AVERTISSEMENT Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de l'ensemble de la communauté universitaire élargie. Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l’utilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale. Contact : [email protected] LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10 http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm Faculté
des
Sciences
et
Technologies,
secteur
biologie
 Ecole
Doctorale
Ressources
Procédés
Produits
Environnement
(RP2E)
 
 
 
 
 THESE
 
 Présentée
pour
l’obtention
du
titre
de
 Docteur
de
l’Université
Henri
Poincaré,
Nancy
I
 En
Biologie
Végétale
et
Forestière
 
 Par Stéphane
HACQUARD
 
 Contribution
à
l’étude
des
déterminants
génétiques
impliqués
 dans
le
processus
infectieux
de
Melampsora
larici­populina,
 l’agent
de
la
rouille
foliaire
du
peuplier
 Approches
génomique
et
transcriptomique
 
 Soutenance
publique
le
18
novembre
2010
 
 Membres
du
Jury
:
 
 Président
:
 Pr.
Jean‐Pierre
Jacquot





















Professeur,
Université
Henri
Poincaré,
Nancy 
 
 
 Rapporteurs
:
 Dr.
Marc‐Henri
Lebrun

 







Directeur
de
Recherches,
INRA
de
Versailles
 Dr.
Diana
Fernandez
 










 







Directeur
de
Recherches,
IRD
de
Montpellier
 
 Examinateurs
:
 Dr.
Elodie
Gaulin
 
 







Maître
de
conférences,
Université
Paul
Sabatier,
Toulouse
 Dr.
Francis
Martin
 








 







Directeur
de
Recherches,
INRA
de
Nancy
(Directeur
de
thèse)
 Dr.
Sébastien
Duplessis
 







Chargé
de
Recherches,
INRA
de
Nancy
(Directeur
de
thèse)
 
