ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Ali COŞKUN ENDÜSTRİYEL ENZİMLER ÜRETEN YENİ BACILLUS SP. SUŞLARININ İZOLASYONU VE KARAKTERİZASYONU BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ENDÜSTRİYEL ENZİMLER ÜRETEN YENİ BACILLUS SP. SUŞLARININ İZOLASYONU VE KARAKTERİZASYONU Ali COŞKUN YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez ………… Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul Edilmiştir. İmza………………… İmza…………………. İmza…………….………….. Prof.Dr. Numan ÖZCAN Prof.Dr. Burhan ARIKAN Yrd.Doç.Dr. B. Devrim ÖZCAN Danışman Üye Üye Bu Tez Enstitümüz Biyoteknoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof.Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir. ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ ENDÜSTRİYEL ENZİMLER ÜRETEN YENİ BACILLUS SP. SUŞLARININ İZOLASYONU VE KARAKTERİZASYONU Ali COŞKUN ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Numan ÖZCAN Yıl : 2010, Sayfa: 115 Jüri : Prof.Dr. Numan ÖZCAN Prof.Dr. Burhan ARIKAN Yrd.Doç.Dr. B. Devrim ÖZCAN Bu çalışmada alkalifilik Van Gölü, halofilik Tuz Gölü ve Adana’da yerelması yetiştiriciliği yapılan topraklardan α-amilaz, ksilanaz ve CMCaz üreten alkalifilik, halofilik ve termofilik Bacillus sp. su şlarının izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Van Gölü’nden izole edilen alkalifilik Bacillus sp. VA-24 suşunun ürettiği α- amilaz enziminin moleküler a ğırlığı yaklaşık 120 kDa, s ıcaklık ve pH optimumu sırasıyla 90 °C ve 11.0 olarak bulunmu ştur. Enzim 100 °C’de muhafaza edildi ğinde aktivitesinin tamamını korumuştur. Tuz Gölü’nden izole edilen halofilik Bacillus sp. TGB-3 suşunun yaklaşık 52 ve 48 kDa moleküler a ğırlığına sahip ksilanaz ana aktivitesi ile moleküler a ğırlığı yaklaşık 123 kDa α-amilaz yan aktivitesine sahip iki enzim üretti ği gözlenmiştir. Halofilik ksilanaz enziminin sıcaklık ve pH optimumu sırasıyla 60 °C ve 7.0 olarak tespit edilmiştir. Ksilanaz enziminin termostabilitesi 70 °C’e kadar kararl ı olarak gözlenirken, halofilik α-amilaz enziminin optimum s ıcaklığı ve pH’s ı ise 50 °C ve 7.0 olarak belirlenmiştir. Adana’da yerelmas ı yetiştiriciliği yapılan topraklardan izole edilen termofilik Bacillus sp. YET-1 su şunun ürettiği CMCaz enziminin moleküler a ğırlığı yaklaşık olarak 48 kDa olarak bulunmu ştur. CMCaz enziminin termostabilitesi 90 °C’ye ulaşırken, optimum sıcaklık ve pH’sı sırasıyla 50 °C ve 7.0 olarak belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Bacillus, α-amilaz, CMCaz, ksilanaz, ekstremofil I ABSTRACT M.Sc. THESIS ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF NEW BACILLUS SP. STRAINS PRODUCING INDUSTRIAL ENZYMES Ali COŞKUN DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof.Dr.Numan ÖZCAN Year : 2010, Page: 115 Jury : Prof.Dr. Numan ÖZCAN Prof.Dr. Burhan ARIKAN Asst.Prof.Dr. B. Devrim ÖZCAN In this study, α-amylase, xylanase and CMCase producing alkaliphilic, halophilic and thermophilic Bacillus sp. strains were isolated from Van Lake with alkaliphilic soil, Tuz Lake with halophilic soil and Jerusalem artichoke field of Adana. Bacillus sp. VA-24 strain of Van Lake, produces the α-amylase with molecular weight of approximately 120 kDa, temperature and pH optimum of 90 °C and 11.0, respectively. Thermostability of the enzyme was stable up to 100 °C. Bacillus sp. strain TGB-3 of Tuz Lake produces two proteins with xylanase main activity, molecular weight of approximately 52 and 