昆 虫 学 报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$，!"#$%%&，’（( ’）：)’*+),’ -../%)’)0,$*, """"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""" 家蚕先天免疫基因 的克隆、表达及序列分析 !"#"$ 张雨丽，程廷才，许平震，黄璐琳，夏庆友! （西南大学农业部蚕桑学重点实验室，重庆 )%%1(,） 摘要：昆虫的先天免疫应答由一组基因通过级联网络调控实现。果蝇 -.’/’01+)$免疫缺陷（877AIF JFE8?8FI?#，87J） 基因在体液免疫信号传递途径中起着重要的作用。我们利用生物信息学方法进行电子克隆，成功地找到了 +(2基 因在家蚕3’(456(’.+中的同源体，命名为 3(+(2。该基因全长(%*$QH，由)个外显子和2个内含子组成，开放阅读 框（@HFIDF"J8IRED"7F，SOT）长1’%QH，编码$’%个氨基酸，预测蛋白质分子量为$&>, UV。4787J序列中含有一个致死 结构域，经聚类分析表明该结构域与哺乳动物的受体相互作用蛋白（DF?FHB@D8IBFD"?B8IRHD@BF8I，O-W）相似。将该基因亚 克隆到W6X0’%Q载体进行原核表达，表达出了带有$个,YZ8GB"R和(个/AG·X"R标签的重组蛋白。[FGBFDIQ9@BB8IR结 果表明4787J蛋白在’龄)天家蚕的头、脂肪体、生殖腺、表皮和中肠中都有表达，但丝腺中没有检测到表达。 关键词：家蚕；+(2基因；克隆；表达；先天免疫 中图分类号：\*,,；.&&(>$ 文献标识码：5 文章编号：%)’)0,$*（, $%%&）%’0%)’*0%1 !"#$%$&，’()*’++%#$ ,$- +’./’$0’ ,$,"1+%+ #2 !"#"$，,$ %$$,3’ %44/$%31 &’$’ %$ 35’ +%"67#*4，!%"&’( "%)# :Z5/] ;A0<8，3Z6/] X8IR03"8，^_ W8IR0:CFI，Z_5/] <A0<8I，^-5 \8IR0;@A!（‘F# .FD8?A9BAD"9 <"Q@D"B@D# @E 5RD8?A9BAD"9 !8I8GBD#，.@ABCMFGB _I8PFDG8B#，3C@IRL8IR )%%1(,，3C8I"） 89+3*,03：XCF ?"G?"JF @E 8II"BF 877AI8B# 8I @DR"I8G7G M"G DFRA9"BFJ Q# " GFB @E RFIFGN XCF RFIF 877AIF JFE8?8FI?# @E -.’/’01+)$ H9"#G "I 87H@DB"IB D@9F 8I BCF H"BCM"# @E CA7@D"9 877AI8B#N [F R@B " C@7@9@R @E -.’/’01+)$ +(2 ED@7 3’(456 (’.+ GA??FGGEA99# BCD@ARC /+)+"’ ?9@I8IR，"IJ I"7FJ 8B 3(+(2N XCF RFIF 8G ( %*$ QH 8I 9FIRBC，?@IG8GB8IR@E) FK@IG"IJ2 8IBD@IG，?@IB"8I8IR"ISOT@E1’% QH，FI?@J8IR"HD@BF8IM8BC $’% "78I@ "?8JG，"IJ BCF HDFJ8?BFJ 7@9F?A9"D MF8RCB 8G $&>, UVN 4787J ?@IB"8IG " JF"BC0J@7"8I，MC8?C 8G G8789"D B@ 7"77"98"I O-W Q# GFLAFI?F "I"9#G8GN WD@U"D#@B8? FKHDFGG8@I @E BCF RFIF DF?@7Q8I"IB M8BC G8K0Z8G B"R"IJ"/AG·X"RM"GGA??FGGEA99#?"DD8FJ@AB BCD@ARCGAQ0?9@I8IR 8IB@W6X0’%QPF?B@DN XCF DFGA9B@E[FGBFDI Q9@BB8IR GC@MFJ BC"B BCF RFIF M"GFKHDFGGFJ 8I CF"J，E"B Q@J#，RFD7FI，?AB8?9F "IJ78JRAB，QAB 8BGFKHDFGG8@I M"G I@B JFBF?BFJ 8I G89U R9"IJG @E BCF G89UM@D7N :’1 7#*-+：3’(456 (’.