 Unité
Mixte
de
recherche
1136
INRA/UHP
Interactions
Arbres‐Microorganismes






















 Centre
INRA
de
Nancy
‐
54280
Champenoux
 
 1 2 Remerciements Francis, Merci de m’avoir fait confiance pour cette thèse. Je suis ravi d’avoir réalisé ce travail sous ta direction et j’espère avoir répondu à tes attentes. Je sais que j’ai été dans les meilleures conditions pour réaliser cette thèse et c’est en grande partie grâce à toi. Je tenais également à te remercier pour ton soutien durant cette période difficile de fin de thèse, que ce soit pour la recherche de Post docs ou pour le renouvellement de mon contrat. Sébastien, je ne sais pas trop par où commencer. Tout d’abord merci pour ces trois magnifiques années de thèse passées sous ta direction. Cela a été un honneur pour moi de travailler à tes cotés et d’évoluer sous ton impulsion. Tu m’as transmis ta rigueur scientifique ainsi que ta méthodologie qui me suivront durant toute ma carrière professionnelle. Tu as également été tout le temps disponible pour répondre à mes questions et tu as été d’une grande efficacité dans la correction de mes divers rapports. Hormis l’aspect scientifique, nous partageons les mêmes goûts musicaux, certes douteux, et je te remercie de m’avoir fait connaître des pépites qui trônent maintenant dans la top liste de ma discographie. Comme on dit chez moi, à bientôt gros. Merci à Marc-Henri Lebrun, Diana Fernandez, Elodie Gaulin et Jean-Pierre Jacquot d’avoir accepté de lire ce manuscrit et de faire partie de mon jury de thèse. Pascal, en plus d’une bouille incroyable, tu as une ‘tchatche’ mémorable. Merci pour tout ce que tu m’as appris sur les rouilles en cage. Valérie, c’est toi qui m’as fait mettre un pied chez les microbes, qui m’as fait découvrir le monde de la recherche et qui m’as tout appris sur la microscopie alors merci mille fois pour tout. Manue, tu venais de Mirecourt, je venais de St Dié. De ton coté le p’tit Johnny, de mon coté le p’tit Gregory. On était mal partis… mais on a quand même réussi. A bientôt dans World of Warcraft… Ben, c’était un vrai plaisir de te côtoyer tous les jours au bureau, de partager des vannes bien souvent douteuses avec toi et de déconner sur à peu près tout et n’importe quel sujet. Toutes nos soirées sportives, ‘houblonisées’, ou culturelles resteront également marquées dans ma mémoire en attendant les prochaines j’en suis sûr ... JB, j’ai survécu sans le savoir à tous tes tests allergiques ; que ce soit la galette, la tarte aux poires piégée à la poudre d’amande ou encore le ‘traquenardesque’ rhum arrangé noix-amandes invisibles alors je ne sais pas si je dois te remercier pour ça mais en tout cas un grand merci pour ton accueil et ta cuisine délicieuse. PJ, gamin de la région Nord, dans l’enfer du terril, vers la Lorraine tu te dérobes, t’as vraiment pas la vie facile. En tout cas merci d’avoir atterri ici et merci pour toutes ces soirées bières-pizzas qui vont me manquer. A plus cht’i gars. Jaime, j’ai pu voir le dieu Lemmy avec toi et cela restera un super moment de Rock’n roll. Je suis sûr que cette douce musique nous rassemblera de nouveau un jour. Angela, tou es folie, tou es chaleul, tou es bonheul, tou as la bonne humeul et même si tou chantes Toto Cutugno à tou tête dans le labo, c’était un plaisir de te rencontrer. On garrlde le contact ... A2line, je ne sais toujours pas si tu as trouvé le « putain con qu’a cagé » mais en tout cas c’est l’une de tes expressions qui m’a le plus scotché, même le vosgien que je suis ne peut rivaliser. Yann, c’était aussi un plaisir de te rencontrer. Reste l’homme aux dreads, joueur de dijeridoo et amateur de dub music et de cinéma que tu es. Bon courage pour la suite. 
 3 François, mon p’tit bouchon, je n’oublierai pas tous ces moments passés à chanter l’helicon et bobo Léon dans le labo. André, l’image d’un brésilien sur les pistes de ski des Vosges restera pour moi un grand moment de bonheur. La prochaine fois c’est moi qui viens chez toi … Marlieseeee, un grand merci à toi aussi pour toutes ces années passées dans le même bureau, à partager des capuccino et a se tenir compagnie jusque tard dans la soirée. Christine, ça a été également un plaisir de travailler avec toi au quotidien et je tenais vraiment à te remercier pour tout le travail que tu as fourni pour m’épauler. Je te souhaite bon courage ainsi qu’à tes filles pour la suite. Béatrice … et je sais à quel point tu aimes ça que je t’appelle Béatrice ... Merci pour ton franc parler, pour ta bonne humeur et ta joie de vivre. Que l’imberbe et douce peau des Viets te fasse toujours fantasmer et que le Shiatsu, Chi kong, Tai-chi, yoga et autre sophro je ne sais quoi t’apportent la paix intérieure. Je tenais également à adresser un remerciement général à Cendrella, Yohann, Carine, Aude, Emilie, Aurore, PE, Abdala, Veronica, Cécile, Aurélie, Julien, Jessy, Judith, Sara, Jonathan, Panos, Nicolas, Dominique, Agnès, Nicole, Mauricio, Annegret, Marc, Stéphane, Claire, Annick, Cyrille, Claude, Pascale, François et Jean ainsi qu’à tous les autres microbes que j’ai côtoyés durant ces quatre magnifiques années. Enfin, un grand merci à mon frangin pour ces week ends de glisse dans les Alpes qui m’ont permis de me déconnecter du labo et à mes parents qui m’ont toujours soutenu que ce soit dans mes choix d’orientation ou même financièrement et sans qui je ne serais peut-être pas en train d’écrire ce pavé. Mes derniers mots iront pour toi Delphine qui me supportes depuis plus de 6 ans déjà. Même si ces dernières semaines j’ai passé plus de temps avec mon ordinateur qu’avec toi, je sais que tu ne m’en tiendras pas rigueur puisque les rôles s’inverseront bientôt … Alors merci mille fois de m’avoir soutenu, épaulé et encouragé au cours de la rédaction de ce manuscrit mais également pour tout ce que tu m’apportes dans la vie de tous les jours en général.

 
 4 5 6 Sommaire 
 
 
 Chapitre
I
:
Analyse
bibliographique.............................................................................................................1
 
 I
­
La
reconnaissance
entre
plantes
et
agents
pathogènes........................................................................3
 1
‐
Des
anciens
modèles
aux
modèles
actuels
de
reconnaissance
plantes‐pathogènes...............................3
 2
‐
Implication
des
effecteurs
dans
les
interactions
plantes/pathogènes..........................................................7
 2.1‐
Implication
des
effecteurs
dans
la
virulence
du
pathogène
(ETS)..........................................................7
 2.2‐
Implication
des
effecteurs
(Avr)
dans
l’avirulence
du
pathogène
(ETI)............................................13
 3
‐
L’export
des
effecteurs
dans
la
cellule
hôte............................................................................................................18
 3.1
‐
Le
système
de
sécrétion
de
type
III
:
une
nanomachine
pour
délivrer
les
effecteurs
 bactériens...............................................................................................................................................................................19
 3.2
‐
RxLR
:
Un
motif
signal
conservé
chez
les
effecteurs
d’oomycètes
pour
l’entrée
dans
les
 cellules
de
l’hôte...................................................................................................................................................................19
 3.3
–
l’export
des
effecteurs
de
champignons
et
motifs
RXLR‐like
?.............................................................21
 4
‐
La
reconnaissance
des
effecteurs

