昆虫学报!"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$!!"#$%&’(!()"*#$*’%-*%& ./0$’&1’+2)&34156781%&’(1&*1&&2 家蚕 N$)H% 家族基因 /*/:;;1的克隆及表达分析 张金叶’!%! 赵元’! 乔9梁’! 潘敏慧%!2! 鲁9成%!2!! "’]重庆师范大学动物生物学重庆市重点实验室!重庆A&’22’)%]西南大学家蚕基因组国家重点实验室!重庆A&&*’+) 2]西南大学农业部蚕桑功能基因组和生物技术重点实验室!重庆A&&*’+# 摘要" %目的&本研究旨在获得家蚕=’(?<K(’.+S6#F%家族同源基因!并分析其在不同组织和发育阶段的时空表达 模式及功能’ %方法&用6EL?末端快速扩增方法"YB\0. B;\#0V06BJ0/K /V6EL?UK.W! ‘?TI#克隆家蚕S6#F%家族基 因=(=>@@<!利用DD‘分子标记连锁分析确定其染色体定位’ 同时!用‘^FGT‘和kGT‘技术分析该基因在家蚕幼 虫及变态期间不同组织中的表达’ %结果&克隆获得全长家蚕S6#F%家族同源基因=(=>@@<!证明该基因位于第 A 号染色体上!开放阅读框长)*, 8\!编码%,% BB!预测其分子量大小为2%]A 5EB!等电点为,],A!且第’2&-%2’位氨 基酸之间存在’个S6#F%q#05UD"\UYVB;0#$结构域’ 系统进化发育树表明!其与黑腹果蝇-.’/’01+)$ (2)$&’*$/#2.的 -(=>@@<关系最近!氨基酸序列一致性为%*d’ =(=>@@<在幼虫组织中的表达结果显示!其在马氏管中表达量最 高!而且在不同组织变态期的关键时间点均有明显变化’ %结论&家蚕 S;S"VV$具有 S6#F% 家族典型结构域! =(=>@@<定位于第A号染色体上!S;S"VV$在家蚕变态期的组织生理变化中起到一定作用’ 本文为进一步研究家蚕 S6#F%家族基因的功能奠定基础’ 关键词" 家蚕) S6#F%家族) 基因克隆) 表达分析) 染色体定位 中图分类号" M,++99文献标识码" ?99文章编号"&A(AF+%,+"%&’(#&*F&*’%F&, G)’-0-/ (-3#524#&&0’-(-()1&0&’"N$)H< "(,0)1 /#-#/*/:;;10-%.# &0)L8’4,! /#*012 *#"’"M#203’2%#4($ N’,*1$03(## C>?LH!0KFNU’!%! C>?ON"BKF!"K’! MP?O<0BK:’! G?L_0KF>"0%!2! <XT=UK:%!2!!"’]T=/K:k0K: fU$<B8/YBJ/Y$/V?K0;B#S0/#/:$! T=/K:k0K:L/Y;B#XK0@UYW0J$! T=/K:k0K:A&’22’! T=0KB) %]DJBJU fU$<B8/YBJ/Y$/VD0#5[/Y;HUK/;US0/#/:$! D/"J=[UWJXK0@UYW0J$! T=/K:k0K:A&&*’+! T=0KB) 2]^=U fU$<B8/YBJ/Y$V/YDUY06"#J"YUb"K6J0/KB#HUK/;06WBK. S0/JU6=K/#/:$/V?:Y06"#J"YB#_0K0WJY$! D/"J=[UWJ XK0@UYW0J$! T=/K:k0K:A&&*’+! T=0KB# 6*&%4($%$ %?0;& ^=0WWJ".$B0;WJ/6#/KUBS6#F% VB;0#$;U;8UY:UKUVY/;J=UW0#5[/Y;! =’(?<K (’.+! BK. U7\#/YU0JWU7\YUWW0/K \Y/V0#UWBK. Y/#UW0K .0VVUYUKJ#BY@B#J0WW"UWBK. .U@U#/\;UKJB#WJB:UW/V J=U;/J=]%_UJ=/.W& =(=>@@<[BW6#/KU. "W0K:YB\0. B;\#0V06BJ0/K /V6EL?UK.W"‘?TI# ;UJ=/.] ‘^FGT‘BK. kGT‘[UYU"WU. J/.UJU6JJ=U:UKUU7\YUWW0/K \Y/V0#UW]^=U6=Y/;/W/;U#/6B#0ZBJ0/K /VJ=0W :UKU[BW6/K."6JU. "W0K:DD‘;BY5UYW]%‘UW"#JW& ^=US6#F% VB;0#$;U;8UY:UKU6#/KU. 0K =5(’.