48 kDa and α-amylase (side activity) with molecular weight approximately of 123 kDa. Halophilic xylanase has temperature and pH optimum of 60 °C and 7.0, respectively, while halophilic α- amylase has temperature optimum and pH optimum of 50 °C and 7.0 respectively. Thermostability of xylanase was determined to be stable up to 70 °C. Bacillus sp. strain YET-1 produce thermophilic CMCase with molecular weight of approximately 48 kDa and thermostability of the CMCase were reached up to 90 °C. Optimum temperature and pH of the CMCase 50 °C and 7.0, respectively. Key Words: Bacillus, α-amylase, CMCase, xylanase, extremophile II TEŞEKKÜR Bu tez çal ışmasında bana her konuda değerli bilgi ve önerileri ile yol gösteren ve büyük emek sarf eden dan ışman hocam sayın Prof.Dr. Numan ÖZCAN’a sonsuz teşekkürlerimi arz ederim. Ayr ıca tez çalışmasının her aşamasında her zaman yanımda olan; yakın ilgisi, değerli önerileri ve yard ımlarını benden esirgemeyen say ın hocam Yrd.Doç.Dr. B. Devrim ÖZCAN’a, Yrd.Doç.Dr. Makbule BAYLAN’a ve Dr. Ali İrfan GÜZEL’e teşekkürlerimi sunarım. Yüksek lisans tez jürimde de ğerli fikir ve önerileri ile katkıda bulunan hocam Prof.Dr. Burhan ARIKAN’a teşekkürlerimi sunarım. Laboratuar çal ışmaları süresince beraber huzur ve uyum içinde çal ışma ortamı sa ğlayan çal ışma arkada şlarım Biyolog Dilek TEKDAL’a, Fen Bilgisi Öğretmeni Atilla ÖZ’e, Ar.Gör. Selçuk ULUSOY’a ve Kimya Mühendisi Esra YIKAR’a teşekkürlerimi sunarım. Hayat ımda bir an bile maddi ve manevi desteklerini benden esirgemeyen, varlıkları ile bana güç veren ve beni bu günlere getiren çok de ğerli AİLEM’e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ..................................................................................................................................I ABSTRACT.................................................................................................................II TEŞEKKÜR................................................................................................................III İÇİNDEKİLER...........................................................................................................IV ÇİZELGELER DİZİNİ ...............................................................................................X TABLOLAR DİZİNİ………………………………………………………………..XI ŞEKİLLER DİZİNİ ..................................................................................................XII SİMGELER VE KISALTMALAR...........................................................................XV 1. GİRİŞ………………………………………………..………………………….....1 1.1. Ekstrem Mikroorganizmalar………...…………………..…………………...1 1.1.1. Termofil Mikroorganizmalar…………………………………………..4 1.1.1.1. Termofil Mikroorganizmalar ın Yüksek Sıcaklığa Dayanıklılık (Termostabilite) Mekanizması.………….……5 1.1.1.2. Termostabil Enzimler ve Önemi……..……………….……...7 1.1.2. Alkalifil Mikroorganizmalar…………………....………………..…….8 1.1.2.1. Areobik Alkalifiller…………………..………...….….…….10 1.1.2.2. Anaerobik alkalifiller………………………………......…...10 1.1.2.3. Haloalkalifiller………………………………………….…..10 1.1.2.4. Halofilik Metanojenler ve Siyanobakteriler……….…..…....11 1.1.3. Halofil Mikroorganizmalar…………………………………..……….12 1.1.3.1. Halofilik Enzim ve Çözünürlüğü……..…………………….14 1.1.3.2. Halofil Mikroorganizmaların Tuz Toleransları ve Metabolizmaları………..…....…….…...15 1.1.3.3. Halofil Mikroorganizmaların Biyoteknolojik Açıdan Önemi………………………..….