植 物 分 类 与 资 源 学 报 ,34 ( ): 摇 2012 1 56~62 Plant Diversity and Resources : 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI 10.3724/SP.J.1143.2012.11057 云南悬钩子蔷薇 NBS鄄LRR 类抗病基因同源克隆与分析* 陈 玲 , , 张 颢 , 邱显钦 , 晏慧君 , 1 2 1 1 1 摇 摇 王其刚1, 蹇洪英1, 唐开学1** 云南省农业科学院花卉研究所花卉育种重点实验室 云南昆明 (1 , 摇 650205; 云南大学生命科学学院 云南昆明 2 , 摇 650091) 摘要: 为研究云南野生蔷薇属中的 类抗病基因 根据已知抗病基因 序列中的保守区域设计 NBS , NBS鄄LRR 简并引物 利用 技术从云南悬钩子蔷薇中进行体外扩增 获得了对应区域的 片段 回收 , RT鄄PCR , cDNA , 、 克隆这些特异片段 测序分析 共得到 个含有 保守结构域的抗病基因同源序列 分 , , 4 NBS鄄LRR (RGAs), 别命名为 和 它们与已报道的 个 类抗病基因相应区段的氨基酸序列相似 AC9、 AC39、 AC50 AC68。 11 NBS 性为 其中这 个 片段与Mi RPS2 Pib和RPM1基因聚为一类 表明这 条 5.4%~79.2%, 4 RGAs 、 、 。 4 RGAs 序列可进一步用作悬钩子蔷薇抗病候选基因的分子筛选及遗传图谱的构建 。 关键词: 悬钩子蔷薇 保守区域 抗病基因同源序列 简并引物 ; ; ; 中图分类号: 文献标识码: 文章编号: Q78摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2095-0845(2012)01-056-07 Cloning and Analysis of NBS鄄LRR Type Disease Resistance Gene Analogs from Rosa rubus in Yunnan 1,2 1 1 1 CHEN Ling , ZHANG Hao , QIU Xian鄄Qin , YAN Hui鄄Jun , 1 1 1** WANG Qi鄄Gang , JIAN Hong鄄Ying , TANG Kai鄄Xue FlowerResearchInstitut鄄FlowerBreedingKeyLabe YunnanofAgriculturalSciences (1 , ,Kunming650205,China; CollegeofLifeSciences YunnanUniversity 2 , ,Kunming650091,China) Abstract Rosa : In the study of NBS resistance genes of Yunnan wild , the degenerate oligonucleotide primers were R designed accordingtotheconservedmotifsNBS鄄LRRofmostplantresistance( ) genes. ThecDNAfragmentswere Rosarubus isolated from byreversetranscriptionPCR(RT鄄PCR). Thenfourresistancegeneanalogs(RGAs) were sequenced and named as AC9, AC39, AC50 and AC68, which contain NBS鄄LRR domain. The sequence of each RGAs was compared with NBS region of eleven resistance genes reported before, and the similarities of amino鄄acid Mi RPS2 Pib sequences ranged from5.4% to 79.2%, and these four RGAs were clustered a group with 、 、 and RPM1 gene. TheseresultsshowedthatthefourRGAswillbeusedasmolecularmarkersforscreeningcandidatedis鄄 Rosa rubus ease resistance genes and genetic map construction of in the future. Key words Rosa rubus : ; Conserved motif; Resistance gene analogs (RGAs); Degenerate oligonucleotide primers 植物抗病基因 病原物与寄主之间互作的分子机制等具有重要意 摇 (plant disease resistance genes, 简称R基因 的克隆对于培育抗病植物及研究 义 R基因主要通过转座子标签技术和图位克隆 ) 。 