+[BW KB;U. =(=>@@<! [=06= 0W#/6BJU. /K 6=Y/;/W/;UL/]A! 6/.0K:B\Y/JU0K /V%,% BB[0J= BK UWJ0;BJU. ;/#U6"#BY[U0:=J/V(*]) 5EBBK. \P/V,],A]PJWUK6/.U. \Y/JU0K B#W/\/WWUWWUWBS6#F% #05UW"\UYVB;0#$ ./;B0K 8UJ[UUK ’2& -%2’ YUW0."UW]G=$#/:UKUJ06BKB#$W0WYU@UB#U. J=BJ=(=>@@<0W=/;/#/:/"WJ/ -(=>@@</V-.’/’01+)$ (2)$&’*$/#2.[0J= %*d B;0K/B60. WUk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’.+] 7#1 8’43&$ =’(?<K(’.+) S6#F% VB;0#$) :UKU6#/K0K:) U7\YUWW0/K \Y/V0#0K:) 6=Y/;/W/;U#/6B#0ZBJ0/K 基金项目$国家自然科学基金项目"2’’*%%+,!2’%*%(&(# 作者简介$张金叶!女!’,*,年,月生!河北保定人!博士!讲师!研究方向为细胞凋亡调控机制!IF;B0#$$4Z&,’+a’+2]6/; !通讯作者T/YYUW\/K.0K:B"J=/Y!IF;B0#$#"6=UK:aW["]U."]6K 收稿日期‘U6U0@U.$%&’(F&’F’()接受日期?66U\JU.$%&’(F&(F%& *期 张金叶等$ 家蚕S6#F%家族基因=(=>@@<的克隆及表达分析 99*’2 99S6#F% 家族作为一个细胞凋亡路径的重要调控 基因家族起着至关重要的作用!主要分为促凋亡和 9:材料与方法 抑凋亡因子’ 目前从秀丽隐杆线虫 ;$2&’.1$?7+#+/ 2)2*$&/到人类均发现了这一家族成员的存在!但在 9;9:供试材料 不同物种间数目相差悬殊!如在线虫中存在 2 个 家蚕胚胎组织细胞系 S;IFDRX’"GBK 2#$)]! "LU=;UBK. T/KYB.J!%&&)! T/#0K 2#$)]!%&&,#"’ 个 %&&(#由本细胞研究室建立(保种’ 大造 T’&)(大造 抑凋亡因子 TIEF,!% 个 S>2F/K#$因子$IH<F’ 和 茶斑"EBZB/q<#(大造鹑斑"EBZB/qk#品种由家蚕国 TIEF’2#!黑腹果蝇-.’/’01+)$ (2)$&’*$/#2.中存在% 家重点实验室家蚕资源库保种’ E>($菌株购自上 个"E;S"VV$和EUE6#F%#!而在哺乳动物中数目约为 海生物工程技术有限公司’ %& 个"fY/U;UY2#$)]! %&&*#!包括) 个 S>F2/K#$促 凋亡亚家族成员"S0.! SB.! S0;! S;V! >Y5! L85! 9;<:主要试剂 G";B和L/7B#"LU=;UBK. T/KYB.J! %&&)#!其余为 LBT#(fT#(NUBWJI7JYB6J及氨苄青霉素钠盐购 促凋亡因子*如 SB7"O#J@B02#$)]! ’,,2#!SB5 自上海生物工程技术有限公司)HYB6U昆虫细胞培 "T=0JJUK.UK 2#$)]! ’,,(#!S/5 和 S6#FQW+和抑凋亡 养基购自 HPSTO)胎牛血清购自德国 G??公司) 因子*如S6#F%"T#UBY$2#$)]! ’,)+#!S6#FQ<"S/0WU2# ^Y0Z/#试剂(‘?TI试剂盒购自 PK@0JY/:UK 公司) $)]! ’,,2#!_6#F’"f/Z/\BW2#$)]! ’,,2#!S6#F[!S6#F _:T#(<?^Bk 酶(QFHB#(PG^H(EL?片段纯化试剂 % S"fU2#$)]! %&&’#和 !’"fBYWBK 2#$)]! ’,,+#+’ 盒(\_E’)F^载体(EL?连接试剂盒(‘L?酶抑制剂 S6#F% 家族蛋白可以形成同源或异源二聚体结构!因 及基因组提取试剂盒购自大连宝生物公司)_F_<g 此它们可以以单体或二聚体形式发挥作用’ 促凋亡 反转录试剂盒(.L^GW购自 GY/;U:B公司)^YBKW%f 因子和抑凋亡因子之间的平衡发挥着决定细胞生死 G#"WEL?_BY5UY(质粒抽提试剂盒购自北京全式金 命运的关键作用!如人类中的抑制凋亡因子 S6#F7< 生物技术有限公司)胶回收试剂盒购自 O_IH?’ 和S6#F% 与SB5!SB.和 S0. 等促凋亡因子之间的相 互作用’ 所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成’ 虽然S6#F% 家族成员的功能不同!