….16 1.2. Endüstriyel Enzimler ve Kullanım Alanları…………………………….….18 1.2.1. Selüloz ve Selülaz (Glukanaz) Enzimleri……………………….……18 1.2.1.1. Selülaz Enzimlerinin Kullanım Alanları……………………22 1.2.2. Ni şasta ve Amilazlar……………………………………..…………..23 IV 1.2.2.1.Amilazların Sınıflandırılması…………..…………..………..24 1.2.2.2. Termostabil Amilazlar………………………………..……..26 1.2.2.3. Termostabil α-amilaz Enziminin Endüstrideki Kullanım Alanları……………………………..28 1.2.3. Ksilan ve Ksilanazlar………………………………………………....29 1.2.3.1. Mikrobiyal Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları…...……31 1.3. Bacillus Cinsi………………………………………………………………35 1.3.1. Bacillus Hücre Morfolojisi ve Hücre Duvarının Yapısı………….…..35 1.3.2. Bacillus Sporları ve Koloni Özellikleri…………………………..…...36 1.4. Araştırmanın Amacı ve Kapsamı……………………………………..……37 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR…………………………………………………..…..38 2.1. Amilazla İlgili Yapılmış Önceki Çalışmalar………………………………38 2.2. Selülaz (CMCaz)’la İlgili Yapılmış Önceki Çalışmalar…………………...42 2.3. Ksilanazla İlgili Yapılmış Önceki Çalışmalar……………………………..44 3. MATERYAL ve METOT……………………………………………….…..…...47 3.1. Materyal…………………..…………………………………………………..47 3.1.1. Bakteri ve Besiyerleri……………..……………………………….….47 3.1.2. Aletler…………………………………..………………………….….47 3.2. Kullanılan Çözeltiler……………………………………..……………….…..47 3.2.1. NaOH Çözeltisi………………………………………………..……...47 3.2.2. Kongo Kırmızısı (%0.1)………………………………………………48 3.2.3. İyodin Boyası (100 ml).………………………………………………48 3.2.4. NaCl Çözeltisi (1M)…..………………………………………………48 3.2.5. Sodyum-Asetat Tamponu…………………………………….………48 3.2.6. Sodyum-Fosfat Tamponu……………………………………………..48 3.2.7. Tris Tamponu…………………………………..……………..………49 3.2.8. DNS (Dinitro Salisilik Asit) …………………….........................……49 3.2.9. TCA (Trikloroasetikasit) (%20 w/v)……………………………..…...49 3.2.10. SDS-PAGE Stok Solüsyonları………………...………….….……...49 3.2.10.1. 2M Tris HCl (pH 8.8)……………………...……………………...49 3.2.10.2. 1M Tris-HCl (pH 6.8).………………………………..…………...49 V 3.2.10.3. %10 SDS…………………………..…………………….………...50 3.2.10.4. Akrilamid Monomer Solüsyonu (Solüsyon A) ( %30 akrilamid, %0,8 bisakrilamid)……..………...50 3.2.10.5. %10’luk Amonyum Persülfat………………………….…………..50 3.2.10.6. Örnek Yükleme Tamponu (5X) ……………………………....…..50 3.2.10.7. Elektrod Solüsyonu (1 litre için) ………………………………….50 3.2.10.8. Coomasi Brillant Blue Boyası (CBB) Stok Solüsyonu (1L) ….….50 3.2.10.9. Boyayı Geri Alma (Destaining) Solüsyonu (1L)…………..……...51 3.2.10.10. SDS-PAGE’nde Zimogram Analizleri İçin Renatürasyon Solüsyonları………………………………...…….51 3.3. Bakteri İzolasyonunda Kullanılan Besiyerleri………………….……...……..52 3.3.1. LB Agar……………………………………..….…………….……….52 3.3.2. LB-CMC-Agar Besiyeri……………………………………………....52 3.3.3. LB-Ksilan-Agar Besiyeri……………….….………………….…...…52 3.3.4. LB-Nişasta-Agar Besiyeri………………………………..…………...53 3.4. Metot……………………………………............................................................53 3.4.1. Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu ve Katı Besiyerlerinde Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi…………..……………………..53 3.4.1.1. Alkalifilik Bacillus sp. İzolasyonu…………………..……...53 3.4.1.2. Halofilik Bacillus sp. İzolasyonu………..………………….54 3.4.1.3. Termofilik Bacillus sp. İzolasyonu………….……………...55 3.4.2. Enzimlerin Üretimi ve Kantitatif Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi………………………56 3.4.2.1. Enzimlerin Optimum Aktivite Gösterdi ği Sıcaklık Değerlerinin Saptanması……………………….