UNIVERSIDADE DO ALGARVE FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA Compostos bioativos de microalgas com interesse no tratamento da diabetes Dissertação de Mestrado em Biologia Molecular e Microbiana Alexandre da Silva Gago 2016 UNIVERSIDADE DO ALGARVE FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA Compostos bioativos de microalgas com interesse no tratamento da diabetes Dissertação de Mestrado em Biologia Molecular e Microbiana Alexandre da Silva Gago Orientadores: Profª. Doutora Luísa Barreira Doutora Luísa Custódio 2016 AGRADECIMENTOS Ao Professor Doutor João Varela por ter aceitado a realização da minha tese no laboratório do grupo de investigação de Biotecnologia Marinha (MarBiotech, CCMAR); À Doutora Luísa Custódio (MarBiotech, CCMAR) pela orientação, críticas, sugestões e pela sua pronta disponibilidade; À Professora Doutora Luísa Barreira (MarBiotech, CCMAR) pela orientação, sobretudo na análise e interpretação de resultados; Ao Hugo Pereira (MarBiotech, CCMAR) pelo auxílio que prestou em relação à caracterização química; Ao Doutor Katkam (MarBiotech, CCMAR) pelo apoio na aprendizagem de técnicas cromatográficas; À Maria João Rodrigues (MarBiotech, CCMAR) pelo auxílio que prestou em relação aos ensaios espectrofotométricos; A todos os colegas de laboratório, incluindo Catarina Pereira, Vanessa Neves, Tamára Santos, Marta Oliveira, Peter Schulze e Ana Raposo. Para todos os que contribuíram para a realização deste trabalho, Um muito obrigado! COMPOSTOS BIOATIVOS DE MICROALGAS COM INTERESSE NO TRATAMENTO DA DIABETES Mestrado em Biologia Molecular e Microbiana Declaração de Autoria do Trabalho Declaro ser o autor deste trabalho, que é original e inédito. Autores e trabalhos consultados estão devidamente citados no texto e constam da listagem de referências incluída. Alexandre Gago Alexandre da Silva Gago Direitos de cópia ou Copyright @ Copyright: Alexandre da Silva Gago A Universidade do Algarve tem o direito, perpétuo e sem limites geográficos, de arquivar e publicitar este trabalho através de exemplares impressos reproduzidos em papel ou de formato digital, ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser inventado, de o divulgar através de repositórios científicos e de admitir a sua cópia e distribuição com objetivos educacionais ou de investigação, não comerciais, desde que seja dado crédito ao autor e editor. ÍNDICE ACRÓNIMOS ......................................................................................................................... vii RESUMO ................................................................................................................................. ix ABSTRACT ............................................................................................................................. x 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1 1.1. Microalgas ................................................................................................................... 1 1.2. Compostos bioativos das microalgas ........................................................................ 1 1.3. Microalga utilizada neste trabalho ............................................................................ 3 1.4. Diabetes – cenário atual ............................................................................................. 4 1.5. Digestão de glícidos e enzimas envolvidas ................................................................ 6 1.6. Fatores de risco da diabetes ....................................................................................... 6 1.6.1. Obesidade ................................................................................................................. 6 1.6.2. Stress oxidativo ........................................................................................................ 7 1.7. Metabolismo do ferro e do cobre .............................................................................. 9 1.8. Inibidores naturais das enzimas alfa-amilase e alfa-glucosidase ......................... 10 1.9. Objetivo geral ........................................................................................................... 13 1.9.1. Objetivos específicos ............................................................................................. 13 2. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 14 2.1. Material biológico e preparação dos extratos ........................................................ 14 2.2. Determinação da atividade antidiabética in vitro .................................................. 14 2.2.1. Determinação da atividade inibitória na enzima alfa-glucosidase ........................ 15 2.2.2. Determinação da atividade inibitória na enzima alfa-amilase ............................... 15 2.3. Determinação da atividade inibitória na enzima lipase ........................................ 