação em ciências fisiológicas que transmitiram valiosos ensinamentos. A Associação de Criadores de Suínos do Estado do Rio Grande do Sul pelo envio das doses de sêmen. Agradeço às técnicas do laboratório de histologia da FURG por auxiliarem na obtenção dos materiais de consumo para o desenvolvimento dessa pesquisa. Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul pela concessão da bolsa de estudos. 4 Sumário Resumo Geral ................................................................................................................... 7 Introdução Geral ............................................................................................................... 8 Papéis fisiológicos das espécies reativas e o estresse oxidativo ................................... 8 Desacoplamento mitocondrial como estratégia para diminuição do estresse oxidativo: Um fenômeno fisiológico ............................................................................................. 9 O desacoplamento mitocondrial induzido quimicamente pelo 2,4 dinitrofenol ......... 12 O DNP como um poluente e seus possíveis efeitos nocivos ...................................... 15 A redução da temperatura e a manutenção dos espermatozoides ............................... 16 O uso de diluentes para o resfriamento de sêmen suíno ............................................. 18 O resfriamento e o estresse oxidativo em espermatozoides........................................ 18 Espermatozoides suínos e a sensibilidade ao estresse oxidativo ................................ 19 As defesas antioxidantes nos espermatozoides ........................................................... 20 A espécie suína e suas múltiplas importâncias: Modelo experimental, Xenotransplantação e Produção .................................................................................. 21 2,4 dinitrofenol e os espermatozoides suínos ............................................................. 22 Objetivos ......................................................................................................................... 24 Objetivo geral ............................................................................................................. 24 Objetivos específicos .................................................................................................. 24 ARTIGO ......................................................................................................................... 25 (Submetido para a revista Cryobiology) ......................................................................... 25 2,4 dinitrophenol during cooling of boar semen ......................................................... 26 Abstract ....................................................................................................................... 26 1. Introduction ............................................................................................................. 27 2. Methodology ........................................................................................................... 29 3. Results ..................................................................................................................... 33 5 4. Discussion ............................................................................................................... 39 5. Conclusion .............................................................................................................. 42 6. References ............................................................................................................... 42 Considerações finais ....................................................................................................... 45 Referências Gerais .......................................................................................................... 47 6 Resumo Geral A espécie suína (Sus scropha domesticus) possui relevância nos âmbitos da pesquisa, da xenotransplantação e da produção de carnes. O resfriamento de sêmen é capaz de reduzir o metabolismo celular e possibilitar o armazenamento dos gametas, sendo auxiliar durante práticas de reprodução assistida. Contudo, os espermatozoides suínos são sensíveis ao estresse oxidativo gerado durante o processo de resfriamento. O 2,4 dinitrofenol (DNP) poderia gerar o desacoplamento mitocondrial reduzindo o estresse oxidativo e prolongando indiretamente a viabilidade e capacidade fertilizante de espermatozoides suínos resfriados pela diminuição de espécies reativas de oxigênio. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do desacoplamento mitocondrial induzido pelo DNP e os efeitos desse desacoplamento sobre as de fluidez e integridade de membrana plasmática, funcionalidade de mitocôndria, motilidade espermática, além dos parâmetros de estresse oxidativo de lipoperoxidação e produção de espécies reativas de oxigênio, durante o resfriamento a 17 °C de 24 até 96 horas. Utilizou-se 22 ejaculados expostos ao diluente Betsville Thawing Solution (BTS) (controle) e ao mesmo diluente acrescido das concentrações de 0,01 µM (T1); 0,1 µM (T2); 1,0 µM (T3) e 10 µM (T4) de DNP. Através do teste de Shapiro-Wilk as variáveis que não apresentaram normalidade, tiveram suas médias comparadas pelo teste de Kruskal- Wallis. As análises estatísticas demonstraram que o DNP não se diferiu do controle independente do tempo de armazenamento, para nenhuma das variáveis analisadas. Possivelmente, a falta de ação sobre as mitocôndrias, ou seja, a não promoção do desacoplamento mitocondrial foi o motivo principal para a falta dos efeitos do DNP. Acredita-se que a utilização do DNP em temperaturas mais elevadas por estas promoverem aumento da fluidez de membrana e/ou o aumento das concentrações de DNP poderiam gerar efeitos significativos sobre as mitocôndrias e demais variáveis analisadas. Finalmente, o DNP nas concentrações testadas não se diferiu do controle em todas as variáveis analisadas independente do tempo de armazenamento. 