云 南 植 物 研 究 2008, 30 (6): 706～712 Acta Botanica Yunnanica DOI: 10.3724 SP.J.1143.2008.08037 苎麻细胞质雄性不育“三系”ISSR 特异 片段克隆和序列分析 段继强1,2 , 李建永1 , 吴丽艳1 , 梁雪妮1 , 刘飞虎1 (1 云南大学 植物改良与应用实验室, 云南 昆明 650091; 2 怒江州食品药品监督管理局, 云南 怒江 673100) 摘要: 利用 ISSR分子标记技术对苎麻细胞质雄性不育“三系”mtDNA进行多态性分析; 在选用的 38 个 IS- SR引物中, 有6 个引物的扩增产物在不育系、保持系和恢复系之间存在差异。对这些特异性片段进行克 隆和序列测定, 结果表明: 片段 21-MS全长956 bp, 包含一个 525 bp的完整编码区, 共编码 174 个氨基酸。 片段31-M R 全长778bp, 包含一个404 bp的不完整编码区, 共编码134 个氨基酸; 其核苷酸和氨基酸序列 与已报道的多种植物中的番茄红素β-环化酶基因分别存在71%～76%和 73%～77%的同源性。 关键词: 苎麻; 线粒体 DNA; 简单重复序列间区; 番茄红素β-环化酶; 细胞质雄性不育 中图分类号: Q 75 文献标识码: A 文章编号: 0253 -2700 (2008) 06 - 706 - 07 Cloning and Sequencing for ISSR Specific Fragments in Cytoplasmic Male Sterile, Maintainer and Restorer Lines of Ramie ( Boehmeria nivea) 1,2 1 1 1 1** DUAN Ji-Qiang , LI Jian-Yong , WU Li-Yan , LIANG Xue-Ni , LIU Fei-Hu (1 Laboratory of Plant Improvement and Utilization, Yunnan University, Kunming 650091, China; 2 Nujiang Food and Drug Administration, Nujiang673100, China) Abstract: The polymorphic analysis of mtDNA from ramie cytoplasmic male sterile (MS), maintainer (M) and restorer (R) lines (three lines) were performed by using ISSR technique .Thirty-eight ISSR primers were used for testing mtDNA polymorphism and different amplified bands were observed in six primers in ramie“three lines”, these specific bands were cloned and sequenced .Among those bands, the fragment 21-MS (GenBank accession number: EU122345) had 956 bp in total length and a 525 bp intact coding region that encoded a polypeptide consisting of 174 amino acids .Fragment 31-M R (GenBank accession number: EU122344) had778bp in total length and a 404bp incompletely coding region that encoded a polypeptide consistingof 134 amino acids; this fragment had71%-76% and73%-77% of homology in nucleotide and amino acid sequences with lycopene beta-cyclase allozyme gene in many other plants . Key words: Ramie ( Boehmeria nivea) ; Mitochondrial DNA; Inter-simple sequence repeats (ISSR) ; Lycopene beta-cy- clase allozyme (Lyc-b) ; Cytoplasmic male sterile line 高等植物的细胞质雄性不育 ( Cytoplasmic 究结果表明, CMS 属于母性遗传, 与线粒体基因 male sterility, CMS) 是普遍存在的, 到目前为止 组密切相关, 但雄性不育的生理学和遗传学机制 已在 300 多种植物中发现 (Kaul, 1988)。大量研 还远未阐明。苎麻雄性不育特性早在 20 世纪 基金项目: 国家科技基础条件平台建设子项目—重要野生植物种质资源采集保存技术规范和标准研制及整合共享 (2005DKA21006) 和国家自然科学基金项目 (30360058) 通讯作者: Author for correspondence; E-mail: [email protected] 收稿日期: 2008- 03-13, 2008- 08-13 接受发表 作者简介: 段继强 (1981-) 男, 在读硕士研究生, 主要从事植物基因工程与遗传育种研究。 