+；+(2；?9@I8IR；FKHDFGG8@I；8II"BF 877AI8B# 昆虫没有 4 和 X 淋巴细胞系统，因而不具有高 细胞内，最后合成效应分子，杀灭病原微生物。X@99 等动物的适应性免疫系统。但是，昆虫的先天免疫 途径主要由革兰氏阳性细菌和真菌激活，并产生防 系统却能够对微生物的感染作出快速有效的免疫应 卫素等抗菌肽；而 -7J途径主要应答革兰氏阴性细 答，以抗菌肽、抗病毒因子、凝集素、溶菌酶及蛋白酶 菌的侵染，并控制抗革兰氏阴性细菌的抗菌肽基因 抑制剂等多种活性因子，配合多种功能的血细胞建 （如V8HBFD8?8I）的表达（VF ]DFR@D8@ 7# $)N，$%%$）。 立起一个开放完整的防御体系。此过程主要通过激 -7J途径是在研究果蝇 -.’/’01+)$ 的一个隐性 活如X@99途径和 -7J途径的一些信号转导途径，级 突变体+(2（( 877AIF JFE8?8FI?#(，87J(）中的抗菌肽基 联传递和放大感染信号，并将信号从细胞外传递到 因表达时发现的，它在果蝇的体液免疫中起着重要 基金项目：国家“*12”计划项目（$%%’34($(%%%）；国家自然科学基金项目（2%)1%**(）；国家“&,2”计划项目（$%%,55(%5((&）；高等学校博士点基 金（$%%)%,$’%((） 作者简介：张雨丽，女，(*&$年((月生，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学，607"89：:;<&2$)=($,>?@7 !通讯作者 5ABC@DE@D?@DDFGH@IJFI?F，607"89：K8"L#=GMANFJAN?I 收稿日期 OF?F8PFJ：$%%10(%0%’；接受日期 5??FHBFJ：$%%&0%(0%1 TJ; 昆虫学报 18"#7/"+&+$+0%8#:%/%8# +)卷 的作用（!"#$%&’" !" #$(，)**+）。,#- 途径通过激活 =6FB&$’软件进行序列拼接延伸，经迭代检索到不能 ."/0123/"$’ 4$3&5（’ 67）8!9样转录因子调节抗菌肽基 延伸为止。预测基因的外显子、内含子结构采用 因的表达。果蝇 %&’ 基因编码一个 :; <=的蛋白， B%#T程序（ 7/5’"$ !" #$(，)**L）。预测结构域采用 >8末端部分含有一个致死结构域，该结构域与鼠和 DUF.Q软件（E&&@：00B#$’&("#H/8E"%-"/H"’A(-"0B#$’&0）。 人类?+ <=的受体相互作用蛋白（’"3"@&5’ %1&"’$3&%1A 预测分子量、等电点在 PN@$BK 网站（E&&@：003$( @’5&"%1B，.,CB）有较高的序列相似性（D&$1A"’ !" #$(， "N@$BK(5’A0&55/B0）进行。 )**+）。该致死结构域能与信号传递途径下游的 7$B !"# 实验材料 相关死亡结构域（7$B $BB53%$&"- -"$&E -5#$%1，7F==） 实验材料是家蚕大造品种，由本实验室饲养。 蛋白相互作用，形成配体8受体复合物（!"2/%"’ !" 于+龄T天解剖分离其头、表皮、丝腺、中肠、脂肪体 #$(，G;;G）。,#- 蛋白作用于遗传学定义的细胞内 和生殖腺，液氮速冻后保存于SL;V备用。 信号级联反应最顶部，该级联反应激活 ."/%BE 转录 !"$ 家蚕 $"!"# 基因的%&克隆及测序 因子（>5’H5 $1- !"I%1"，)**J；=2BE$K !" #$(，)**J； 用 Q’%W5/（购自 ,1I%&’5A"1）提取 .6F，U8U!X 7"’’$1-51 !" #$(，)**L）。(&’ 基因除了在免疫中起 （C’5#"A$）反转录为 3=6F 第一链，并以此 3=6F 为 着重要作用外，还有证据表明它还参与细胞凋亡 模板进行 C>. 扩增。所有步骤均按试剂盒说明操 （M"5’A"/ !" #$(，G;;)）。 作。引物序列为 7：+Y8A33AA$&33MM>>F>QQQFFFFF 昆虫幼虫营腐生生活和生长发育，其成虫通常 >FFFM8:（Y 下划线表示设计的 3#&Z"酶切位点）和 作为带菌者导致植物和动物疾病，而它自身却能有 .：+Y83A33&3A$AQQFMQQQQQQQ>FMFMQF>8:（Y 下划线 效地防御这些疾病，因此研究昆虫免疫防御机制是 表示设计的 6.+"酶切位点）。C>. 