基金项目 国家自然科学基金项目 云南省应用基础研究计划项目 科技部 项目 * : (31160403); (2011FB124); 863 (2011AA100208); 云南省攻关项目 农业部 项目 (2011BB013); 948 (2011鄄G17) 通讯作者 ** : Authorforcorrespondence; E鄄mail:[email protected]; Tel: 0871-5120870 收稿日期 接受发表 : 2011-04-02, 2011-09-23 作者简介 陈 玲 女 汉族 在读硕士 主要从事花卉育种相关研究 : 摇 (1986-) , , , 。 E鄄mail:[email protected] 期 陈 玲等 云南悬钩子蔷薇 类抗病基因同源克隆与分析 1 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 : NBS鄄LRR 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 5摇7 技术获得 这两种技术适用于基因组较小的植 南野生蔷薇中优良的种质资源 色香俱美 耐 , , 、 物 但对于基因组复杂的植物则相当困难 高 旱 抗病虫 适应性强 分布区域较广 是垂直 , ( 、 , 、 , 丽华等 因而寻求新的克隆技术是必要 绿化的优良观赏花木 在月季育种中具有较大的 , 2007), , 的 研究发现 R 基因在结构上具有相当的保守 潜在利用价值 张佐双和朱秀珍 近几 。 ( , 2006)。 性 根据R 基因保守结构域的特征 可将 R 基 十年来 关于蔷薇属抗病种质资源方面的研究已 , , , 因分为 大类 玉米抗圆斑病基因 Hm1 和大麦 有报道 和 张喜萍等 4 ( (Byrne Black,1996; ,2002; 抗白粉病基因 Mlo 例外 和 刘永刚和刘青林 李卉 但对于悬 ) (Hammond鄄Kosack , 2004; , 2010), 其中 是最主要的一类 钩子蔷薇的应用还只是停留在庭院观赏方面 Jone, 1997), NBS鄄LRR , 占所有已克隆 R 基因的 左右 等 张佐双和朱秀珍 章银柯等 75% (Hulbert , ( , 2006; , 2009)。 该结构域能够结合 或 在植物 本文根据已报道的 类 R 基因的保 2001), ATP GTP, NBS鄄LRR 抗病反应中起重要作用 和 守区域 和 设计简并引物 采用 (Ellis Jones, 1998)。 P鄄loop GLPL, , R基因的保守性使得同源克隆技术成为可能 技术 从悬钩子蔷薇 中扩增和分 RT鄄PCR , cDNA 等 即根据 R 基因保守序列 离 以期通过这些 的克隆和序列分 (Speulman , 1998), RGAs。 RGAs 设计简并引物来扩增基因组 或 从 析 为进一步研究云南野生蔷薇的 R 基因资源 DNA cDNA, , 中获得 R 基因同源序列 和抗病机制奠定基础 (Resistance gene ana鄄 。 通过染色体定位或明确它们与 logues, RGAs), 已知R基因位点的连锁关系 达到筛选 R 基因 , 1摇 材料与方法 或抗病相关基因的目的 这就是近年兴起的基于 。 1 1摇 材料 同源性的克隆技术 . (homology鄄based cloning), 植物材料 供试材料为悬钩子蔷薇 Rosa ru鄄 1.1.1摇 摇 ( 该方法已成为当前克隆 R 基因较流行的策略之 bus 采集于云南省农业科学院花卉研究所蔷薇种质资 ), 一 刘宇等 源圃 田间采取新鲜幼嫩叶片 用锡箔纸包裹之后立即 ( , 2010)。 。 , 随着基因工程技术的发展 人们已能够将多 投入液氮中带回实验室 冰箱保存 , , -80益 。 