Universidad Complutense de Madrid Facultad de Farmacia. Deleción en la región cromosómica humana 12q14-15 por integración del ADN del virus del papiloma. Tesis doctoral Marta Inés Gallego Sanz Mayo 1996 Memoria presentada por la licenciada MARTA NES GALLEGO SANZ para optar al grado de Doctor enFarmacia. Esta tesis Doctoral ha estado realizada bajo la dirección del Dr. PedroA. Lazo- Zbikowski Taracena en laUnidad de Genética Molecular (C.S.1.Cj, Centro Nacional de Biología Celulary Retrovirus, Instituto de Salud Carlos III. 2 A~t PEDRO A LAZO-ZBIIOWSKI TARACENA ¿CV jós.úL $ MÁ~ 5 GALlEGO SANZ Mayo 1996 MADRID 1 A mi familia A Rodolfo Amis compañeros fi AGRADECIMIENTOS Considero que realizar una empresa en soledad es un ejercicio agotadorque no compensa nunca el esfuerzo invertido, por esta razón me alegrode no haber andado este camino sola, en ese caso, estoy segura, de que no habría llegado nunca aeste punto. En la realización de esta tesishan colaborado muchas personas y es para mi un placer, largo esperado, el poder mencionar a las personas que me han ayudado y me han acompañado durante estos años de trabajo. En primer lugar quiero expresar mi agradecimiento al Dr. Pedro Lazo, director de esta tesis doctoral, por haberme elegido para formar parte de su grupo de investigación, por haberse preocupado de mi financiación durantetodos estos años, y sobretodopor haber sabido dar proyeccióninternacional a nuestro trabajo. Me gustaría agradecer, también, a la Dra. Sara Ballester el haberme enseñado lastécnicas básicas debiologia moleculardurantelos primerosmeses detrabajo enel laboratono. A la Dra. Isabel Olivares por la ayuda que me prestó para salir de un bache en la producción de la genoteca de la línea celular SW756, de no ser por ella puede que aún estuviera atascadaen esepunto. A RodolfoMurillas por su apoyo informático, por haberme motivado científicamentey por haberme ayudado adesarrollaruna lectura críticade las publicacionescientificas. A Conchita Llaguno, a quien he tenido el placer de conocer durante estos últimos años, pues es para mi un ejemplo a seguir por su nobleza de espíritu, su entrega en el trabajo y su pensamiento libre. Al Dr Eugenio Santos y al Prof Van de Ven, el haberme pennitido realizar sendas estanciasbreves ensus respectivoslaboratorios. Al personal administrativoy demantenimiento del CNBCRpor su amabilidady eficiencia, También quiero mencionar las personas con las que he convivido a lo largo de estos años de trabajo en el Instituto de Salud Carlos III, pues me han ayudado en innumerables ocasiones y a su lado me he sentido como en casa, estas personas son mis compañeros: Elena Feduchi, María Eugenia Gonzáez, Florencio Varas, Susana García, Fernando Velez, Javier Hernandez, Beatriz Gil, Edurne Orúe, Susana López, Laura Gil, Luis García, Gloria de Ojeda, Pilar Portolés, Beatriz Dorado y Elena Femandez, Quiero destacar en estas lineas el excelente trabajo de Angel del Pozo, que ha realizado todaslas copiasy composicionesfotográficasque sepresentanen estatesisdoctoral. iii ABREVIATURAS ADN Ácido desoxirribonucleico ADNasa Ácido-desoxírribonucleasa ADNc ADN complementario(o copia) ARN Aido ribonucleico ARNasa Ácidoribonucleasa ARNm