扩增条件为： 一项 重 要 的 工 程。以 黑 腹 果 蝇 )*+,+-.%$# 先*+V预变性+ #%1，然后 *TV变性 T; B、+TV退火 &!$#/+0#,"!* 为模式的昆虫免疫学研究起步较晚，许 +; B、?GV延伸) #%1，:+个循环，最后?GV终循环); 多研究都还处于初步阶段。昆虫体液免疫调控机制 #%1。C>.产物用 )[的琼脂糖凝胶电泳分离并回 仅仅在果蝇中得到初步确立，在其他昆虫如冈比亚 收纯化（鼎国胶回收试剂盒）。连接纯化的目的片段 按蚊 1/+-.!$!, 0#&2%#! 中证实了信号传递途径中一 到CU=)L8Q载体（Q$\$.$），连接产物转化至大肠杆 些基因的功能，途径中的大多数基因及其功能尚处 菌 7,8.!9%8.%# 8+$% ]U);*。阳性克隆经酶切鉴定和测 于推测阶段。家蚕 3+&245 &+*% 作为鳞翅目昆虫的 序验证，命名为 %#-0CU=)L8Q。 代表，是继果蝇和按蚊之后第三个完成全基因组测 !"’ 重组表达载体的构建及融合蛋白的诱导表达 序的模式昆虫。目前对家蚕体液免疫调控机制研究 %#-0CU=)L8Q 和 CPQ8+;H（ ^ ）原核表达载体 还比较少，至今未见有关家蚕 %&’ 基因的报道。我 （65I$A"1公司）经 3#&Z"和 6.+"酶切后，切胶回 们根据已公布的果蝇 %#-蛋白序列、家蛋的表达序 收目的片段，然后将两目的片段连接并转化到克隆 列标签（"N@’"BB"-B"O2"13" &$AB，PDQB）和基因组序列 宿主菌大肠杆菌]U);*中，筛选阳性克隆，测序验证 对家蚕先天免疫基因 %&’ 进行电子克隆及结构分 无任何碱基突变后命名为 %#-0CPQ8+;H。再将 %#-0 析，并进一步以原核表达系统为载体，表达和纯化 CPQ8+;H 质粒转化到 9!G)（=P:）表达宿主菌，;_T 9#%#-蛋白，制备抗体，并研究了 9#%#-蛋白在家蚕 ##5/0!异丙基8)8硫代8 8=8半乳糖苷（,CQM）、:?V诱 # 同一时期不同组织中的表达情况，为进一步研究 导%#-0CPQ8+;H09!8G) 重组菌表达蛋白。采用常规 %&’ 在家蚕先天免疫中的功能及家蚕体液免疫传递 D=D8CFMP电泳检测表达情况，浓缩胶浓度为 +[， 途径提供参考和依据。 分离胶浓度 )G_+[，考马斯亮蓝 .8G+; 染色显示蛋 白条带。 ! 材料和方法 !"( 融合蛋白的纯化及抗体制备 大量诱导 %#-0CPQ8+;H09!8G)重组表达菌，溶菌 !"! 家蚕 !"# 基因的序列分析 酶裂解细菌，按Q’%&51 ‘8);;法提取和洗涤表达的包 从美国国立生物技术信息中心 6>9（, E&&@：00 涵体蛋白后，经 D=D8CFMP 电泳分离、切取目的蛋 RRR(13H%(1/#(1%E(A5I）下载果蝇 %&’ 基因编码的氨 白、电洗脱纯化获得目的蛋白。以该纯化的蛋白为 基酸序列（6C +?::*T）。该序列与家蚕 PDQ数据库 抗原免疫健康的雄兔，初次免疫后加强免疫:次，经 S 进行 Q9!FDQ6 检索，挑选满足条件的序列，用 间接P!,DF法测定抗体效价达)a:;;;后采血，饱和 :期 张雨丽等：家蚕先天免疫基因 !"#"$的克隆、表达及序列分析 ,I$ 硫酸铵盐析法纯化抗体。 因库比较，检索到一条序列，编号为 ")F&$%G,H。再 !"# 组织蛋白的提取和$%&’%() *+,’’-).检测 以这两条序列为种子序列使用 "26#8D 程序去检索 液氮碾磨所保存的家蚕各组织后，用 !"# 缓冲 家蚕 =#8 库，将检索到的 =#8 序列再用 7D6#86@ 液溶解，$% &&& ’()*+、,-离心.& )*+，分离上清和沉 进行电子延伸，重复检索、延伸步骤直到不能延伸为 淀。上清为可溶蛋白，沉淀用裂解液（/ )01(2尿素， 止。最后检索得到 I 条 =#8序列，将其延伸拼接得 %3456!#，,3788）溶解。所提蛋白测定浓度后，按 到一条长度为 $ &H% FJ 的重叠群（图 $），命名为 等量上样进行$%9:3#7#;!6<=分析，然后将目的蛋 !"#"$ 基因。通过 K7D6 和基因组比对，!"#"$ 基 白电转移到 !>7?膜上，用上述纯化的抗体杂交，二 因由,个外显子和.个内含子组成，L@?位于.,%M 抗为5@!羊抗兔AB<（美国#*B)C），最后用76"显色。 $ &H%之间，长度为 G:& FJ。