种抗植物病虫害的基因转入目的植物中 这使得 引物设计 根据拟南芥 Arabidopis thaliana 抗 , 1.1.2摇 摇 ( ) 发掘植物自身的 R 基因资源显得越来越重要 丁香假单孢杆菌 Pseudomonas syringae 基因RPS2 烟 ( ) 、 。 草 Nicotina tabacum 抗花叶病毒 Tobacco mosaic vi鄄 野生蔷薇由于长期处于野生状态 经受了各种灾 ( ) ( , rus 基因N 亚麻 Linum usitatissimum 抗锈病 Mel鄄 害和不良环境的自然选择 抗逆性较强 是天然 ) 、 ( ) ( , , ampsora lini 基因L6等 类R基因的蛋白保守 的基因库 保持有栽培月季不具有或已经消失了 ) NBS鄄LRR , 区域 和 设计简并引物 表 的遗传基因 是克隆 R 基因极有价值的材料 P鄄loop GLPL ( 1)。 , 试剂与测序 提取试剂盒购自上海捷瑞生 白锦荣 云南省拥有全国一半以上的蔷 1.1.3摇 摇 RNA ( , 2009)。 物技术有限公司 反转录酶和 产物回收试剂盒购自 ; PCR 薇属 Rose 野生资源 在生态和遗传水平 北京全式金生物技术有限公司 Taq 聚合酶和 ( L.) , ; DNA 上都有较高的多样性 具有抗病 抗逆 香型 载体连接试剂盒购自宝生物工程 大连 有限 , 、 、 、 pMD18鄄T ( ) 连续开花等许多优良性状 白锦荣等 唐 公司 引物合成由上海捷瑞生物技术有限公司合成 测 ( , 2009; ; ; 开学等 悬钩子蔷薇 Rosa rubus 是云 序由上海杰李生物技术有限公司完成 , 2008)。 ( ) 。 表1摇 用于PCR扩增的简并引物 Table1摇 DegenerateprimersusedforPCRamplification 引物 保守结构域 引物序列 摇 Primer Conservedmotif摇 Sequence (5忆寅3忆) 正向引物 ( ) NBS1 GGV/IMGKTT摇 GGNGGNRTNGGNAARACNAC 反向引物 ( ) NBS2 GL/FPL/FA/VL摇 AKWGCYARRGGDARYCC 正向引物 ( ) APF GGV/IMGKTT摇 GGWATGGGWGGWRTHGGWAARACHAC 反向引物 ( ) APR GL/FPL/FA/VL摇 ARNWYYTTVARDGCVARWGGVARWCC 注 : N=A/T/C/G; M=A/C; W=A/T; S=C/G; Y=C/T; K=G/T; V=A/C/G; H=A/C/T; D=A/G/T; R=A/G 植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷 摇58摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 34 1 2摇 方法 . 总 的提取 提取按照 提取试剂 1.2.1摇 RNA 摇 RNA RNA 盒说明进行 提取的 经紫外分光光度法和琼脂糖凝 , RNA 胶电泳进行浓度测定和质量检测 。 扩增 反转录第一链的合成按反转录试 1.2.2摇 RT鄄PCR 摇 剂盒说明书进行 取 反转录溶液作模板进行 。 1 ~2 滋L 扩增 反应体系如下 RT鄄PCR , : 10伊PCRBuffer 2 滋L; -1 -1 MgCl2 (25mmol·L ) 1.6 滋L; dNTPs (2.5 mmol·L ) 引物 -1 各 Taq 聚合 1.6滋L; (10 滋mol·L ), 1 滋L; DNA 酶 -1 用 补足至 扩增 (5U·滋L ) 0.1 滋L; ddH2O 20 滋L。 条件 预变性 变性 退火 图 悬钩子蔷薇总 的提取 : 94益 3min, 94益 30s, 55益 30s, 1摇 RNA 延伸 个循环 最后 延伸 在 Rosarubus Fig.1摇 TotalRNAextractedfrom 72益 1min, 30 , 72益 10 min。 实验过程中 同时以 为模板 其它反应成分和反 , ddH2O , 2 2摇 悬钩子蔷薇RGAs的分离与鉴定 应条件均相同 作为阴性对照 琼脂糖凝胶电泳检 . , , 1% 利用引物对 和 进行 测 产物 NBS1+NBS2 APF+APR PCR 。 扩增 从图 中可见 两对引物都扩增 产物克隆及测序 产物凝胶电泳之后 RT鄄PCR 。 2 , 1.2.3摇 PCR 摇 PCR , 出单一清晰的条带 对扩增产物进行回收 克 切下目的片段 使用凝胶回收试剂盒回收 产物 回 。 