UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS PRODUCCIÓN RECOMBINANTE DEL ANTÍGENO HE (HEMAGLUTININA-ESTERASA) DEL VIRUS DE LA ANEMIA INFECCIOSA DEL SALMÓN (ISA) EN LEVADURAS DE LA ESPECIE Pichia pastoris Daniela Paz Alejandra Avaria Piccardo Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario Departamento de Ciencias Biológicas Animales PROFESOR GUIA: DR. SERGIO BUCAREY VIVANCO SANTIAGO – CHILE 2010 Agradecimientos Quisiera expresar mi profundo agradecimiento a mi profesor guía el Dr. Sergio Bucarey Vivanco, por brindarme su apoyo, sus siempre útiles consejos y su incondicional guía durante todo este proceso, puesto que sin estos elementos, nada hubiese sido posible. Quiero además agradecerle su fe en mí, por darme la oportunidad de realizar tan desafiante e interesante proyecto. También, quiero expresar mi gratitud hacia el Dr. Leonardo Sáenz, por su colaboración y guía desinteresada cuando se la solicitaba. Además, quiero agradecer a al equipo que trabajan en el laboratorio Biovetec por toda su colaboración, especialmente a Sonia Vidal, por su gran disposición a ayudar cada vez que era necesario. Se agradece a la Unidad de Investigación y Desarrollo de Biológicos del Laboratorio Centrovet Ltda, por la facilitación de reactivos y material indispensables para el desarrollo de esta memoria. Deseo agradecer igualmente a mi madre, Cristina Piccardo y a mi padre, Fernando Avaria, por su incondicional apoyo durante toda esta travesía, por haber compartido conmigo las alegrías y frustraciones que ello conlleva. Muchas Gracias. FINANCIAMIENTO: Esta memoria contó con el financiamiento del Proyecto Bicentenario PSD 23 de CONICYT; y Proyecto de Iniciación en Investigación VID I/07, de la Vicerrectoría de Investigación y Desarrollo de la Universidad de Chile. 1 Índice Agradecimientos ..................................................................................................................... 1 Índice ...................................................................................................................................... 2 Introducción ............................................................................................................................ 5 Revisión Bibliográfica ............................................................................................................ 6 Hipótesis ............................................................................................................................... 12 Objetivo General: .................................................................................................................. 12 Objetivos Específicos: .......................................................................................................... 12 Materiales y Métodos: .......................................................................................................... 13 1- Manipulación de ADN ................................................................................................. 13 Clonamiento del gen HE del virus ISA. ....................................................................... 13 2- Trasformación de P. pastoris e inducción de síntesis proteica. ................................... 15 3- Análisis de Proteínas Recombinantes ........................................................................... 15 3.1 Determinación de la concentración de la proteína total en el sobrenadante de cultivo ........................................................................................................................... 15 3.2 Visualización mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y SDS (SDS- PAGE). .......................................................................................................................... 16 3.3 Análisis Western blot de los sobrenadantes de cultivos utilizando un anticuerpo específico anti-HE ......................................................................................................... 16 3.4 ELISA indirecto de sueros de salmones infectados naturalmente. ......................... 17 3.5. Fuente, obtención y manipulación de los sueros ................................................... 18 4. Análisis de Resultados .................................................................................................. 19 Esquema Resumen de Procedimientos ................................................................................. 20 Resultados ............................................................................................................................. 22 1- Manipulación de ADN ................................................................................................. 22 Clonamiento del gen HE del virus ISA. ....................................................................... 22 2- Transformación de P. pastoris e inducción de síntesis proteica. ................................. 