比较各条 =#8序列，发 现该基因有 G 个单核苷酸多肽性（N*+B1O +PK1O0Q*EO / 结果与分析 J01R)0’JS*N)，#D!）位点，其中位于 :T端非翻译区的 有：/.位的8;6，/,位的8;4；位于编码区的有：:$G /"! 家蚕 !"# 基因的电子克隆 位的<64;664（错义突变：D;7），I.&位的 648;644 使用 8"26#8D 程序将果蝇的 *)E 氨基酸序列 （同义突变：8;8），I/,位的 <<4;<<8（同义突变：<; 在家蚕的 =#8库里面进行同源性检索，检索得到一 <），IH.位的 868;864（同义突变：U;U）和 G.& 位的 条同源性高的=#8序列，再与家蚕基因组预测的基 <44;<48（同义突变：6;6）。 图$ !"#"$基因的=#8组装示意图 ?*BV $ 8SONKSO)CQ*K’OJ’ONO+QCQ*0+0W=#8CNNO)F1R0W !"#"$ 短箭头示#D!位置。8SOJ0N*Q*0+0W#D!*N)C’XOEY*QSNS0’QC’’0YSOCEV /"/ $"!"# 基因的克隆 通过D4"A的 F1CNQ程序进行在线蛋白质序列比 以反转录所得K7D6为模板对 !"#"$ 基因进 对，家蚕 ")*)E 与 D4"A上登录的拟果蝇 %&’(’)*#+, 行!4@扩增，在脂肪体中扩增效果最好，得到一条 (#"-+,.( 的 *)（E 66\I,G%:）、冈比亚按蚊 /V 0,"1#,2 G:& FJ的目的片段，大小与预计的相符合（图%：6）。 的 *)E（]Z ::G:HG）、黑腹果蝇 %V "2+,.’0,(32& 的 ^ 将!4@扩增得到的 7D6通过 $3琼脂糖凝胶电泳 *))P+O EOW*K*O+KR 4<::GI;!6（D! :G..H,）、斑马鱼 ^ 分离，切取目的条带纯化回收后，连接并克隆到 %,.#’ &2&#’ 的@A!（6"5$&/%.）、家鼠 4-( "-(5-+-( 的 !Z7$/;8载体上。挑取阳性克隆经酶切鉴定，能切 @A!（ 66"I&,/G）、人 类 6’"’ (,)#2.( 的 @A! 下一条G:& FJ 的片段（图 %："），最后将其测序验 （664:&$.G）和赤拟谷盗 7&#1’+#-" 5,(3,.2-" 的 证，结果该克隆 *)E(!Z7$/;8与预测一致。 N*)*1C’ Q0 4<::GI;!6（]! HG$/%H）的蛋白序列相似性 ^ /"0 序列分析 分别是 %H3，%G3，%G3，.%3，.&3，.H3和 %,3。 !"#"$ 全长$&H% FJ，由.个内含子和,个外显 使用 41PNQC1_对它们进行聚类分析表明 ")*)E 4;末 子构成，编码%:&个氨基酸，预测分子量和等电点分 端的致死结构域与哺乳动物的致死结构域蛋白 @A! 别为%/9I X7和 I9,:。在 #Z6@8 网站进行在线结 相似（图,）。 构域分析，发现 ")*)E在第 $:% 到 %,I 个氨基酸之 /"1 原核表达载体的构建及 23-34蛋白的诱导表 间含有一个致死结构域。通过 #*B+C1! 在线查找 达 （SQQJ：((YYYVKFNVEQPVEX(NO’[*KON(#*B+C1!(），!"#"$ 编 *)E(!Z7$/;8通过 8*’!和 !,"5!双酶切形 码的第$到$H个氨基酸为信号肽（图.）。 成粘性末端，然后亚克隆到 !=8;:&F原核表达载体， XU! 昆虫学报 %&’()*’+"+,+-#&(.#*#&( P,卷 转化到克隆宿主菌 M*,CN中，经测序验证无任何碱 基突变后确定为阳性克隆，命名为 &’()"O/.PC=。进 一步将 &’()"O/.PC= 质粒转化到表达宿主菌 0B!, （+OG），用 Q"/R 于 GST 诱导 &’()"O/.PC=)0B.!, 表 达重组蛋白，得到一个约NS D+的融合蛋白，其中标 签（含 ! 个 U V W&? ;92 和 , 个 HF?·/92）蛋白约 U- D+，目的蛋白约!N D+，与预测分子量相符合。而没 有诱导的 &’()"O/.PC=)0B.!, 则几乎没有相应的特 异条带，同样条件诱导的"O/.PC=)0B.!,空载体菌得 到约U- D+的标签蛋白（图P）。 !"# $%&’%() *+,’’-).检测家蚕组织中 -/0蛋白的 表达情况 采用 089(6<8(法（089(6<8(，,NSU）测定所提P龄X 图! !"