6期 段继强等: 苎麻细胞质雄性不育“三系”ISSR 特异片段克隆和序列分析 70 7 60～70 年代就被发现存在于若干地方品种之中 工作中从同一品种的孤雌生殖诱导后代中培育获得, 恢 (李宗道, 1989)。苎麻以收获营养体为目的, 其 复系则通过测交获得; 不育系经遗传分析推测为核 - 质 互作型不育 (刘飞虎等, 2000)。 杂种优势利用比其他收获种子的作物更为便利, 1.2 试剂 因此备受育种工作者重视 (刘飞虎等, 1998; 张 ISSR引物 (加拿大哥伦比亚大学提供序列) 由上海 中华等, 2005)。苎麻雄性不育杂种优势组合已 生工 (Sangon) 合成; dNTP、 Taq 酶为 MBI 公司产品; 应用于生产, 对其机理的研究主要集中在生理生 pGEM-T 载体及 T4 连接酶购自 Promega 公司; DNA 分子 化方面 (周瑞阳, 1999; 刘飞虎等, 2001; 宋军 量标准和胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公 等, 2007), 但雄性不育的分子基础研究还罕见 司; 大肠杆菌 DH5α为本实验室保存; 其它试剂均为国 报道。ISSR (inter-simple sequence repeats) 标记技 产分析纯。 术对简单重复序列 (simple sequence repeats SSR) 1.3 苎麻 mtDNA 提取 之间的 DNA 序列进行扩增。由于微卫星在基因 参考 Scotti 等 (2001) 的蔗糖衬垫法, 并加以改进 组中广泛分布, 而且等位变异特别丰富, ISSR 因 (段继强等, 2008)。 此可以检测到基因组多个位点的差异, 而且无需 1.4 ISSR-PCR 扩增 预知研究对象的基因组序列 (何予卿等, 2001)。 根据 ISSR反应体系优化结果设定 20μl PCR 反应体 系: 1×Taq酶配套缓冲液, 2.5 mmol L MgCl2 , 1.5 U Taq 本实验采用 ISSR 分子标记技术对苎麻胞质 酶 (MBI), 25 ng 模板 DNA, 0.75μlmol L 引物, dATP、 雄性不育系 (SS370)、保持系 (GS13-X ) 和恢 1 dCTP、dGTP、dTTP各 0.15mmol L。扩增程序为: 94℃预 复系 (细叶青) mtDNA 进行多态性比较, 对相关 变性5min, 94℃变性30s, 52℃退火45s, 72℃延伸80s, 特异性片段进行克隆和序列分析, 探讨这些特异 共40 个循环; 72℃完全延伸10 min。 片段与苎麻 CMS 的关系, 期望为揭示苎麻雄性 1.5 多态性比较分析 不育的分子遗传学机制积累资料。 选用 38个 ISSR 随机引物 (加拿大哥伦比亚大学提 供序列, 序列 (表 1), 先排除其中无条带和无多态性的 1 材料与方法 引物, 再对有多态性的引物作 2～4次重复, 最后选取重 1.1 材料 复性和稳定性较好的引物进行多态性比较分析。 选用苎麻 ( Boehmeria nivea (L .) Gaud .) 胞质雄性不 1.6 特异条带的回收、克隆和测序 育系 SS370 (A)、相应的保持系 GS13-X (B) 和恢复系 将差异片段用无菌消毒刀片在长波紫外灯下从琼脂糖 1 细叶青 (R)。其中不育系和保持系为项目组成员在前期 凝胶上切下, 用胶回收试剂盒进行纯化、回收。用pGEM-T 表 1 使用的 ISSR 引物 Table 1 ISSR primers used in this study Primer Sequence Primer Sequence ISSR-1 5′-(GCT)(AGT)(GCT)(CA) -3′ ISSR-22 5′-(CT) T-3′ ip 6 8 ISSR-2 5′-(AGC)(ACT)(AGC)(GT) -3′ ISSR-23 5′-(CT) (AG)G-3′ ip 7 8 ISSR-3 5′-(AGT)(GCT)(AGT)(GA) -3′ ISSR-24 5′-CGCC(GA) -3′ ip 7 6 ISSR-4 5′-G(CA) C-3′ ISSR-25 5′-(GGGGT) -3′ ip 4 3 ISSR-5 5′-(CT) (AG)G-3′ ISSR-26 5′-(GA) (CT)G-3′ ip 8 8 ISSR-6 5′-(CT) (AG)C-3′ ISSR-27 5′-(AT) C-3′ ip 8 8 ISSR-7 5′-CCC(GT) -3′ ISSR-28 5′-(GT) (CT)C-3′ ip 6 8 ISSR-8 5′-G(GC)G(GT) -3′ ISSR-29 5′-(CT) (AG)C-3′ ip 6 8 ISSR-10 5′-GC(AT)(GA) G-3′ ISSR-30 5′-(GAA) -3′ p 6 5 ISSR-11 5′-CCA(GAG) -3′ ISSR-31 5′-(AG) CG-3′ p 4 8 ISSR-12 5′-GCG(AC) A-3′ ISSR-32 5′-CCA(GAG) -3′ p 6 4 ISSR-13 5′-(TAT) -3′ ISSR-33 5′-GGA(GTG) -3′ p 5 4 ISSR-14 5′-(GGC) -3′ ISSR-34 5′-CCA(GTG) -3′ p 5 4 ISSR-15 5′-(AGC) -3′ ISSR-35 5′-(TG) (AG)G-3′ p 5 8 ISSR-16 5′-(ACTG) -3′ ISSR-36 5′-GCGCATATG(GACA) GC-3′ p 4 3 ISSR-18 5′-(TGCA) -3′ ISSR-37 5′-(GGAT) -3′ p 4 5 ISSR-19 5′-(GGGGT) -3′ ISSR-38 5′-(GATA) -3′ p 3 4 ISSR-20 5′-(AT) T-3′ ISSR-39 5′-(CAG) -3′ p 8 5 ISSR-21 5′-(CA) (AG)T-3′ ISSR-40 5′-(GGAGA) -3′ p 8 3 7 0 8 云 南 植 物 研 究 30卷 克隆载体连接并转化到感受态大肠杆菌 DH5α中; 涂布 于加有氨苄青霉素、IPTG及 X-gal 的抗性 LB平板上进行 蓝白斑筛选。挑取白色菌落, 在液体 LB 培养基中扩大 繁殖。用碱裂解法 (王关林和方宏筠, 2002) 从菌液中 提取质粒, 以通用测序引物 T7 和 SP6 进行常规 PCR 检 测。对阳性克隆进行序列测定 (由上海生工代为完成)。 1.7 序列分析 将测序得到的核苷酸序列用开放阅读框 (Open 图 1 苎麻 mtDNA 琼脂糖凝胶电泳检测 Fig . 1 Electrophoresis of ramie mtDNAs on agarose gel Reading Frame, ORF) 分析软件 ORF Finder ( http: ww- M:λDNA Hind Ⅲ DNA 标准分子量; 1: SS370 (雄性不育系); w.ncbi.nlm.nih.gov projects gorf) 查找其编码区 (即 ORF) ; 2: GS13-X (保持系); 3: 细叶青 (恢复系) 登陆GenBank, 用BLAST程序 (http: www.ncbi.nlm.nih.gov 1 M:λDNA Hind Ⅲ DNA Marker; 1: SS370 (Male sterile); BLAST) 对其核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行同源 2: GS13-X (Maintainer); 3: Xi Ye-Qing (Restorer) 性检索分析。 1 说明所提取的 mtDNA 的纯度较高, 可满足后续 2 结果与分析 实验的需要。 2.1 苎麻 mtDNA 纯度和完整性 2.2 苎麻“三系”mtDNA 的多态性分析结果 经琼脂糖凝胶电泳、EB 染色后可在紫外灯 在选用的 38 个引物中, 有 6 个无扩增产物或 下观察到 23 kb 左右的 mtDNA 带, 所含杂质少, 扩增产物带谱不清晰, 其它引物均能扩增出 1～6 没有出现大量降解的现象, 说明通过上述提纯方 条清晰可辨的条带。初选出 15 个具多态性的引 法, 能得到相对完整的线粒体 DNA (图 1)。 物, 再经多次重复, 只有 6 个引物能够扩增出具 根据经验数据, OD OD 比值在 1.7～1.9 260 280 有较高稳定性和重复性的多态性条带 (图 2)。 之间时, DNA的纯度较高 (金冬雁和黎孟枫译, 2.3 ISSR 特异片段的克隆及重组结果 1996)。测 定 所 提 取 的 mtDNA 的 OD OD , 260 280 SS370 为 1.84, GS13-X 为 1.78, 细叶青为 1.68, 回收并克隆引物 ISSR-21 的扩增产物中不育 1 图 2 苎麻“三系”mtDNA 的 ISSR-PCR 扩增结果 Fig .2 ISSR-PCR amplification of mtDNAs in ramie male sterile, maintainer and restorer lines M . DL250+ DNA标准分子量; 1 .SS370; 2 . GS13-X ; 3 . 细叶青; 白色箭头指示多态性条带 1 M . DL250+ DNAMarker; 1 .SS370 (male sterility); 2 .GS13-X (maintainer); 1 3 . Xi Ye-Qing (restorer); White arrows mark the polymorphic bands 6期 段继强等: 苎麻细胞质雄性不育“三系”ISSR 特异片段克隆和序列分析 70 9 系特异多出约 1 000 bp 的条带 (命名为: 21-MS, 以通用测序引物 T7 和 SP6 对重组质粒进行 下同); 引物 ISSR-23 的扩增产物中不育系特异 常规 PCR 检测, 得到一条与预期大小相符的扩 多出约 900 bp 的条带 (23-MS) ; 保持系和恢复系 增片段 (图 3) , 说明目的片段已成功地插入到 均多出约 500 bp 的条带 (23-M R01) 和 250 bp 的 了 pGEM-T 克隆载体中, 选取其中的阳性克隆进 条带 (23-M R02); 引物 ISSR-31 的扩增产物中保 行序列测定 (3～5 个重复)。 