ARN mensajero BSA Seroalbúminabobina cmp Cuentas porminuto dATP Desoxiadenosintrifosfato dCTP Deaoxicitidin trifosfato DEPC Dietilpirocarbonato DM50 Dimetil sulfóxido dNTP Desoxinucleásido trifosfato DTT Ditiotreitol EDTA Acido Etinendiamitetrancético Fig. Figura g Gravedad IPTG Isopropil-173-D-tiogaactopiranósido kb Kilobases LCR (Long control region). Granregión de control M Molar mM Milimolar MOPS Acido 3-(N-morfolino) propanosulfónico pb Pares de bases PCR Reacción en cadenade lapolimerasa PEG Polietilénglicol pmol Picomol iv r.p.m. Revoluciones porminuto SDS Lauril sulfato sádico o dodecilsulfatosádico 5V40 Virus de simio40 Tris Tris(hidroximetil)aminometano U Unidades internacionales de actividadenzimática U.1 Unidadesinternacionales Unidades formadoras deplaca URR (Up-stream regulatory region). Región reguladora anterior VI-IB Virus de lahepatitisB VPH Virus del papilomahumano X-Gal 5-Bromo-4-Cloro-3-indolil-~-D-galactopiranósido. Nt ÍNDICE 1.— INTRODUCCIÓN 1 1.1- CONCEPTO DE CANCER 2 1.la¡- Oncogenes y genessupresores detumores 4 1.2-EL VIRUS DEL PAPILOMAHUMANO 5 1.2*- Biología de los virus del papiloma 7 l.2b- Losgenes virales 11 í.2c- Integración del ADN del VPH en el genoma humano 14 1.3- REGIÓN CROMOSÓMICA 12q13-15 16 1.4-LALINEACELULAR SW756 19 1.5- OBJETIVOS 20 2.- MÉTODOS 21 2.1- CULTIVOS CELULARES 22 2.2- EXTRACCIÓN DE ADNDE ALTOPESO MOLECULARDE CÉLULAS EN CULTIVO 22 2.3- OBTENCIÓN DE ARN DE CÉLULAS EN CULTIVO 23 2.3a- Extracción deARN por el reactivo de TRlzol® 23 2.3b- Extracción deARN con tiocianato de guanidinio y purificación 23 por centrifugación en solución de CsCI 2.4- ANALISIS DE ADN GENÓMICOPOR LA TECNICADE SOUTHIERN 24 2.4a- Electroforesis deADN genómicocucariótico digerido 24 2.4b-Transferencia y fijación delADNdel gel ala membranade nylon 24 2.4c- Prehibridación e hibridación del“Southern” 24 2.4d- Marcajedela sonda radiactiva porel método delADNcebador aleatorio 25 2.4e- Lavados enel análisis de “Southeni” 25 2.5- ANALISIS DEL ARNm PORLATÉCNICADE “NORTHERN” 25 2.5a-ElectroforesisdeARN en gelesdeagarosa conteniendo formaidehido 25 2.51- Transferenciayfijación delARNa 1* membrana. 26 2.5c- Prehibridacióne hibridación en elanálisis de“Northern” 26 vi LSd- Lavados en elanálisis de“Northern” 26 2.6- PREPARACIÓN, AGRAN ESCALA, DE ADN DE BACTERIÓFAGO LAMBDA 26 2.6a- Infección a bajamultiplicidad. 26 2.6b-Purificación del bacteriófago lambda. 27 2.6c-Extracción de ADN del bacteriófago lambda. 27 2.7- PREPARACIÓN DE UNA GENOTECA EN BACTERIÓFAGO LAMBDA DASH II 28 2.7a-Digestión delbacteriófago con la endonucleasa derestricción EcoRI 28 2.7b- Purificaciónde los brazos delambda porcentrifugación en gradiente desacarosa. 28 2.7c- Purificación deuna fracción delA.DN de SW756digerido con EcoR 1 quecomprendelos fragmentosdetamaños de 10 a 15kb. 29 2.7d- Ligación delADN genómicoa los “brazos” deX DashII 29 2.7e- Empaquetamientoiii vifrv’delADN en panículasde fago 29 2.71- Preparación de las bacterias hospedadoras delos bacteriófagos recombinantes 30 2.7g- Titulación de la genoteca 30 2.8-SCREENING DE LAGENOTECA 30 2.8*- Extensión dela genoteca en placas deLB/agar 30 LSb- Transferencia del ADN del fagoa las membranas de nitrocelulosa 31 