但在结构上 9;=:家蚕 N,!HIPQ9 细胞系总 FC6的提取及 有相似之处$一是羰基端有’ 个疏水的跨膜结构域! $BC6的合成 决定蛋白的亚细胞定位)此外家族成员的序列同源 用GSD 清洗密度为 )&d i,&d状态良好的 性体现在至少含有A 个保守S>区域中的’ 个"S6#F S;IFDRX’ 家蚕细胞’ i% 次后加入’ ;<^Y0Z/#!裂 % =/;/#/:$’ -A#"?.B;WBK. T/Y$! ’,,)#!S>’ 和 解!备用’ 家蚕各组织采用高温消毒后的手术剪和 S>% 结构域是抗凋亡蛋白必备的结构域!S>A 是抗 解剖针等工具于低温解剖!液氮速冻(研磨!取’&& 凋亡蛋白所特有的结构域"C=B/BK. M0BK! %&&(#! ;:加入’ ;<^Y0Z/#备用’ 细胞(组织总 ‘L?参照 同时在同源或异源性二聚体和离子通道的形成中发 ^Y0Z/#‘UB:UKJ试剂说明书方法提取’ 按照反转录试 挥着重要的作用’ 促凋亡成员除了S6#F7W缺乏S>A 剂盒操作说明合成6EL?第一条链’ 结构域外!其中 S0.!SB.!S05!SK0\2!>Y53E\,(! 9;>:家蚕基因组提取 L/@B!G";B!S0;和 S<f等仅含有 S>2 结构域!称 家蚕 基 因 组 提 取 步 骤 严 格 遵 循 ^BfB‘B 为/S>2 /K#$0成员’ 由于 S>2 在促进细胞的凋亡 _0K0SID^XK0@UYWB#HUK/;06EL?I7JYB6J0/K f0JgUY] 过程中有重要作用!所以也有学者根据 S>2 结构域 (]& 的使用说明进行操作’ 是否外露将S6#F% 蛋白家族分为S>2 外露型和S>2 9;?:生物信息学分析 隐藏型"_6E/KKU##2#$)]! ’,,,#"外露型促凋亡!隐 从美国国立生物技术信息中心 LTSP"=JJ\$33 藏型抑制凋亡#!S6#F% 蛋白属于 S>2 结构域隐藏 [[[]K680]K#;]K0=]:/@#下载其他物种 S6#F% 同源基 型’ 抑制凋亡成员结构中至少含有 S>’ 和 S>% 两 因!设IF@B#"U为&"由于物种间存在较大差异#!分 个结构域!S>A 结构域处于!端!形成了一个螺旋结 别与家蚕,Q基因组数据库(蛋白预测数据库(ID^ 构!是S6#F% 发挥抗凋亡作用的重要结构域’ 家蚕 数据库进行S#BWJG或 S#BWJK 比对分析)将初步得到 S6#F% 家族基因自 =(8’&,"^B;8"KBK 2#$)]! ’,,)# 的家蚕基因序列再次放到 LTSP数据库"=JJ\$33 被报道后!本课题组获得了家蚕的另外一个 S6#F% 8#BWJ]K680]K#;]K0=]:/@3S#BWJ]6:0#中进行在线比对! 同源基因!本文对此基因的克隆鉴定及其表达研究 如果预测家蚕基因和其他相应同源 S6#F% 基因的编 进行了详尽阐述’ 码蛋白具有相同或相似的结构域!则该家蚕预测基 99*’A 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ ()卷 因被认为是家蚕的 S6#F% 同源基因’ 根据预测的家 ’#) 以肌动蛋白 2 基因 "=(!"#+&32# 为内参’ 蚕S6#F% 同源基因序列设计引物!见表’’ 蛋白质多 =(=>@@<片段的GT‘扩增采用%( !<体系!反应条 序列比对分析使用 T#"WJB#Q"’])2#(基因 O‘b(酶 件为$,Ac预变性 2 ;0K),Ac变性 2& W!((c退火 切位点分析使用 S0/I.0J(系统进化树的构建使用 ’ ;0K!*%c延伸,& W!2& 个循环)*%c延伸’& ;0K’ _IH?A]& 软件)蛋白质结构域(等电点和跨膜区的 其 (o和 2o端序列的克隆严格按照 PK@0JY/:UK 预测分别使用在线工具 =JJ\$33[[[]U7\BW$]/Y:3 HUKU‘B6UY试剂盒操作程序进行’ 反应结束后!取 \Y/W0JU(=JJ\$33[[[]U7\BW$]/Y:3J//#W3\0qJ//#]=J;#和 ’ !<用’d的琼脂糖凝胶电泳检测’ 然后按照胶回 =JJ\$33[[[]68W].J"].53WUY@06UW3^_>__3’ 收试剂盒操作说明进行胶回收’ 将回收产物与 9;A:/*/:;;1基因全长的克隆 \_E’)F^载体 ’+c连接过夜!转化到大肠杆菌 以S;IFDRX’ 家蚕细胞的 6EL?为模板克隆 E>($感受态细胞!经蓝白斑筛选后挑取阳性菌落 获得=(=>@@<基因片段’ 在此基础上!以 =(=>@@< 提取质粒!通过GT‘和双酶切检测后送至上海英峻 片段为依据分别设计其 (o和 2o端 ‘?TI引物"表 基因有限公司测序’ 表9:本研究所使用的引物 D(*)#9:J40,#4&+&#30-%.