#"$基因在脂肪体中的"#$扩增（%）和 天家蚕头、表皮、丝腺、中肠、脂肪体和生殖腺中的总 &’()"*+,-./酶切鉴定（0）结果 1&23 ! %’45&6&7(6892’7:;<6 !"#"$ =>"#$&:69; 蛋白含量，然后等量上样，电泳检测各组织上清夜 =<(>（%）9:(87?;8&@;&<:7:A>’7(&27?;&<:9:95>?&?<6 （可溶成分）和沉淀（不溶成分）蛋白。,!YPZ[+[. &’()"*+,-./（0） *：+B.!CCC*98D78；,：!"#"$片段/E76892’7:;<6 !"#"$； "%RO电泳蛋白样品，上样量统一为GYC 2总蛋白。 ! !：&’()"*+,-./质粒酶切"59?’&(<6&’()"*+,-./(&27?;7(=> 87?;8&@;&<:7:(<:F@579?7；G：&’()"*+,-./质粒"59?’&(<6 目的蛋白 0’&’( 的预测分子量是约 !N D+，电泳完 &’()"*+,-./3 后切取 GP D+ 和 ,N D+ 之间的胶进行电转膜和 图G !"#"$ 的@+H%序列及推导的氨基酸序列 1&23 G /E7@+H%?7IF7:@7?9:((7(F@7(9’&:<9@&(?7IF7:@7?<6 !"#"$ &:?&5DJ<8’ 箭头表示引物位置，竖线位置为内含子位置，双下划线部分表示为致死结构域位置，虚线部分为信号肽位置。 "8&’78.=&:(&:2872&<:?987’98D7(J&;E988<JE79(3 /E77K<:=<98(78?987&:(&@9;7(=>L78;&@95=983 /E7(79;E(<’9&:?&;7&?(<F=57.F:(785&:7(，9:(;E7?&;7<6?&2:95474;&(7&?’98D7(J&;E(9?E3 @期 张雨丽等：家蚕先天免疫基因 4*’*9的克隆、表达及序列分析 !BQ 图! "#$与人、鼠、斑马鱼%&’的氨基酸序列比对 (")* ! +,-.,/0,12")/#,/345"#$1/$%&’456.#1/，#4.7,1/$8,9:15"76 $&;<：拟果蝇 !"#$#%&’()$’*+(),$ "#$；$=>：黑腹果蝇 !**-(),#.)$/-" "##./,$,5"0",/0?=>@@ABC’D； 3E=>：赤拟谷盗 0"’1#(’+*2)$/),-+*+"#"21:34=>@@ABC’D；1&;<：冈比亚按蚊 3,#%&-(-$.)*1’)- "#$； &;<：家蚕 4#*156*#"’ "#$；#%&’：家鼠 7+$*+$2+(+$ %&’；6%&’：人类 8#*#$)%’-,$ %&’；8%&’：斑马鱼 !),’#"-"’#:,0,F34:C"/3,:103"/)F:43,"/* 动物体内均存在，因此，研究先天免疫的先驱者们都 认为昆虫先天免疫是由I422信号传递途径介导抗菌 肽的表达实现的。后来发现，’*9 突变体对革兰式 阴性细菌易感，但与I422突变体相比，则能更有效地 抵御革兰氏阳性菌和真菌的侵染。这一现象引起了 研究者的重视，对其进行深入研究发现了昆虫先天 免疫的另一条信号传递途径：&#$ 途径。&#$ 途径 就是以 ’*9 基因命名的。&#$途径由革兰氏阴性菌 激活，介导产生的抗菌肽（如天蚕素、果蝇肽等）抗革 兰氏阴性菌。虽然在哺乳动物中至今没有发现 &#$ 图@ "#$G’HIC@J9GKECLM诱导表达蛋白 途径，但研究表明 &#$途径与哺乳动物肿瘤坏死因 (")* @ I6,,NF:,77,$F:43,"/45"#$G’HIC@J9GKECLM M：蛋白质分子量标准’:43,"/#42,0.21:O,")63#1:P,:（24O）； 子受体（3.#4.:C/,0:47"7 51034: :,0,F34:7，IR(%7）信号 L：’HIC@J9GKECLM空载体诱导&/$.0,$’HIC@J9GKECLM； 传递途径相似，因为这两条途径的各组成成分在结 Q："#$G’HIC@J9GKECLM没有诱导R4/C"/$.0,$45"#$G’HIC@J9G 构和功能上都很相似（T455#1// 1/$%,"0661:3，LJJL）。 KECLM；!："#$G’HIC@J9GKECLM诱导&/$.0,$"#$G’HIC@J9GKECLM* 据目前推测，&#$ 通路是按如下方式进行传递 箭头所指处为目的蛋白I6,1::4O"/$"013,731:),3F:43,"/* 的：跨膜识别蛋白识别入侵的病原微生物（革兰氏 S,73,:/ 92433"/)杂交（图B：D，K）。