(Avr)
par
les
protéines
R
de

la
plante.................................................22
 4.1
‐
Les
gènes
de
résistance
R......................................................................................................................................23
 4.2
‐
Perception
de
l’effecteur
par
les
protéines
R................................................................................................25
 4.3
‐
Coévolution
entre
l’effecteur
et
la
protéine
de
résistance.......................................................................27
 5
‐
Identification
de
nouveaux
effecteurs
chez
les
oomycètes
et
les
champignons......................................28
 5.1
‐
Taille
des
effecteurs
et
signal
de
sécrétion....................................................................................................28
 5.2
‐
Richesse
en
cystéine
des
effecteurs..................................................................................................................29
 5.3
‐
Présence
de
motifs
conservés
chez
les
effecteurs.......................................................................................29
 5.4
‐
Variabilité
nucléotidique
des
effecteurs..........................................................................................................31
 5.5
‐
Expression
des
gènes
codant
pour
ces
effecteurs.......................................................................................32
 
 II
­
Les
Pucciniales.........................................................................................................................................................33
 1
‐
Généralités.............................................................................................................................................................................33
 2
‐
Phylogénie
et
taxonomie.................................................................................................................................................35
 3
‐
Cycle
de
vie............................................................................................................................................................................37
 4
‐
Processus
d’infection
au
cours
de
la
phase
urédienne.......................................................................................39
 5
‐
L’haustorium.........................................................................................................................................................................41
 5.1
‐
Implication
de
l’haustorium
dans
la
biosynthèse
de
métabolites........................................................41
 5.2
‐
Implication
de
l’haustorium
dans
le
transfert
des
nutriments..............................................................43
 5.3
‐
Implication
de
l’haustorium
dans
la
sécrétion
de
molécules
signal....................................................45
 
 III
­
L’interaction
peuplier­Melampsora
larici­populina..................................................................................47
 1
‐
Le
peuplier.............................................................................................................................................................................47
 1.1
‐
La
populiculture.........................................................................................................................................................47
 1.2
‐
Le
peuplier:
un
arbre
modèle
dont
le
génome
a
été
séquencé..............................................................49
 1.3
‐
Les
maladies
des
peupliers...................................................................................................................................49
 2
‐
Melampsora
larici­populina............................................................................................................................................51
 2.1
‐
Cycle
biologique
de
Melampsora
larici­populina.........................................................................................53
 2.2
‐
Virulences
connues
chez
Melampsora
larici­populina..............................................................................55
 3
‐
Bases
moléculaires
de
l’interaction
Peuplier/Melampsora..............................................................................57
 
 IV
­
La
génomique...........................................................................................................................................................................61
 1
‐
Etat
des
lieux
sur
le
séquençage
des
génomes
de
champignons
et
oomycètes
phytopathogènes..61
 2
‐
L’annotation
des
Génomes..............................................................................................................................................65
 3
‐
La
transcriptomique..........................................................................................................................................................67
 
 V
­
Objectifs
de
la
thèse..............................................................................................................................................................71
 1
‐
Contexte..................................................................................................................................................................................71
 2
‐
Projet
de
thèse......................................................................................................................................................................71
 
 
 7 Chapitre
II
:
Analyse
globale
du
génome
et
du
transcriptome
de
Melampsora
larici­ populina...............................................................................................................................................................................................77
 
 Chapitre
III
:
Analyse
globale
du
secrétome
de
Melampsora
larici­populina..............131
 
 Chapitre
IV
:
La
microdissection
à
capture
laser,
un
outil
puissant
pour
l’analyse
 du
transcriptome
de
tissus
complexes:
le
cas
du
stade
urédien
chez
Melampsora
 larici­populina.............................................................................................................................................................................183
 
 Chapitre
V
:
Discussion
générale..............................................................................................................................201
 
 I
­
Analyse
du
développement
de
Melampsora
larici­populina
in
planta........................................203
 
 II­
Analyse
du
génome
de
Melampsora
larici­populina.................................................................................206
 
 III
­
Analyse
du
transcriptome
de
Melampsora
larici­populina..............................................................207
 1
‐
La
biotrophie,
principale
limitation
à
l’étude
de
l’expression
des
gènes
de
Melampsora
larici­ populina......................................................................................................................................................................................207
 2
‐
Identification
de
gènes
induits
durant
le
processus
infectieux...................................................................209
 
 IV
­
Analyse
du
secretome
de
Melampsora
larici­populina.........................................................................214
 1
‐
Identification
de
petites
protéines
secrétées
présentant
des
homologies
avec
des
effecteurs
 précédemment
caractérisés..............................................................................................................................................215
 2
‐
Identification
d’effecteurs
candidats
spécifiques
à
Melampsora
larici­populina
riches
en
cystéine
 et
sous
pression
de
sélection
positive...........................................................................................................................218
 3
‐
Identification
d’effecteurs
candidats
induits
in
planta....................................................................................221
 
 Conclusions
et
Perpectives............................................................................................................................................227
 
 Références
bibliographiques......................................................................................................................................233
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 8 Chapitre
I
:
Analyse
bibliographique
 
 1