#&%+31 引物名称 引物序列"(o"2o# 用途 产物长度"8\# GY0;UKB;U GY0;UYWUk"UK6U GY0;UY"WB:U GY/."6JW0ZU S;S"VV$Gb ^^TTH?TT?H?^??T?^^H =(=>@@<片段扩增 ,)) S;S"VV$G‘ ^^?H^TT?^^TT?^TT^TT =(=>@@<VYB:;UKJB;\#0V06BJ0/K HUKU‘B6UY(oq‘ ^^^T^T^TT??THTTHT?T?^?H =(=>@@<(o端扩增 A*+ HUKU‘B6UY(Koq‘ HTHH^T??HTHHTH???H?H =(=>@@<(oUK.B;\#0V06BJ0/K HUKU‘B6UY2oqb ?T^THT??H?THHH^T?T??HH =(=>@@<2o端扩增 **2 HUKU‘B6UY2Koqb T??H?THHH^T?T??HHH?H??T =(=>@@<2oUK.B;\#0V06BJ0/K LW6BV%,)2F_b ^^T?T^??T?TTH^T^??HT KW6BV%,)2多态性_BY5UY (%2 LW6BV%,)2F_‘ H^HTT?^T^?^T^^HH^?^T KW6BV%,)2 \/#$;/Y\=0W;_BY5UY LW6BV2&**F_b ^^THTT?^?HTHHT?^^H KW6BV2&**多态性_BY5UY *&% LW6BV2&**F_‘ HT?HT?H^H^T??H??HH^T?^ KW6BV2&** \/#$;/Y\=0W;_BY5UY L/]AF_b HTH^?T^^THT?HT?HH^^ 第A号染色体多态性_BY5UY %,% L/]AF_‘ ^??HT??H???^H?T?H?^H^?^H^???^ T=Y/;/W/;UL/]A \/#$;/Y\=0W;_BY5UY L/]*F_b ^TT??^^^H^H^H^^^H^?^H^H^H 第*号染色体多态性_BY5UY %A2 L/]*F_‘ HH^^H?H??HT??H^T^HTH?^? T=Y/;/W/;UL/]* \/#$;/Y\=0W;_BY5UY S;S"VV$kb ?THHH^T?T??HHH?H??T =(=>@@<kGT‘引物 %)+ S;S"VV$k‘ H??HH^T?^T?TH??H??^TT =(=>@@<kGT‘\Y0;UY UPbb ^^TH^?T^HHT^T^^T^TH^ =(=>@@<kGT‘内参引物 ’*A UPb‘ T???H^^H?^?HT??^^TTT^ =(=>@@<kGT‘YUVUYUK6U\Y0;UY S;?6J0KF2b ??T?TTTTH^TT^HT^T?T^H 内参引物 +++ S;?6J0KF2‘ HHHTH?H?TH^H^H?^^^TT^ ‘UVUYUK6U\Y0;UY 9;R:FDHJGF和SJGF检测 子A?基因为内参"表 ’#’ 反应体系为 ’& !<$ ‘^FGT‘以家蚕 ( 龄第 2 天幼虫不同组织的 DNS‘% GYU;07I7^Bk^_ PP( !<!正反向引物"’& 6EL?为 模 板! 以 家 蚕 =(=>@@<特 异 性 引 物 !;/#3<#各&]A !<!6EL?模板"A&& K:3!<#’ !<! S;S"VV$G进行 GT‘扩增"表’#!并以 =(!"#+&32 为 ..>O2]% !<’ 反应条件$,Ac预变性2 ;0K),Ac % 内参基因’ 反应程序如下$,Ac预变性2 ;0K),Ac 2& W!退火温度 +&c 2& W!2& 个循环)*%c终延伸 变性2& W!((c退火’ ;0K!*%c延伸,& W!2& 个循 ’& ;0K!反应结束后采集T值!利用%-&&TJ相对量法计 J 环)*%c终延伸’& ;0K’ 反应结束后!取’ !<扩增 算=(=>@@<相对表达量"<0@B5 BK. D6=;0JJ:UK!%&&’#’ 产物用’d的琼脂糖凝胶电泳检测’ 9;T:/*/:;;1基因片段与染色体形态标记的连锁 kGT‘以家蚕幼虫和变态期部分组织的 6EL? 分析 为模板!使用家蚕 S;S"VV$k 引物在 ?SP*&&& ‘UB#F 为了判断 =(=>@@<基因位于哪条染色体!本研 J0;UGT‘检测系统上进行!每个样品重复2 次)以无 究依据家蚕雌完全连锁的遗传学规律!分别选择第 菌水做模板为阴性对照!家蚕真核细胞翻译起始因 A 号染色体连锁表现型大造茶斑"EBZB/F<#(第* 号 *期 张金叶等$ 家蚕S6#F%家族基因=(=>@@<的克隆及表达分析 99*’( 染色体连锁表现型大造鹑斑"EBZB/Fk#雌性亲本与 大造野生型"T’&)#雄性亲本杂交组合!