持系和恢复系均多出约 750bp 的条带 (31-M R); 2.4 ISSR 特异片段序列分析结果 引物 ISSR-35 的扩增产物中不育系特异多出约 测序结果经分析后, 除片段 21-MS 序列和 1400 bp 的条带 (35-MS), 保持系和恢复系均多 31-M R 序列外, 其它的 5 个特异片段均为无研 出约 1 000 bp 的条带 (35-M R)。 究意义的非编码序列。 图 3 苎麻“三系”ISSR特异片段重组检测 Fig .3 Recombination detection of specific fragments from mtDNA of ramie male sterile, maintainer and restorer lines M .D2000 DNA标准分子量; 1 .21-MS; 2 . 23-MS; 3 .23-M R01; 4 .23-M R02; 5 . 31-M R; 6 .35-MS; 7 . 35-M R M: D2000 DNAMarker; 1 .21-MS; 2 . 23-MS; 3 .23-M R01; 4 . 23-M R02; 5 .31-M R; 6 . 35-MS; 7 .35-M R 图 4 苎麻不育系特有片段 21-MS 核苷酸序列及其 ORF 编码的氨基酸序列 Fig . 4 Nucleotide sequence of specific fragment 21-MS from ramie male sterile line and the amino acid sequence encoded by its ORF Long grayframe shows the primer sequence; short gray frame shows the start codon and stop codon; gray shade shows the ORF deduced amino acid sequence 7 1 0 云 南 植 物 研 究 30卷 图 5 苎麻保持系与恢复系特有片段 31-M R核苷酸序列及其 ORF 编码的氨基酸序列 Fig .5 Nucleotide sequence of specific fragment 31-M R from ramie maintainer and restorer lines and the amino acid sequence encoded by its ORF Long gray frame shows the primer sequence; short grayframe shows the start codon; gray shade shows the ORF deduced amino acid sequence 片段 21-MS 序列 (GenBank 登陆号: EU122345) 州蜜橘 (AAN86060)、葡萄 (CAN69313)、番木 全长 956bp, A+ T含量为 57.85%。序列包含一个 瓜 (ABD91578)、烟草 (CAA57386) 等多种植物 525 bp 的完整编码区 (即 ORF, 位于 233 bp～757 中 Lyc-b 的部分氨基酸序列存在 73% ～77%的同 bp 区域), 共编码 174 个氨基酸 (图 4)。 源性 (表 2, 图 6)。 片段 31-M R 序列 (GenBank 登陆号: EU122344) 表 2 苎麻保持系和恢复系特有片段 31-M R 核苷酸及其编码 全长 778 bp, A+ T 含量为 55.14%。序列包含一 氨基酸序列与其它植物 Lyc-b 基因同源性比较 个 404 bp 的不完整编码区 (位于 375 bp～777 bp Table 2 Homology of nucleotide and deduced amino acid sequences of specific fragment 31-M R from ramie maintainer and restorer 区域), 共编码 134 个氨基酸 (图 5)。 lines with Lyc-b gene from other plants BLAST 分析表明, 21-MS 的核苷酸序列及其 Homology in nucleotide Homology in amino ORF 编码的氨基酸序列与以知基因同源性均低于 Taxon sequence (% ) acid sequence (% ) 50% , 表明该片段为不育系 (SS370) 特有的新 Citrus sinensis 76 75 Citrus unshiu 75 75 序列。31-M R 中的一段核苷酸序列 (位于 365 bp Vitis vinifera 75 77 ～773 bp 区域, 长 409 bp) 与甜橙 ( Citrus sinen- Carica papaya 74 73 sis, AY679168)、葡萄 ( Vitis vinifera, AM432668)、 Nicotiana tabacum 71 74 温州蜜 橘 ( Citrus unshiu, AY166796 )、番木 瓜 ( Carica papaya, DQ415894 )、 烟 草 ( Nicotiana 3 讨论 tabacum, X81787) 等多种植物中番茄红素β-环化 导致植物细胞质雄性不育的因素可能不止一 酶 (lycopene beta-cyclase allozyme, Lyc-b) 基因部 种。