27 3- Análisis de Proteínas Recombinantes ........................................................................... 29 3.1 Determinación de la concentración de la proteína total en el sobrenadante de cultivo ........................................................................................................................... 29 3.2 Análisis mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y SDS-PAGE ........... 30 3.3 Análisis Western blot de los sobrenadantes de cultivos utilizando un anticuerpo específico anti-HE ......................................................................................................... 32 3.4 ELISA indirecto con suero de salmones del Atlántico infectados naturalmente .... 33 Discusión .............................................................................................................................. 35 Conclusiones ......................................................................................................................... 41 Bibliografía .......................................................................................................................... 42 Anexo 1 ................................................................................................................................. 46 Anexo 2 ................................................................................................................................. 47 Anexo 3 ................................................................................................................................. 48 Anexo 4 ................................................................................................................................. 51 2 Resumen La anemia infecciosa del salmón es una enfermedad que afecta principalmente a los salmones del Atlántico (Salmo salar) y es causada por el virus ISA (infectious salmon anemia), el cual pertenece al género Isavirus de la familia Orthomyxoviridae. En Chile fue detectado por primera vez en salmones del Atlántico en el año 2007, causando innumerables pérdidas a la industria salmonera. El virus posee variadas proteínas de superficie, siendo las más estudiadas la neuroaminidasa, y la hemaglutinina-esterasa (HE). El gen que codifica para la proteína HE, posee una “región altamente polimórfica”, la cual le confiere gran variabilidad entre diferentes aislados del virus ISA. En el presente estudio se utilizó el gen HE del genotipo viral aislado con mayor frecuencia en Chile (genotipo EU), el cual fue sintetizado químicamente y optimizado para ser expresados por levaduras. El gen HEopt fue subclonado dentro del vector de expresión pPICZα junto a un péptido señal de secreción extracelular, el cual fue integrado al genoma de la levadura Pichia pastoris por recombinación homóloga. La cepa de la levadura que se obtuvo como resultado, fue sometida a fermentación y la cantidad de proteína HE secretada al medio de cultivo fue medida a través de la técnica de Bradford. Con el fin de corroborar la especificidad de la inmunorreacción de las proteínas recombinantes secretadas se realizaron ensayos Western blot y ELISA, utilizando un anticuerpo específico anti-ISA y sueros de salmones infectados naturalmente con el virus, respectivamente. De estos análisis se concluyó que la proteína recombinante producida y secretada por la cepa de levadura es específica y presenta inmunorreactividad positiva. De lo anterior puede inferirse que la plataforma montada y las proteínas recombinantes producidas en esta memoria serían de gran utilidad para la futura generación de técnicas tanto de diagnóstico como de control del virus de la anemia infecciosa del salmón en Chile. 3 Abstract Infectious salmon anemia (ISA) is a viral disease that mainly affects farmed Atlantic salmon (Salmo salar). This disease is caused by the ISA virus, which belongs to the genus Isavirus, Orthomyxoviridae family. It was first detected in 2007 in farmed Atlantic salmon of the coast of Chile, causing significant loss to the salmon industry. The ISA virus possesses many known surface projections; however the neuraminidase and hemagglutinin-esterase (HE) are the most widely studied. The encoding gene for the HE protein possesses a "highly polymorphic region", which confers it great variability among ISA virus isolates. In this study, the HE gene was used as it is the most frequently isolated genotype in Chile. The HE gene with a yeast-optimized codon usage was chemically synthesized. The full length HE-optimized encoding gene of ISA virus was cloned into a secretory pPICZα vector and then inserted by homologous recombination into Pichia pastoris genome. The recombinant yeast strain was submitted to a fermentation process and the amount of secreted protein to the supernatant was measured by the Bradford technique. To test whether yeast-secreting HE protein possesses the same antigenic properties as the natural ISA virus HE protein, Western blot and ELISA immunoassays were conducted using a specific anti-ISA antibody and a natural infected salmon serum, respectively. Both immunoassays showed a positive result. Consequently, these results suggest that the yeast- expression system set up in this study and that the recombinant proteins thus produced, could aid the development of both diagnosis and control techniques for the infectious salmon anemia disease thus preventing the loss caused by this disease. 