获得的 b <:结果 ’ 代雌性成虫分别与T’&) 及大造鹑斑"EBZB/Fk#雄性 亲本回交得到回交一代雌性"ST#群体)再在 ST <;9:/*/:;;1基因的核苷酸与氨基酸序列分析 ’ ’ 群体中分别选择茶斑(鹑斑和正常表型个体各’& 个 经过 (o和 2o‘?TIGT‘"图 %#得到全长为 用于=(=>@@<基因与第A 或第* 号染色体的连锁分 ’ +2% 8\的=(=>@@<6EL?序列’ 利用S0/I.0J软件 析"图’#’ 本研究在=(=>@@<基因片段所在W6BVV/#. 预测其 O‘b长为)*, 8\!编码%,% BB!在线蛋白质 附近设计GT‘标记引物进行多态性筛选’ 此外!为 分子量预测大小为2%]A 5EB!等电点为,],A’ 依据 了确保材料无误!我们首先选用已知第A 和第 * 号 拼接的O‘b设计引物进行克隆测序!得到了和拼接 染色体多态性标记 L/]AF_和 L/]*F_检测所用材 结果O‘b一致的结果’ 在线LTSP结构域分析结果 料’ 所用多态性引物见表’’ 表明!=(=>@@<编码产物的第’2& -%2’ 位氨基酸之 间有’ 个 S6#F%q#05UD"\UYVB;0#$结构域"图2#’ 由 此得出该基因属S6#F% 家族成员’ 通过;"W6#U比对 分析与_IH?A]& 软件邻接点法分析 S;S"VV$系统 进化关系"图(#!结果显示 S;S"VV$与昆虫中西方 蜜蜂!0+/(2))+@2.$ S"VV$的进化关系最近!故命名为 =(=>@@<)且与黑腹果蝇 E;S"VV$(人类 S/5 氨基酸 图’9家蚕野生型与突变型回交示意图 序列相似性分别为 A,d和 (’d!与黑腹果蝇 b0:]’9D6=U;BJ06.0B:YB;/VJ=U8B656Y/WW8UJ[UUK J=U -(=>@@<的氨基酸序列一致性为%*d’ 通过在线跨 [0#. J$\UBK. ;"JBKJWJYB0K EBZB//V=’(?<K(’.+ 膜 结 构 域 " =JJ\$33[[[]68W].J"].53WUY@06UW3 G$亲代GBYUKJW)k$大造鹑斑EBZB/k"B0#)<$大造茶斑EBZB/JUB ^_>__3#!结果表明在=(=>@@<的2o端有一段约为 W\/J)ST$回交一代b0YWJ8B65 6Y/WW:UKUYBJ0/K) R$ 野生型R0#. ’ %& BB的跨膜区"图A#!这很可能与 =(=>@@<的定位 J$\U)_$突变型_"JBKJ] 或功能有关’ 9;U:数据统计与分析 <;<:家蚕/*/:;;1基因的结构分析 所得数据采用 DGDD ’*]& 软件中的单因素方差 =(=>@@<基因由+ 个外显子组成!外显子3内含 分析"?LOg?! ^"5U$.W>DE! 8h&]&(#进行分析’ 子边界符合 H^F?H规则)生物信息学分析表明$整 图%9家蚕=(=>@@<全长扩增GT‘电泳图 b0:]%9T#/K0K:/VJ=UV"###UK:J= /V=(=>@@</V=’(?<K(’.+ ?$=(=>@@<片段GT‘电泳检测I#U6JY/\=/YUW0W/V=(=>@@<VYB:;UKJ$’$ E<%&&& _BY5UY)%$ =(=>@@<8GT‘结果GT‘YUW"#J/V=(=>@@<8]S$ =(=>@@<8重组质粒电泳检测I#U6J/\=/YUW0W/V=(=>@@<8F\_E’)F^YU6/;80KBKJ$’$ E<%&&& _BY5UY)%$ \_E’)F^质粒\_E’)F^\#BW;B)2$ =(=>@@<8滞后质粒=(=>@@<8YU6/;80KBKJ\#BW;B]T$=(=>@@<(o端‘?TI巢式GT‘电泳检测LUWJGT‘U#U6JY/\=/YUW0W/V=(=>@@<(o‘?TI$ ’$E<%&&& _BY5UY)%]=(=>@@<(o端‘?TI巢式GT‘LUWJGT‘/V=(=>@@<(o‘?TI]E$ =(=>@@<(o端‘?TI巢式GT‘滞后质粒电泳检测 I#U6JY/\=/YUW0W/VJ=UYU6/;80KBKJ\#BW;B/V=(=>@@<(o‘?TI$’$ ^/\/@U6J/Y质粒^/\/\#BW;B)%$ =(=>@@<(o端‘?TI巢式GT‘滞后质粒 ‘U6/;80KBKJ\#BW;B/V=(=>@@<(o‘?TI]I$=(=>@@<2o端‘?TI巢式GT‘电泳检测LUWJGT‘U#U6JY/\=/YUW0W/V=(=>@@<2o‘?TI$’$E<%&&& _BY5UY)%$=(=>@@<2o端‘?TI巢式GT‘LUWJGT‘/V=(=>@@<2o‘?TI]b$=(=>@@<2o端‘?TI巢式GT‘滞后质粒电泳检测I#U6JY/\=/YUW0W /VYU6/;80KBKJ\#BW;B/V=(=>@@<2o‘?TI$9’$ \_E’)F^质粒\_E’)F^\#BW;B)%$ =(=>@@<2o端‘?TI巢式GT‘滞后质粒‘U6/;80KBKJ \#BW;B/V=(=>@@<2o‘?TI] 99*’+ 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ ()卷 图29家蚕S;S"VV$的功能域预测 b0:]29b"K6J0/KB#./;B0K \YU.06J0/K /VS;S"VV$/V=’(?