从前人研究结果来看, CMS 与线粒体基因组 分序列存在 71% ～76% 的同源性 (表 2) ; 其 的结构变化和新的嵌合基因的产生有关, 而其中 ORF 编码的氨基酸序列与甜橙 (AAU05146)、温 已经鉴定的与 CMS 相关的嵌合基因大多与 ATP 6期 段继强等: 苎麻细胞质雄性不育“三系”ISSR 特异片段克隆和序列分析 71 1 图 6 苎麻保持系和恢复系特有片段 31-M R 中 ORF 编码的氨基酸序列与其它植物Lyc-b 氨基酸序列同源性比较 Fig . 6 Homology of amino acid sequence deduced from OFR of specific fragment 31-M R from ramie maintainer and restorer lines with that of Lyc-b gene from other plants . Black shades mean 100% similarity; gray shades mean 75% similarity 合成酶或细胞色素 C 氧化酶有关, 如碧冬茄中 〔参 考 文 献〕 Cox 基因以及其他植物 atpA、 atp6、 atp9 基因等 (Pruitt 等, 1989; Kadowaki 等, 1990; Kohler 等, 马学军, 舒跃龙, 2005 . 精编分子生物学实验指南 (第 4 版) [M] .北京: 科学出版社, 56 1991; Mobr 等, 1993; Hanson and Bentolia, 2004; 王关林, 方宏筠, 2002 . 植物基因工程 (第二版) [M] .北京: 科 Kim 等, 2006)。前人对 CMS 的研究多用 RAPD 学出版社, 734—735 (杨剑波等, 2003; 王小利等, 2005; 张德双等, 李宗道, 1989 .苎麻生理生化与遗传育种 [M] . 北京: 中国农业 2006) 和 RFLP (Kadowaki and Harada, 1989; 危文 出版社, 158—167 亮等, 2005; 黄威等, 2006) 等技术, 利用 ISSR 金冬雁, 黎孟枫译 (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., 1995), 1996 . 分子克隆实验指南 (第二版) (Molecular Clone: 技术对 CMS 的研究少见报道。 a Laboratory Manual, 2th ed) [M] .北京: 科学出版社, 956 本研究利用 ISSR 分子标记技术对苎麻 CMS Hanson MR, Bentolia S, 2004 . Interactions of mitochondrial and nuclear “三系”mtDNA 进行了多态性比较分析, 在 6 个 genes that affect male gametophyte development [J] . Plant Cell, ISSR 引物中找到了不育系、保持系和恢复系之 16: S154—S169 间的差异片段 (图 2), 这些片段中有不育系特 He YQ (何予卿), Zhang Y (张宇) , Sun H (孙海) et al., 2001 . Studies on the relation ship between cultivated and wild Rice using 异缺失的, 也有不育系特异多出的。序列分析结 ISSR markers [J] . J Agric Biotechnol (农业生物技术学报), 9 果表明特异片段 21-MS 为不育系特有的新序列。 (2): 123—127 特异片段 31-M R 的编码区与一些植物的 Lyc-b HuanW (黄威), Wang L (汪莉) , Yi P (易平) et al., 2006 . RFLP 基因存在较高的同源性 (图 6), 而 Lyc-b 是将线 analysis for mitochondrial genome ofCMS-Rice [J] . ActaGenet Sin 性番茄红素转化为具环类胡萝卜素的关键酶 (梁 (遗传学报) , 33 (4): 330—338 Kadowaki K, Harada K, 1989 . Differential organization of mitochondrial 燕等, 2002)。植物中类胡萝卜素作为光捕获辅 gene in rice with normal and male-sterile cytoplasms [J] . Jpn J 助色素和光氧化作用保护剂, 在光合作用中发挥 Breed, 30: 179—186 重要作用; 同时它也是构成花、果色泽的主要色 Kadowaki K, Suzuki T, Kazames SA, 1990 . Chimeric gene containing 素; 有 些 类胡 萝 卜 素还 是 ABA 合 成 的 前 体 the 5′portion of atp6 is associated with cytoplasmic male sterilityof (Rock and Zeevaart, 1991)。若类胡萝卜素的合成 rice [J] . 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