16 2.4. Determinação da atividade antioxidante ................................................................ 16 2.4.1. Atividade de captura do radical DPPH ................................................................ 16 2.4.2. Atividade de captura do radical do NO ................................................................. 17 2.4.3. Atividade de captura do radical ABTS+ ............................................................... 18 2.5. Determinação da atividade quelante de iões metálicos ......................................... 18 2.5.1. Determinação da atividade quelante de ferro ........................................................ 18 2.5.2. Determinação da atividade quelante de cobre ........................................................ 19 2.6. Fracionamento dos extractos ................................................................................... 19 2.7. Identificação e análise de pigmentos pelo HPLC .................................................. 20 2.8. Identificação e análise de compostos pelo GC-MS ................................................ 21 2.9. Análise estatística ..................................................................................................... 21 3. RESULTADOS ................................................................................................................... 22 3.1. Extração e fracionamento ........................................................................................ 22 3.2. Atividade antidiabética ............................................................................................ 23 3.2.1. Inibição enzimática das frações ............................................................................. 23 3.2.2. Inibição da alfa-glucosidase .................................................................................. 25 3.2.3. Inibição da alfa-amilase ........................................................................................ 26 3.2.4. IC da atividade antidiabética .............................................................................. 27 50 3.3.Atividade antioxidante .............................................................................................. 28 3.3.1. Captura do radical DPPH ..................................................................................... 28 3.3.2. Captura do radical ABTS+ .................................................................................... 29 3.3.3. Atividade quelante para o ferro ............................................................................. 30 3.3.4. Atividade quelante para o cobre ............................................................................ 31 3.3.5. IC da atividade antioxidante ................................................................................ 32 50 3.4.Determinação de pigmentos por HPLC .................................................................. 33 3.5.Caracterização química por GC-MS ....................................................................... 33 4. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 35 4.1. Inibição enzimática .................................................................................................. 35 4.2. Atividade antioxidante e quelante (Fe2+ e Cu2+) ..................................................... 36 4.3. Caracterização química ........................................................................................... 38 5. CONCLUSÃO E PERSPETIVAS FUTURAS ............................................................ 40 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 42 ACRÓNIMOS ABTS+ Ácido 2.2’-azino-bis-(3-etilbenzotiacolina-6-sulfónico) AGE Produtos finais da glicosilação avançada (do inglês, Advanced glycation end- products) ALA Ácido alfa-linolénico BHT Butil hidroxitolueno DHA Ácido docosahexaenóico DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês, Deoxyribonucleic acid) DPPH 1,1-difenil-2-picrihidrazilo EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético EP Erro padrão EPA Ácido eicosapentaenóico ERO Espécies reativas de oxigénio FDA Do inglês, Food and Drug Administration GC-MS Cromatografia gasosa – espectrometria de massa (do inglês, Gas chromatography – mass spectrometry) GLUT4 Transportador de glucose tipo 4 HCL Ácido clorídrico HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência (do inglês, High Performance Liquid Chromatography) HPO Ácido metafosfórico 3 vii IDF Federação Internacional de Diabetes (do inglês, International Diabetes Federation) IP Índice de polaridade KI Iodeto de potássio LDL Lipoproteína de baixa densidade (do inglês, Low Density Lipoprotein) L-NAME Nω-Nitro-L-arginina metil éster cloridrato MSTFA N-Metil-N- (trimetilsilil) trifluoroacetamida NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (do inglês, Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) NGP p-nitrofenil-α-D-glucopiranósido NIST Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (do inglês, National Institute of Standards and Technology) NO Óxido nítrico PBS Tampão de fosfato salino PNP p-nitrofenil palmitato PTP Tirosina fosfatase 1B (do inglês, Protein-tyrosine phosphatase 1B) PUFA Ácidos gordos polinsaturados (do inglês, Polyunsaturated Fatty Acids) PV Violeta de pirocatecol TA Temperatura ambiente TLC Cromatografia em camada fina (do inglês, Thin Layer Chromatography) UV Ultravioleta viii RESUMO A diabetes é uma doença que afeta milhões de pessoas em todo o mundo e condiciona a qualidade de vida das mesmas. A diabetes tipo 2 tem merecido destaque pelo aumento da sua incidência e pelo facto de ser uma doença evitável. O tratamento atualmente resume-se a medicação específica juntamente com uma dieta bastante restritiva. As microalgas sendo conhecidas como tendo várias aplicações biotecnológicas, como a aquacultura e indústria farmacêutica, poderão ainda constituir uma fonte natural de compostos bioativos com propriedades antidiabéticas que poderão fornecer uma alternativa menos dispendiosa e com menos efeitos colaterais ao tratamento atual da diabetes tipo 2. Este trabalho visa avaliar as atividades biológicas de extratos orgânicos e aquosos preparados a partir de biomassa seca de Scenedesmus sp., nomeadamente antidiabética (inibição da α-amilase e α-glucosidase), antioxidante (captação dos radicais DPPH, ABTS e NO), quelante de ferro e de cobre e de inibição da lipase. Nos ensaios foi testado o extrato de etanol e frações resultantes do fracionamento em sílica do extrato etanólico. A fração 3A apresentou a maior atividade inibitória na α-glucosidase (IC = 0.29 mg/mL) e α-amilase 50 (IC = 0.80 mg/mL). O extrato cru de etanol revelou maior atividade antioxidante, 50 nomeadamente na capacidade de capturar os radicais DPPH (IC = 3.03 mg/mL) e ABTS 50 (IC = 2.41 mg/mL). Esta fração foi também a que revelou maior atividade quelante para o 50 ferro (IC = 1.10 mg/mL) e para o cobre (IC = 3.66 mg/mL). A composição química da 50 50 fração 3A foi analisada por HPLC e GC-MS tendo-se identificado 6 compostos, nomeadamente, neofitadieno, fitol, ácido α-linolénico, ácido palmítico, ácido araquidónico e ácido palmitelaidico. Os resultados mostraram que a Scenedesmus sp. é uma boa fonte de compostos bioativos com aplicação no tratamento da diabetes. No entanto, será ainda necessária uma melhor caracterização química da fração ativa e identificar o ou os compostos responsáveis pela atividade antidiabética. Palavras-chave: α-amilase, diabetes, α-glucosidase, microalgas, Scenedesmus sp. ix ABSTRACT Diabetes is a disease that affects millions of people throughout the world and affects the quality of life of the same. Type 2 diabetes has been highlighted by its increasing incidence and in that it is a preventable disease. The treatment currently boils down to specific medication with a very restrictive diet. Microalgae have several biotechnological applications, such as aquaculture and pharmaceutical industry, and can be a natural source of bioactive compounds with anti-diabetic properties that can provide a less expensive alternative, with fewer side effects alternative to the current treatment of Type 2 Diabetes. This study aims to assess the biological activities of an ethanolic extract prepared from dried biomass of Scenedesmus sp., namely anti-diabetic (inhibition of the α-amylase and α- glucosidase enzymes), antioxidant (scavenging of radicals DPPH, ABTS and NO), chelation of the redox metals iron and copper and inhibition of lipase. In the experiments the crude ethanol extract was tested and fractions resulting from silica column fractionation. Fraction 3A showed the greatest inhibitory activity against α-glucosidase (IC = 0.29 mg/ml) and α- 50 amylase (IC = 0.80 mg/ml). The crude ethanol extract showed a higher antioxidant activity 50 given its higher capacity to scavenge the radicals DPPH (IC = 3.03 mg/ml) and ABTS (IC 50 50 = 2.41 mg/ml). However, fraction 3A presented the higher chelating activity of iron (IC = 50 1.10 mg / ml) and copper (IC = 3.66 mg / ml). The chemical characterization of fraction 3A 50 by HPLC and GC-MS resulted in the identification of 6 compounds (neophytadiene, phytol, α-linolenic acid, palmitic acid, arachidonic acid and palmitelaidic acid). These results show that Scenedesmus sp. is a promising source of bioactive compounds with applications in the treatment of Type 2 Diabetes. However, a better characterization of the chemical composition of the active fraction should be performed and the compound or compounds responsible for the anti-diabetic activity should be identified. Keywords: α-amylase, diabetes, α-glucosidase, microalgae, Scenedesmus sp. x