<K(’.+ 图A9家蚕S;S"VV$跨膜区域预测示意图 b0:]A9D6=U;BJ06.0B:YB;/VJ=UJYBKW;U;8YBKUYU:0/K /VS;S"VV$/V=’(?<K(’.+ 蓝色的线代表膜内区域)红色的线代表跨膜区域)紫色的线代表膜外区域’ ^=U8#"U#0KU0K.06BJUWJ=UYU:0/K0KW0.UJ=U;U;8YBKU!J=UYU.#0KU YU\YUWUKJWJ=UJYBKW;U;8YBKUYU:0/K!BK.J=U\"Y\#U#0KUYU\YUWUKJWJ=UYU:0/K/"JW0.UJ=U;U;8YBKU] 个基因位于 2 条 W6BVV/#. 上!跨越 % 条染色体"图 簇后第%’+ 小时的表达量却几乎检测不到!而上簇 +#! 其中 KW6BV%,)’ 和 KW6BV%,)2 同位于第* 号染 后第A) 小时表达量最高!达到极显著水平"图’&$ 色体上!而KW6BV2&** 位于第 A 号染色体上’ E#’ 在体壁和中肠中此时期虽有表达并都不是最 <;=:家蚕/*/:;;1基因在各组织与不同变态期的 高!其中!体壁中上簇后第%A& 小时!即化蛾前 ’ . 表达 达最高"图’&$ S#!呈极显著水平)中肠中它的表达 为了确认材料的准确性!我们利用第A 和* 号 量在上簇后第’AA 小时表达最高!较其他组织中的 染色体的已知多态性DD‘标记L/]AF_和L/]*F_ 表达量达到显著或极显著水平"图’&$ T#’ 此外! 对所用材料进行验证!结果显示两组材料 STb群 丝腺中它的最高表达量却在丝腺器官急剧退化时期 ’ 体中显性表型个体的带型与b带型一致!隐性表型 之前的%A =!即上簇后第%A 小时"图’&$ I#’ ’ 个体的带型与隐性雄亲带型相一致!表明材料无误 "图*#’ GT‘标记与染色体形态表达的连锁分析结 =:讨论 果显示$无论是基于KW6BV%,)2!还是基于KW6BV2&** 设计的标记均只与第A 号染色体形态标记 <连锁 本研究基于其他物种已发现的 S6#F% 家族成员 "图)#!而与第* 号染色体形态标记k独立遗传!这 和家蚕基因组数据库!运用生物信息分析计算方法 表明S"VV$基因片段所坐落的% 个W6BVV/#.应位于第 进行家蚕全基因组分析!发现了哺乳动物 S/5 同源 A 号染色体上’ 基因’ 由于进化分析结果显示家蚕该同源基因与果 利用 ‘^FGT‘分析 =(=>@@<基因在家蚕( 龄2 蝇等昆虫的 =>@@<基因进化关系更近!故命名为 天不同组织中的表达结果显示$=(=>@@<在家蚕各 =(=>@@<’ 这是继 ^B;8"KBK 等"’,,)#报道的含有 组织中的表达水平相对较低!其中马氏管中表达量 S6#F% 家族结构域基因 =(8’&, 外的又一个家蚕 最高!中肠(头和血液中表达量次之!而在其他组织 S6#F% 家族成员’ 基因组测序结果将其定位于两条 中则表达量很低"图,#’ 从整体家蚕的变态阶段来 染色体上!即第A 和第* 号染色体上’ 由于在自然 看!上簇后第%’+ 小时 =(=>@@<转录水平表达量最 界中这一现象很少见!本研究采用了 DD‘分析方法 高!达到极显著水平"图’&$ ?#’ 相反!脂肪体中上 对其加以证实!结果表明KW6BV%,)2和KW6BV2&**同位 *期 张金叶等$ 家蚕S6#F%家族基因=(=>@@<的克隆及表达分析 99*’* 图(9家蚕S;S"VV$跨膜区域预测示意图 b0:](9G=$#/:UKUJ06BKB#$W0W/V=’(?<K(’.+S6#F% ;U;8UYW[0J= =/;/#/:W0K /J=UY0KWU6JW\U60UWBK. J=U0Y./;B0K BY6=0JU6J"YUW ?U$埃及伊蚊!272/$2*<0#+)?;$西方蜜蜂!0+/(2))+@2.$)S;$家蚕=’(?<K(’.+)TU$秀丽隐杆线虫;$2&’.1$?7+#+/2)2*$&/) Tk$ 致乏库蚊 ;>)2KP>+&P>2@$/"+$#>/)EY$斑马鱼-$&+’.2.