其中，K#"#$都存 阴性细菌）后，与之结合，形成病原C识别蛋白复合 在于组织蛋白可溶部分，不溶部分没有检测到杂交 物，此时识别蛋白被活化。活化的识别蛋白胞内结 信号。K#"#$蛋白在头、脂肪体、生殖腺和表皮中都 构域直接结合 "#$，使 "#$活化，感染信号由此从细 有表达，中肠中也有很微弱的表达，而丝腺中没有检 胞外传递到细胞内。该信号继而通过转录生长因子 测到表达。 激酶（M 3:1/754:#"/) ):4O36 51034:C C103"U13,$ P"/17,M， ! ! ! 讨论 IDVM）传递给 R(C"K 激酶抑制物复合物。最后，该 信号导致转录因子 %,2"76 被复合物磷酸化或被 先天免疫传递途径中的I422途径在昆虫和哺乳 <:,$（$ 一种含致死结构域的果蝇胱天蛋白酶）与 F!F 昆虫学报 *+"#,-".&.$./(+#0(-(+# G?卷 图! 家蚕各组织总蛋白"#"$%&’(（&）和)*+,*-./01,,2.3杂交结果（4） 5236! 7*+80,194:2:;<-1,*2./="#"$%&’(（&）>.;)*+,*-./01,,2.3（4）2.;299*-*.,,2++8*+ ?：预染蛋白质分子量标准%-*+,>2.*;<-1,*2.:10*@80>-A*23B,:>-C*-；D：头上清"8<*-.>,>.,19B*>;；E：表皮上清"8<*-.>,>.,19@8,2@0*；F： 中肠上清"8<*-.>,>.,19:2;38,；G：脂肪体上清"8<*-.>,>.,199>,/1;=；!：丝腺上清"8<*-.>,>.,19+20C30>.;；H：生殖腺上清"8<*-.>,>., 193*-:*.；I：头沉淀#*<1+2,19B*>;；J：表皮沉淀#*<1+2,19@8,2@0*；?K：中肠沉淀#*<1+2,19:2;38,；??：脂肪体沉淀#*<1+2,199>,/1;=； ?D：丝腺沉淀#*<1+2,19+20C30>.;；?E：生殖腺沉淀#*<1+2,193*-:*.6 5&## 形成的复合物水解而激活。被激活了的 够作用于上游的受体$配体复合物（#*S2. !" #$6， 7*02+B转运到细胞核内，并与#L&结合，启动抗菌肽 DKKK；%1=*, !" #$6，DKKK；TB>.3 !" #$6，DKKK）。4:2:; 基因的转录（’*+*00@B*. !" #$6，DKKG）。 的致死结构域与受体 7M%相似，暗示 4:2:;可能是 但是 M:; 途径的组成分子仅有很少部分被定 家蚕先天免疫信号传递途径中的一种配体，并推测 义，因为进行上位分析很困难，而且大多数组成成分 4:2:;蛋白也能够直接与该途径中上游的病原$跨 在亚细胞定位方面缺乏数据（N*:>2,-* >.; O199:>..， 膜识别蛋白复合物发生作用，将刺激信号从细胞外 DKKH），所以还有许多研究有待于开展和深入。%&’ 传递到细胞内。 基因是该信号途径中的关键基因，对该基因功能的 随着基因工程技术的发展，利用原核表达载体 研究具有重要意义。果蝇 (&’ 隐性突变体的存在， 获得大量外源蛋白，是科研和生产中简便而廉价的 为对该基因的研究提供了便利。但由于 (&’ 基因 方法。本研究中采用 %(Q$GK/ 为载体，表达的融合 在各物种中的同源性较低，对它的广泛研究比较困 蛋白约JI C#，去除标签蛋白后的目的蛋白约DJ C#， 难，所以在除果蝇和按蚊的其他物种中几乎没有关 与预测分子量 DIU! C#相符合，并且与果蝇 (&’ 基 于该基因的研究报道。 因编码一个EK C#蛋白的报道相一致。M:;途径不 本研究首次电子克隆得到家蚕 (&’ 基因，基因 仅参与全身性体液免疫，还参与了局部免疫。当有 全长? KJD /<，P75长HGK /<，编码DGK个氨基酸，由 活的微生物造成家蚕轻微损伤时，其天蚕素在表皮 F个外显子和 E 个内含子构成。比较各 ("Q 证据， 下边的上皮细胞中被诱导转录，这种诱导局部抗菌 发现该基因有H个 "L%位点，但只有一个由谷氨酸 肽基因的表达，由革兰氏阴性菌自然感染机体激发， 突变为谷氨酰胺的错义突变外，其他几个均为同义 并由 M:; 途径介导产生（QV18 !" #$6，DKKK；W.9*0, 突变。同源性分析发现家蚕 (&’ 与果蝇、按蚊和赤 Q2.3S>00 !" #$6，DKK?）；而且有报道说 (&’ 参与细胞 拟谷盗同名基因间的氨基酸相似性分别只有DJR， 凋亡（’*1-3*0 !" #$6，DKK?）