4 Introducción El virus de la anemia infecciosa del salmón (ISA, del inglés infectious salmon anemia), pertenece a la familia Orthomyxoviridae, del género Isavirus. Afecta principalmente al salmón del Atlántico (Salmo salar) (Vike et al., 2008), pudiendo infectar a otros miembros de la familia Salmonidae. Sin embargo, se considera altamente hospedero-específico, por lo que no representa un riesgo ni para otras especies, ni para la salud humana. El virus ISA está presente en la mayoría de los países productores de salmón del Atlántico, tales como Noruega, Canadá, Irlanda, Islas Faroe y EUA (Vike et al., 2008). En Chile se identificó por primera vez en el año 1999 en el salmón coho (Oncorhynchus kisutch), sin que los peces presentaran la sintomatología clásica, sino que una condición clínica llamada “Síndrome Icterus” (Godoy et al., 2008). Sin embargo, en el año 2007 en un criadero de salmones del Atlántico en Chiloé, se presentó un brote con signología concordante con la forma clásica de la enfermedad asociada al virus (Godoy et al., 2008). Uno de los principales factores de virulencia del virus ISA es la proteína HE (hemoaglutinina-esterasa), la cual además de poseer actividad hemoaglutinina, posee una actividad acetilesterasa, por lo que se le ha denominado antígeno HE. Esta proteína de superficie es esencial para la unión del virus a las células del hospedero. El gen que codifica para ella posee una “región altamente polimórfica” HPR (highly polimorfic region), dando origen a distintos genotipos virales, los cuales poseen diferentes niveles de efectos citopáticos (virulencia) (Markussen et al., 2008). Con la realización de esta memoria se espera obtener información de relevancia para utilizar esta proteína en el desarrollo de métodos de diagnósticos y control del virus de la anemia infecciosa del salmón en Chile. 5 Revisión Bibliográfica El virus ISA (la sigla que da origen al nombre proviene del inglés infectious salmon anemia), causa la enfermedad llamada anemia infecciosa del salmón, la cual afecta principalmente al salmón del Atlántico (Vike et al., 2008), pudiendo infectar a otros miembros de la familia Salmonidae. Sin embargo, es en los salmones del Atlántico en quienes se produce la forma clásica de la enfermedad, la cual se manifiesta a través de signos tanto externos como internos. Entre los primeros destacan: aumento de mortalidad, peces letárgicos, palidez de branquias (debido a la anemia), hemorragia de la cámara anterior del ojo y exoftalmia. Dentro de los signos internos con mayor relevancia se describen: congestión intestinal y hepática, ascitis, petequias en ciegos pilóricos y en grasa visceral. La producción de salmones, y en general la mayoría de las producciones, se caracterizan por tener altas densidades de individuos en poco espacio, si a esto le adicionamos que la anemia infecciosa del salmón es una enfermedad altamente contagiosa, se traduce en una situación ideal para la diseminación de la enfermedad. Es por esta causa, más el gran impacto económico que genera la enfermedad, que fue listada como una enfermedad de notificación obligatoria por la OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal) (Mardones, et al., 2009). Una vez establecido el virus en una piscicultura, este puede propagarse de jaula en jaula por varios meses, observándose rangos de mortalidad variable, así como distintos grados de afección a los peces infectados (Mardones, et al., 2009). En general, se inicia con expresiones bajas de mortalidad pudiendo aumentar en relación a las temperaturas del agua a niveles más significativos (entre 0,5 a 1%), llegando a mayores tasas de mortalidad acumuladas en aquellas jaulas infectadas al cabo de algunos meses (Sernapesca, 2008). 