7 Introdução Geral Papéis fisiológicos das espécies reativas e o estresse oxidativo A produção de energia na forma de adenosina tri fosfato (ATP) na mitocôndria necessita do O como aceptor de elétrons, sendo este reduzido e a água formada. Em 2 uma célula saudável, parte do O é convertido em intermediários reativos, conhecidos 2 como espécies reativas de oxigênio, ao invés de converter-se em água (Fig. 1). Dentre as ERO tem-se o ânion superóxido (O -•), peróxido de hidrogênio (H O ), radical 2 2 2 hidroxil (•OH) e peroxinitrito (ONOO-). Tanto o O -• quanto o H O são formados como 2 2 2 subprodutos da conversão de O , mas o radical hidroxil é formado a partir da interação 2 entre o H O e íons metálicos como o ferro (RHOADES e PFLANZER, 1996) e o 2 2 peroxinitrito surge da interação entre óxido nítrico (NO) e O (MORAN et al., 2008). 2 Algumas dessas ERO anteriormente mencionadas podem ser vistas na Fig.1. As ERO podem danificar ácidos nucléicos, lipídios, proteínas, carboidratos ou qualquer outra molécula próxima, podendo ser consideradas agentes oxidantes (AQARWAL et al., 2005). Sua geração é um pré-requisito essencial para a função normal das células, no entanto, a formação excessiva pode ocasionar o estresse oxidativo e conduzir ao dano celular e patologia assoiciada (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007). Dentre os papéis fisiológicos das ERO para os espermatozoides, tem-se a necessidade dessas para a hiperativação, capacitação, reação acrossômica e eventos de ligação à zona pelúcida (KODAMA et al., 1996; DE LAMIRANDE et al., 1997; HERRERO et al., 2003). Essas espécies contribuem também para a formação normal dos espermatozoides no que diz respeito à condensação da cromatina, a remodelação da membrana e a ativação de vias de sinalização intracelular (KODAMA et al., 1996; PONS-REJRAJI et al., 2009). Quando há um equilíbrio entre defesas antioxidantes e ERO, os antioxidantes convertem as ERO em subprodutos seguros para evitar danos. Todavia, quando há desequilíbrio entre a produção de ERO e a detoxificação, pode ocorrer o “estresse oxidativo” que provoca efeitos prejudiciais ao gameta. Dentre os danos ocasionados 8 sobre os espermatozoides, tem-se alteração da membrana plasmática (FORD, 2004), danos à integridade do DNA (BAUMBER et al., 2003), bloqueio do metabolismo oxidativo (MAKKER et al., 2009), redução da fusão com o oócito (GRIVEAU e Le LANNOU, 1997) e da motilidade e viabilidade dos espermatozoides e a peroxidação lipídica (BUCAK et al., 2007). Figura 1: Geração de espécies reativas de oxigênio na mitocôndria. Em 1 tem-se a formação de água, pela redução completa do oxigênio. Em 2 tem-se a redução incompleta do oxigênio gerando espécies reativas de oxigênio. Adaptada dos sites (http://2.bp.blogspot.com/- 82kl4sUiK8/T7r2axWeX9I/AAAAAAAAAAw/Niz99U1BhtY/s1600/cadeia+respirat%C3%B3ria.jpg e http://www.scielo.br/img/revistas/qn/v30n1/32e01.gif) Desacoplamento mitocondrial como estratégia para diminuição do estresse oxidativo: Um fenômeno fisiológico O desacoplamento mitocondrial consiste na dissipação do gradiente de prótons formado no espaço intermembranas, pela geração de uma permeabilidade na membrana mitocondrial interna aos íons hidrogênio. Assim, ocorre o desacoplamento entre transporte de elétrons e a síntese de ATP (Fig. 2). Os reflexos celulares do 9 desacoplamento mitocondrial são basicamente uma menor geração de ATP, bem como uma aceleração da cadeia transportadora de elétrons (CTE), a fim de retomar o gradiente de prótons previamente dissipado (SPEKMAN et al., 2004). Nesse âmbito, o desacoplamento leve e a consequente aceleração da CTE seriam responsáveis pela regulação da produção de ERO mitocondrial, por diminuir a probabilidade de redução incompleta do O . 2 Fisiologicamente, esse fenômeno seria causado por proteínas desacopladoras mitocondriais (UCPs). A UCP1, UCP2, UCP3, UCP4 e UCP5 são membros da família de proteínas carreadoras de íons, que tornam a membrana mitocondrial interna permeável aos íons hidrogênio (BARBIERI et al., 2011) (Fig. 2). Enquanto UCP1 está presente no tecido adiposo marrom e envolvida na termogênese (RICQUIER e BOUILLAUD, 2000), outras UCPs, como a UCP2 (FLEURY et al., 1997), não estão totalmente compreendidas (ARSENIJEVIC et al., 2000). Sabe-se que a UCP2 também realiza o vazamento de prótons e reduz produção de ATP (KRAUSS et al., 2002), e tal atividade é regulada positivamente pelo ânion superóxido (ECHTAY et al., 2002). Desse modo, a função fisiológica dessa proteína pode ser a de reduzir a produção mitocondrial de ERO (ARSENIJEVIC et al., 2000; NEGRE-SALVAYRE et al., 1997) e proteger as células contra o dano oxidativo. Nesse contexto, a super expressão da UCP2 humana em ratos demonstrou a redução de danos cerebrais após o acidente vascular cerebral experimental e traumatismo crânio-encefálico (MATTIASSON et al., 2003), sugerindo a atuação em nível mitocondrial na proteção contra os danos oxidativos. Alguns estudos sugerem que a ativação de UCP2 e UCP3 por ERO gera um leve desacoplamento para evitar o estresse oxidativo (ECHTAY et al., 2002; BRAND et al., 2004). Nesse âmbito, camundongos knockout para genes de algumas UCPs apresentaram níveis elevados de ERO e aumento do dano oxidativo (ARSENIJEVIC et al., 2000; BRAND et al., 2002). Dessa forma, a redução da geração de ERO pode ter reflexos na longevidade de diversas espécies, sendo que a expressão de UCPs exógenas é capaz de prolongar o tempo de vida de moscas adultas (FRIDELL et al., 2004; FRIDELL et al., 2009) e camundongos knockout para genes das UCPs apresentam alterações na expectativa de vida vivendo cerca de 10 meses menos que o tipo selvagem, (ANDREWS et al., 2009). Além disso, alguns estudos tem indicam um papel 10