+’)E;$黑腹果蝇-.’/’01+)$(2)$&’*$/#2.)>W$人D’(’/$0+2&/)>@$水螅D<7.$C>)*$.+/)‘K$大 鼠6$##>/&’.C2*+">/)_;$小鼠B>/(>/">)>/)G=$体虱827+">)>/1>($&>/"’.0’.+/)Q#$非洲爪蟾Q2&’0>/)$2C+/)DW$鲑鱼,$)(’/$)$.)^6$赤 拟谷盗L.+?’)+>("$/#$&2>(]绿色矩形代表S>A结构域)红色矩形代表S>2结构域)蓝色矩形代表S>’结构域) 紫色矩形代表S>%结构 域’ ^=U:YUUKYU6JBK:"#BYYU\YUWUKJWS>A ./;B0K!J=UYU.YU6JBK:"#BYYU\YUWUKJWS>2 ./;B0K!J=U8#"UYU6JBK:"#BYYU\YUWUKJWS>’ ./;B0KBK.J=U \"Y\#UYU6JBK:"#BYYU\YUWUKJWS>% ./;B0K] 图+9家蚕=(=>@@<基因的外显子组成及染色体分布示意图 b0:]+9T/;\/W0J0/K BK. #/6BJ0/K /VU7/KW/V=(=>@@<0K =’(?<K(’.+6=Y/;/W/;UW 99*’) 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ ()卷 图*9家蚕第*号染色体定位材料的确认 b0:]*9T/KV0Y;BJ0/K /VJ=U6=Y/;/W/;UL/]* ;BJUY0B#/V=’(?<K(’.+ ’!%A$大造EBZB/)%!%($T’&))2!%+$b代b:UKUYBJ0/K)A-’2!%*-2+$ST突变体b0YWJ8B656Y/WW:UKUYBJ0/K /V;"JBKJ)’A- ’ ’ ’ %2!2*-A+$ST野生型b0YWJ8B656Y/WW:UKUYBJ0/K/V[0#.J$\U] ’ 图)9家蚕=(=>@@<基因的遗传连锁带型结果 b0:])9HUKUJ06#0K5B:U#/6BJ0/K /V=(=>@@<’@=’(?<K(’.+ ’$T’&))?%$大造茶斑EBZB/JUBW\/J)S%$大造鹑斑EBZB/k"B0#)2$b代b:UKUYBJ0/K)A-’2$突变型_"JBKJ)’A-%2$野生型R0#.J$\U] ’ ’ 图,9家蚕=(=>@@<基因在(龄2天不同组织中的表达分析 b0:],9I7\YUWW0/K \Y/V0#UW/V=(?>@@<0K .0VVUYUKJJ0WW"UW/V.B$F2(J= 0KWJBY#BY@BU/V=’(?<K(’.+ ’$体壁T"J06#U)%$马氏管_B#\0:=0BKJ"8"#UW)2$卵巢O@BY$)A$后部丝腺>0K.\BYJ/VW0#5:#BK.)($脂肪体bBJ8/.$)+$前部丝腺bY/KJ\BYJ /VW0#5:#BK.)*$精巢^UWJ0W))$中肠_0.:"J),$头>UB.)’&$血液S#//.] 同位于第 A 号染色体上’ 虽然没有确凿的证据表 着激烈的解离(发生和重构!从而为成虫形成作准 明KW6BV%,)’ 也在第 A 号染色体上!但是 KW6BV%,)’ 备’ 本研究着重对家蚕几个较大且变化显著的组织 总长度仅为’** A+( 8\!且位于第* 号染色体的端 器官"体壁(中肠(脂肪体和丝腺#中的 =(=>@@<表 部!因此本研究组推断KW6BV%,)’ 很大程度上位于第 达量进行了分析’ 由于整蚕是蚕体各组织的有机组 A 号染色体上’ 故此!=(=>@@<基因应该位于第A 号 合体!因此=(=>@@<在各组织中的表达趋势与整体 染色体上’ 并不完全一致’ 在家蚕变态发育过程中!化蛾前’ . 家蚕蛹期是其由幼虫过渡到成虫的重要阶段’ "R%’+ =#幼虫体壁鳞化成有鳞毛的成虫体壁)化蛹 虽然外观似乎变化不大!但其内部的各组织却进行 后( -* ."R,+ -’AA =#幼虫的中肠从巨大且圆长 *期 张金叶等$ 家蚕S6#F%家族基因=(=>@@<的克隆及表达分析 99*’, 图’&9家蚕=(=>@@<在变态发育时期不同组织中的表达变化 b0:]’&9^YBKW6Y0\J0/KB#B6J0@0J$/V=(=>@@<0K .0VVUYUKJJ0WW"UW/V=’(?<K(’.+."Y0K:;UJB;/Y\=/W0WWJB:U ?$整蚕R=/#U8/.$/VW0#5[/Y;)S$体壁T"J06#U)T$中肠_0.:"J)E$脂肪体bBJ8/.$)I$丝腺D0#5:#BK.)