……………57 3.4.2.2. Enzimlerin Optimum Aktivite Gösterdiği pH Değerinin Saptanması…………………………………....57 3.4.2.3. Enzimlerin Termal (Sıcaklık) Stabilitelerinin Saptanması.....57 3.4.2.4. Enzimlerin Değişik Sıcaklıklardaki Denatürasyon Testi (Suda Çözünürlüğü)………….………..58 VI 3.4.2.5. Steril ve Steril Olmayan Koşullarda Üretilen Bacillus sp. Suşlarına Ait Enzim Profillerindeki Değişiklikler…………………………58 3.4.2.6. İzole Edilen Bacillus sp. Suşlarının Substrat Spesifisiteleri..58 3.4.3. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezinde (SDS-PAGE) Moleküler Ağırlık Tahmini ve Zimogram Analizi…..59 3.4.3.1. SDS-PAGE Sisteminin Haz ırlanması……………..………..59 3.4.3.2. Zimogram Analizi İçin SDS-PAGE Sisteminin Hazırlanması……………………………………..60 3.4.3.3. Enzim Örneklerinin Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi…...…60 3.4.3.4. SDS-PAGE Jelinin Boyanması ve Zimogram Analizleri..…61 4. BULGULAR VE TARTIŞMA…………….…………………..……………......63 4.1. Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu….......…………….……………..63 4.2. Van Gölün’den Alkalifil Bacillus sp. VA-24 Suşunun İzolasyonu ve Enzim Karakterizasyonu…………..……….63 4.2.1. Alkalifil Bacillus sp. VA-24 Suşunun Ürettiği Enzimler ve Katı Besiyerinde α-amilaz Enzimi Üretmesi.……..63 4.2.2. Bacillus sp. VA-24 α-amilaz Enziminin Optimum Sıcaklığı…………………………………...65 4.2.3. Bacillus sp. VA-24 α-amilaz Enziminin Optimum pH Aralığı………………………………....65 4.2.4. Bacillus sp. VA-24 α-amilaz Enziminin Termal Stabilitesi………………………………….…66 4.2.5. Bacillus sp. VA-24’ün SDS-Nişasta-PAGE ve Zimogram Analizi………………………..………...67 4.2.6. Steril ve Steril Olmayan Koşullarda Üretilen Bacillus sp. VA-24 Suşuna Ait α-amilaz Enzim Profilindeki Değişiklikler………….....…….………..67 4.2.7. Alkalifilik Bacillus sp. VA-24 Suşuna Ait α-amilaz Enziminin Değişik Sıcaklıklardaki Denatürasyon Testi (Suda Çözünürlüğü)………..…...68 VII 4.2.8. Alkalifilik Bacillus sp. VA-24 Suşuna Ait α-amilaz Enziminin Substrat Spesifisitesi………………….….70 4.3. Tuz Gölün’den Halofil Bacillus sp. TGB-3 Suşunun İzolasyonu ve Enzim Karakterizasyonu……………..……………..71 4.3.1. Halofil Bacillus sp. TGB-3 Suşunun Ürettiği Enzimler ve Katı Besiyerinde Ksilanaz Enzimi Üretmesi…..71 4.3.2. Bacillus sp. TGB-3 Ksilanaz Enziminin Optimum Sıcaklığı..73 4.3.3. Bacillus sp. TGB-3 Ksilanaz Enziminin Optimum pH’sı…...73 4.3.4. Bacillus sp. TGB-3 Ksilanaz Enziminin Termal Stabilitesi…74 4.3.5. Bacillus sp. TGB-3’ün SDS-Ksilan-PAGE ve Zimogram Analizi…………………………………………...75 4.3.6. Steril ve Steril Olmayan Koşullarda Üretilen Bacillus sp. TGB-3 Suşuna Ait Ksilanaz Enzim Profilindeki Değişiklikler………………..…………………..76 4.3.7. Halofilik Bacillus sp. TGB-3 Suşuna Ait Ksilanaz Enziminin Değişik Sıcaklıklardaki Denatürasyon Testi (Suda Çözünürlüğü)…………….……...77 4.3.8. Bacillus sp. TGB-3 α-amilaz Enziminin Optimum Sıcaklığı…………………………………………...79 4.3.9. Bacillus sp. TGB-3 α-amilaz Enziminin Optimum pH’sı……………………………………….……...79 4.3.10. Halofilik Bacillus sp. TGB-3 Suşuna Ait α-amilaz Enziminin SDS-Nişasta-PAGE ve Zimogram Analizi…………………………………….……..80 4.3.11. Halofilik Bacillus sp. TGB-3 Suşuna Ait Ksilanaz ve α-amilaz Enzimlerinin Substrat Spesifisiteleri………..….81 4.4. Yer Elması Yetiştirilen Topraktan Termofil Bacillus sp. YET-1 Su şunun İzolasyonu ve Enzim Karakterizasyonu………..….82 4.4.1. Termofil Bacillus sp. YET-1 Suşunun Ürettiği Enzimler ve Katı Besiyerinde CMCaz Enzimi Üretmesi………..…….82 VIII