。我们还在 :7L& 水平 DHR和DFR，说明 (&’ 基因在各个物种之间的同源 调查过 )&(&’ 在 G 龄 F 天家蚕各组织中的表达情 性较低。通过预测得到4:2:;与果蝇的2:;蛋白一 况，实验结果表明各组织中都有表达（未发表数据）， 样，具有一个致死结构域。该结构域与斑马鱼和哺 所以推测 4:2:; 蛋白可能在各个组织中也都有表 乳动物的 7M%相似。7M%是与肿瘤坏死因子受体和 达。)*+,*-. /01,,2.3 检测家蚕组织中 2:; 蛋白的表 5>+相互作用的蛋白，它们的相互作用激活L5$!4转 达情况，表明4:2:;蛋白在G龄F天的家蚕头、脂肪 录因子。与 QL57信号途径的7M%作用相似，M:;能 体、生殖腺和表皮中都有表达，中肠中也有很微弱的 !期 张雨丽等：家蚕先天免疫基因 ("!"#的克隆、表达及序列分析 "-! 表达，但丝腺中没有检测到表达，可能是因为 !龄 " %;516%543%251A%;54$1%= &4’4234 %2& ;%2 0$(7(54 %0(05(313. -,2. @,’’， 天的家蚕丝腺细胞的活动已主要集中在合成丝蛋白 *（I *）：!I\D!*"H V434==;842_，N:5542K4:=4$J，X54;K4=)，S4=54T，#(:5$(3)，BII!H /2 上，其他功能的基因表达量已降低或不再表达。 MT/1254$’4$42;43;$4421&4251’143 3%+!A!5).)B$0)05)/!/:.)5,!% B %3% 目前我们还不了解家蚕先天免疫信号传递途径 $4<:=%5($(’ 122%54 177:24 31<2%=12< 12 -.)/)0+!’&. 71(8 ?,0.，- 中的基因之间是如何作用的。!"# 基因的克隆和分 （*I）：+,+D+C"H 析，原核表达得到该基因表达的蛋白质，能为进一步 Z(’’7%22 F/，M41;88%$5 F)，BIIBH -.)/)0+!’& 122%54 177:215@：%2 在家蚕中研究其功能、与其他基因间的相互作用和 46(=:51(2%$@04$304;5164. ;&5. 3""4%)’.，\：*B*D*B-H G47%15$4 #， Z(’’7%22 F，BII,H P84 8(35 &4’4234 (’ -.)/)0+!’& 家蚕先天免疫研究提供一定极有价值的线索。 ",’&%)C&/5,.. $%%. ?,2. 3""4%)’.，B!：-+,D,"\H 参 考 文 献（!"#"$"%&"’） G47%15$4#，N$(74$?)45><4$W，)1;8%:5G，T1;(=%3W，)41354$)，V4($<4= S，M41;88%$5F)，Z(’’7%22F/，*++!H /$4;4331647:5%51(2，177:24 #$%&’($&))，*+,-./ $%01& %2& 342315164 7458(& ’($ 584 9:%2515%51(2 (’ &4’1;142;@（17&），&4’1243 5U( &13512;5 ;(25$(= 0%58U%@3 12 584 71;$(<$%7 9:%2515143 (’ 0$(5412 :51=>12< 584 0$12;10=4 (’ 0$(5412?&@4 -.)/)0+!’& 8(35&4’4234. :.)*. ;&5’. $*&#. <*!. =<$，+B：+"-!D A12&12<.$%&’.(!)*+,".，,B：B"CDB!". +"-+H E($A(FE，G46124)，*++-H E8%$%;54$1>%51(2(’%2177:2(?&4’1;142;@7:5%25 G4:=14$ Q，_1&%= X，X%1<( N，]4&% M，G47%15$4 #，BIIBH R2&:;1A=4 12 -.)/)0+!’&. 1,*+. -,2.，!!：B**DBBIH 4‘0$4331(2(’ &(:A=4?35$%2&4& MT/ $464%=3 % $(=4 ’($ &Q/JJ 12 584 J4612/，E((K /，G12 L，M(&$1<:4> L，N4==184$ )，G1: O，BIIIH P84 $4<:=%51(2 (’ 584 %251A%;54$1%= $430(234 12 -.)/)0+!’