6 La transmisión del virus ocurre principalmente de forma pasiva por medio del agua de mar, o bien, por contacto directo entre salmones infectados y sanos en una misma jaula (Nylund et al., 2006). El virus se propaga esencialmente a través de sangre, mucus, contenido intestinal y orina de animales infectados, los cuales pueden transmitir el virus semanas antes de la aparición de los signos clínicos (Cipriano, 2002). Además, el agente puede sobrevivir y replicarse en peces silvestres, los que actúan como reservorios y diseminadores del virus. Entre estos se encuentran los arenques del Atlántico (Clupea harengus), la trucha arco iris (Oncorhyncus mykiss), la trucha café y trucha de mar (Salmo trutta) (OIE, 2000; Sernapesca, 2008). Adicionalmente se ha observado que la presencia del vector Caligus sp., denominado comúnmente como “piojo de mar”, juega un rol importante en la diseminación del virus (Sernapesca, 2008). El diagnóstico se puede realizar en base a los signos clínicos, evidencias histopatológicas y pruebas moleculares tales como RT- PCR (reverse transcriptase - polymerase chain reaction) e IFAT (immunofluorescence antibody test) (Godoy et al., 2008). Actualmente, los métodos de diagnóstico para el ISA están especialmente detallados y estandarizados internacionalmente para cada condición de la enfermedad en el “Manual de pruebas diagnósticas para animales acuáticos” de la OIE (Manual of diagnostic test for aquatic animal) (OIE, 2006). 7 Hasta el día de hoy, no existe tratamiento médico contra la enfermedad por lo que es necesario tomar estrictas medidas de profilaxis con el fin evitar la entrada del virus a una determinada zona. Para enfrentar esta situación el Servicio Nacional de Pesca (Sernapesca) ha dispuesto diversas medidas entre las cuales se destacan:  Eliminación o cosecha de las jaulas con animales afectados por ISA.  Delimitación de zonas de cuarentena y vigilancia.  Restricción de movimientos de la zona afectada.  Estrictas medidas de bioseguridad.  Condiciones de cosecha y proceso especiales para centros ubicados en las zonas bajo cuarentena y vigilancia.  Chequeo de smolt y reproductores.  Sistemas de desinfección de RILES en plantas de proceso.  Establecimiento de monitoreo y vigilancia permanente de los centros de las zonas afectadas y otros relacionados con el brote.  Reporte semanal de mortalidades por parte de los centros de cultivo como elemento de alerta temprana.  Adicionalmente los laboratorios de diagnóstico y empresas de cultivo deben reportar de manera inmediata los resultados y cambios clínicos sugerentes de la enfermedad.  Realizar una cosecha temprana de los peces, lo que se traduce en una disminución de la carga viral.  Eliminación de los peces de las balsas-jaula con mortalidad por ISA.  Los salmones infectados con ISA deben ser procesados en plantas de proceso autorizadas para ello, puesto que deben contar con sistemas de tratamiento de los efluentes que sea capaz de eliminar el riesgo de diseminar el virus a otras áreas. Conjuntamente con esto, el Sernapesca y la autoridad marítima, deben ser previamente informados. 8 La anemia infecciosa del salmón se ha convertido en una de las enfermedades más importantes para la industria del salmón (Mardones et al., 2009). Luego que se detectara por primera vez en Noruega en el año 1984 (Vike et al., 2008), el virus se diseminó rápidamente hacia otras partes del mundo, reportándose brotes en Canadá en el año 1996, Escocia en 1998, Islas Faroe en 1999, Estados Unidos en el año 2000 y en Chile afectando por primera vez a los salmones del Atlántico, en el año 2007 (Godoy et al., 2008). La enfermedad permanece como endémica en la gran mayoría de estos países. Sin embargo, Escocia, es el único país donde se ha logrado su erradicación (Vike et al., 2008). De acuerdo al análisis del genoma viral, se han diferenciado dos genotipos designados según el área geográfica de aislamiento: el genotipo europeo (EU) y el norteamericano (N), (Godoy et al., 2008; Bouchard et al., 2001). Chile ocupa el segundo lugar como país productor de salmones del Atlántico, luego de Noruega (Mardones et al., 2009) y la presencia del virus ISA ha causado grandes estragos sobre la industria salmonera del país. En Chile se detectó por primera vez en el año 1999, en el salmón coho, sin que los peces presentaran la sintomatología clásica, sino que una condición clínica llamada “Síndrome Icterus”. Luego de aislar el virus, se demostró que pertenecía al genotipo N (Godoy et al., 2008). Por otra parte, en el año 2007 en un criadero de salmones del Atlántico en Chiloé, se registraron aumentos repentinos en la mortalidad de peces que se estaban recuperando de piscirickettsiosis. Basándose en los signos clínicos, lesiones presentes y pruebas inmunohistológicas, se logró confirmar el diagnóstico de ISA virus. Posteriormente, a través de la realización de un análisis genético mediante PCR y secuenciación, se determinó que correspondía al genotipo EU (Godoy et al., 2008). Puesto que la cepa que afecta a los salmones de nuestro país tiene una estrecha relación filogenética con la cepa proveniente de Noruega, adicionado a que en Chile no existen hospederos naturales, ya que el salmón del Atlántico ha sido introducido desde diversos países, entre ellos Noruega; se postula que la propagación del virus pudo haberse ocasionado vía transmisión vertical por medio de embriones infectados provenientes de este país, ya que anualmente grandes cantidades son importadas a Chile (Vike et al., 2008). 9