2.8c- Prehibridacióne hibridaciónde las membranas 31 2,8d- Lavados de lasmembranas 31 2.9- MINIPREPARACIONES DE ADN DEBACTERIOFAGOLAMBDA 32 2.10-MAPA DE RESTRICCIÓNDELOS CLONES DELAMBDA 33 2.lOa- Digestiones parciales de losclones de lambda 33 2.101- Electroforesis de las digestiones parcialesytransferenciaa la membrana 33 2.lOc- Marcaje radiactivo del oligonucleótido 34 2.10d- Hibridación con oligonucleótiodosy lavados 34 2.11 SUBCLONACIÓNDE FRAGMENTOS DERESTRICCIÓN 34 - vi’ 2.1la- Digestión deADNcon endonucleasas derestricción 35 2.1ib- Aislamiento delosfragmentosde restricción 35 2.1k- Ligacióndel insertoalvector plasnildico 35 2.1íd- Puesta en competencia de las bacterias 35 2.11e- Transformación 35 2.11f- Minipreparacionesde plísmidos 36 2.12- SECUENCIACIÓN 36 2.13-BÚSQUEDA ENGENOTECAS DE CÓSMIDOS YYACS PORMEDIO DE LA TECNKADE LAREACCIÓNENCADENADE LA POLLIMERASA (PCR) 36 2.14MAPAS DE CÓSMIDOS 38 2.15-AMPLIFICACIÓNPORPCRDE LOS EXTREMOS3’ DE ADNc 38 2.15a- Síntesisde ADNca partirde ARNtotal 38 2.151 Amplificación del ADNc 38 2.15c- Clonación defragmentos amplificados por PCRusando el sistema CloneAmp® 40 2.16-LINEAS CELULARES 41 2.17- CEPAS BACTERIANAS 41 2.18-VECTORES 41 2.19- SOLUCIONES DE USO GENERALEN BIOLOGIAMOLECULAR 41 2.20-MATERIAL INFORMATICO 42 3.-RESULTADOS 43 3.1 CLONACIÓNDELLOCUSDE INTEGRACIÓNENEL GENOMADE LAS - CÉLULAS SW756. 44 3.ia- Caracterización delassecuencias viralesintegradas en SW7SÓ 44 3.11 Expresión delos genes virales 46 3.lc- Elección de la endonucleasa de restricción empleada en la construcción dela genoteca 48 3.Id- Preparación deuna genotecagenómica dela línea celular SW’756 49 3.1e-Screeningen la genoteca genómica dela línea celularSW756 51 3.2- CARACTERIZACIÓN DEL CLON X12QHP 52 viii 3.21 Secuenciación delas zonas de recombinación entreel ADNviraly el celular 57 3.2c-Las sondas celularesflanqueantes al sitiode integración reconocen regionescromosómicas distintas 59 3.3-CLONACION DELALELO NOOCUPADO CORRESPONDIENTE AL LOCUS DEINTEGRACIÓNVIRAL 61 3.3a-donación del alelono ocupado correspondiente alpunto de recombinación S 61 Análisisde lagenotecagenómicacon la sondaS3 61 Análisisde una genoteca genómicaconla sondaHH 64 3.31- Clonación del alelono ocupado correspondiente .1punto de recombinación 3’ 66 Análisis deuna genotecagenómicacon la sonda500: 66 3.4- CARACTERIZACIÓN DE LOS CLONES: Xhl2/82mi, Xh12/1g~oy 2I32~.~. 66 Ab1 3.4*- Secuenciación delos alelos no-ocupadoscorrespondientes al punto 73 derecombinación 3’,PAL2Ay 5’,PALL2B 3.41 El alelo no-ocupadocorrespondiente al locasde integración viral se encuentrafuera delas regiones amplificadas en las líneas celulares OSA yRMS-13 76 3.5- ELADN VIRALDESPLAZA, AL INTEGRARSE,SECUENCIAS CELULARES 79 3.6- LOCALIZACIÓNEXACTADEL LOCUS DEINTEGRACIÓNVIRALEN ELMAPA FISICODEL CROMOSOMA 12 82 3.6*- Caracterización delcósmido 107E2 85 3.61- Localizacióndel oligonucleótidode 17 pb en el cósmido 184A9 88 3.7- ¿ESTAAFECTADOELGENHMGI-CENLALINEACELULARSW7569 90 3.7a-Expresión delgenHMGI-Cenla líneacelular SW756 91 3.71 Amplificación por PCRdel extremo3’ del A.DNc delgen HMG¡-C 91 4-DISCUSIÓN 94 4.1 MODELO DE CARCIIÑOGÉNESIS GENITAL ASOCIADA ALA - INFECCIÓN PORLOS GENOTIPOS DE VPHDE ALTO RIESGO 103