& %&:=53. @4... &13512;5$(=43(’PM/QB%2&MRS12RNN%;516%51(2A@PTQ?M*：PM/QB (!)’.，*B：++-D*IIIH $4;$:153RNN5(PTQ?M*U81=4MRS74&1%543RNN%;516%51(2. 3""4%!56， a2’4=5P12<6%==P，M((3W，W2<35$b7L，BII*H P84 !"#<42413$49:1$4&’($ *B："*+D"B+H =(;%= @,*.)0!%4‘0$4331(212 -.)/)0+!’&A%$$14$401584=1%. 71(8?,0.， J4V$4<($1(W，X04==7%2SP，P>(:S，M:A12V)，G47%15$4#，BIIBH P84 （B \）：B\+DB"\H P(==%2&R7&0%58U%@3%$45847%Y($$4<:=%5($3(’584177:24$430(234 S(@45 FG，X$1216%3:=% X)，G12 FZ，Q4$2%2&43?/=247$1 P，L%7%(K% X， 12 -.)/)0+’!&. 71(89.，B（* **）：B!-CDB!+,H P31;8=13ST，/=247$1WX，BIIIH /;516%51(2(’584R!#K12%343A@MRS J:38%@)X，/3=12<#，Z:=57%$KJ，*++-H [$1<123(’177:215@：M4=138，% 61%RNN"cTW)[?74&1%54&(=1<(74$1>%51(2. 9. (!)’. @+,".，B,!：\, ;(70(:2& M4=?=1K4 <424 12 584 %251A%;54$1%= &4’4234 (’ -.)/)0+!’&. +--D\,+,,H :.)*. ;&5’. $*&#. <*!. =<$，+\：*I\"\D*I\",H X5%2<4$#O，G4&4$S，G44PZ，N17W，X44&#，*++!H MRS：%2(64=0$(5412 Q4$$%2&(2 J，F:2< /E，E$19:1 )，G47%15$4 #，]5542U41=4$?F(3408 X， ;(25%1212< % &4%58 &(7%12 58%5 1254$%;53 U158 Q%3c/S[?*（EJ+!）12 )1;8%:5 G，M41;88%$5 F，Z(’’7%22 F/，*++CH / &$(3(7@;12?VQS @4%35%2&;%:343;4==&4%58. @,’’，C*：!*\D!B\H $40($54$5$%23<424$464%=3%=(;%=177:24$430(23412 -.)/)0+!’& 58%513 P>(: S，[8$4334$ X，Q4$$%2&(2 J，E%0(61==% )，M41;88%$5 F)，BIIIH 2(5&4042&425(2584P(==0%58U%@. 71(89.，*,：*B*,D*BB,H P133:4?304;1’1; 12&:;1A=4 4‘0$4331(2 (’ %25171;$(A1%= 04051&4 <4243 12 Q=($4%G，Z%$5>4== V，O8%2<O，M:A12 V)，)1==4$ ^，*++CH /;(70:54$ -.)/)0+!’& 3:$’%;4401584=1%. 3""4%!56，*\：,\,D,"CH 0$(<$%7’($%=1<212<%;JT/349:42;4U158%<42(71;JT/349:42;4. O8%2<Xd，N(6%=42K( /，E%25%$4==% V，^%==%;8 J，BIIIH M4;$:157425 (’ >,%)",?,/.，（C +）：+-,D+,"H 584RNN 31<2%=(3(74 5( 584 0!! PTQ $4;405($：MRS %2& /BI A12& 5( V4($<4=S，T%15>% X，N%00=4$ E，Q4$$%2&(2 J，O%;8%$@ J，XU1774$ E， TW)[（RNN"）:0(2$4;405($3517:=%51(2. 3""4%!56，*B：\I*D\**H N(0;>@23K1 E，J:@K V，M41;88%$5 F)，Z(’’7%22 F/，BII*H -.)/)0+!’& 177:24 &4’1;142;@（R)J）13 % &4%58 &(7%12 0$(5412 58%5 （责任编辑：赵利辉）