(&,$(龄第,天EB$F,(J=0KWJBY #BY@B)R&$上簇后第&小时RBK.UY0K:& =]其余以此类推^=UYUWJ;B$8U.U."6U.B66/Y.0K:#$] 变成短小的陀螺状)化蛹第’ 天"R& =#幼虫的丝腺 ;2))!*A"A#$(,*-+&)] 组织开始急剧退化到蛹后第2 天彻底消退)化蛹后 T=0JJUK.UK^! >BYY0K:J/K I?! OoT/KK/Y‘! b#U;0K:J/K T! <"JZ‘!! I@BK HP! H"0#. ST! ’,,(]PK."6J0/K /VB\/\J/W0W8$J=US6#F% % -2 ."R%A -A) =#蚕的生殖系统开始加速发育! =/;/#/:"USB5]I$#>.2!2*A"+(%A#$*22-*2+] 需要充足的能量供给!而 =(=>@@<的表达变化在这 T#UBY$_<!D;0J=DE!D5#BY!!’,)+]T#/K0K:BK.WJY"6J"YB#BKB#$W0W/V 几个变态关键时期均达到显著或极显著’ 由此推断 6EL?WV/Y?")3% BK. B=$8Y0. ?")3%30;;"K/:#/8"#0K JYBKW6Y0\J S;S"VV$很可能在家蚕变态期的组织生理变化中起 YUW"#J0K:VY/;J=UJ"’A)’)# JYBKW#/6BJ0/K];2))!A*"’#$’)-%)] 作用!这一猜测将在下一步的研究中进行证实’ T/#0K!!HB";UYD! H"UKB#P! _0:K/JJUS!%&&,]_0J/6=/K.Y0B! S6#F% VB;0#$\Y/JU0KWBK. B\/\J/W/;UW$ /V[/Y;W! V#0UWBK. ;UK]F.’&#5 参考文献 #F#"#4#-$#&$ =+’/"+]!’A$A’%*-A’2*] fBYWBK?!NUUI!fB"W=BKW5$f!>BY#BK!_!’,,+]T#/K0K:/V=";BK ?.B;W!_! T/Y$D! ’,,)]^=US6#F% \Y/JU0K VB;0#$$ BY80JUYW/V6U## S6#F% =/;/#/:"U$ 0KV#B;;BJ/Y$6$J/50KUW0K."6U=";BK ?’ 0K W"Y@0@B#],"+2&"2!%)’"(2)’#$’2%%-’2%+] 6"#J"YU.UK./J=U#0B#6U##W]=)’’7!)*")#$2&),-2&,+] S/0WU<>!H/KZB#UZFHBY60B_!G/WJU;BTI!E0K:<!<0K.WJUK^!^"Y5B fUL!H/.Z05?!‘UU.!T!%&&’]S6#FS!BK/@U#S6#F% VB;0#$;U;8UY <?!_B/Q!L"KUZH!^=/;\W/KTS!’,,2]?")3K!B?")3%FYU#BJU. J=BJ.0VVUYUKJ0B##$80K.WBK.YU:"#BJUWSB7BK.SB5]A5=+’)5;12(]! :UKUJ=BJV"K6J0/KWBWB./;0KBKJYU:"#BJ/Y/VB\/\J/J066U##.UBJ=] %*+"’+#$’%A)’-’%A)A] 99*%& 昆虫学报!"#$ %&#’(’)’*+"$ ,+&+"$ ()卷 f/Z/\BWf_!NBK:^!S"6=BK><!C=/"G!TYB0:‘R!’,,2]B;G3’! @0@/[0J= B6/KWUY@U. =/;/#/:! SB7! J=BJB66U#UYBJUW\Y/:YB;;U. B:UKUU7\YUWWU. 0K \Y/:YB;;U. ;$U#/0. 6U##.0VVUYUKJ0BJ0/K! =BW 6U##.UBJ=];2))!*A"A#$+&,-+’,] WUk"UK6UW0;0#BY0J$J/=")3%]8.’"5I$#)5!"$75,"+5M,!! ,&$ GBK _>! Q0B/DM! >/K:Q!! <" T! %&&(]IWJB8#0W=0;UKJBK. 2(’+-2(%&] 6=BYB6JUY0ZBJ0/K/VU;8Y$/6U###0KU/V=’(?<K(’.+FDRX’];1+&2/2 fY/U;UYH! HB##"ZZ0<! 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T/KYB.JS! %&&)]2*)3’$ B5U$B6J0@BJ/Y/VB\/\J/J066U## 展]生命科学!’*"(#$A’’-A’2+ .UBJ=0K;52)2*$&/]H&"’*2&2!%*"D"\\#]’#$D2&-DA&] "责任编辑$袁德成# O#J@B0CL!_0##0;BKT<!f/YW;U$UYD!!’,,2]S6#F% =UJUY/.0;UY0ZUW0K