、 , PCR , 隆 多次测序得到 条序列 经鉴定得到 收片段连接到 载体上 转化到大肠杆菌 pMD18鄄T , DH5琢 , 56 , NBS 序列 条 获得的序列中有 条具有连续的开 中 进行蓝白斑筛选 挑取阳性单菌落 白斑 接种 , , ( ), 20 , 4 于 液体培养基中 并用相应引物 本研究的两对简 放阅读框 分别命名为 LB , ( (ORF), AC9、 AC39、 并引物 鉴定后 选取有插入片段的阳性克隆送公 和 其余 条序列都含有不少于 ) PCR , AC50 AC68。 16 1 司测序 个的终止密码子 不能通读 因此这 条序列 。 , , 16 序列分析 测序获得的序列在 中进行 不再进行下一步分析 1.2.4摇 摇 GenBank 。 同源性检索 结合 查找开放阅读框 并 , BioXM2.6 (ORF) 翻译成氨基酸序列 结构域分析采用 氨基酸序 , SMART, 列多重比对采用 和 用于参比的R基 DNAStar DNAMAN。 因有 拟南芥 RPS2 RPS5 : (AAA21874)、 (AAC26125) 和RPP8 烟草 N 亚麻 L6 (AAC83165), (AAA50763), 芥 蓝 头 Arabidopsis lyrata RPM1 (AAA91022), ( ) 莴苣 Lactuca sativa Dm3 (AAD41050), ( ) (AAP42998), 番茄 Lycopersicon esculentum I2C 和 Mi ( ) (AAB63274) 及水稻 Oryza sativa Xa鄄1 (AAC97933) ( ) (BAA25068) 和Pib 其中N和L6 基因为 (BAA76281), TIR鄄NBS鄄LRR 类 其余基因为 类 , non鄄TIR鄄NBS鄄LRR 。 图 两对简并引物 扩增产物 2摇 PCR 引物组合 2摇 结果与分析 M:2000 DNAmarker; 1:APF+APR ; 引物组合 2:NBS1+NBS2 2 1摇 RNA的提取 . Fig.2摇 ElectrophoretogramofPCRamplificationusingtwo 提取的 经紫外分光光度计检测浓度为 degenerateprimersAPF+APRandNBS1+NBS2 DNA -1 且 比值为 M:2000 DNAmarker; 1:APF+APRprimercombination; 0.4 滋g·滋L , OD260/OD280 1.85, 2:NBS1+NBS2 primercombination 表明总 的纯度较高 经琼脂糖凝胶电泳检 RNA , 测 图 结果表明 提取的总 质量良 2 3摇 悬钩子蔷薇RGAs保守结构域分析 ( 1), , RNA . 好 无 污染 也没有发生降解 可以满足 利用 将 条序列进行多重序列比 , DNA , , DNAMAN 4 后续实验操作 对分析 图 结果发现 条序列都具有 。 ( 3), , 4 NBS 期 陈 玲等 云南悬钩子蔷薇 类抗病基因同源克隆与分析 1 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 : NBS鄄LRR 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 5摇9 图 悬钩子蔷薇 氨基酸序列比对分析 最下方的横线表示该区域为 共同的保守结构域 3摇 RGAs ( RGAs ) Rosarubus Fig.3摇 Multipleaminoacidsequencealignmentin RGAs(Themutualdomainsweredenotedbythelinebelow) 类R 基因的 个保守基序 即 的部分 家族基因 如RPM1 RPM2 RPM3 4 , “P鄄loop冶、 “Ki鄄 RPM ( 、 、 个模体和 区 等 相似性在 之间 nase鄄2a冶、 “Kinase鄄3a冶 3 “GLPL冶 ) 73%~75% 。 并且具有 等 所 2 5摇 RGA氨基酸与已知R基因的比较与聚类分析 (William,1999), Meyers (1999) . 定义的 应用 将悬钩子蔷薇的 条 氨 RNBS鄄A鄄nonTIR (FnLxAWVCvSQxF)、 B DNAStar 4 RGAs 基酸序列与已知 R 基因 RPS2 RPS5 RPP8 Xa鄄 (GSRIIITTRD)、 C (YEVxxLSDEEAWELFCKxAF) 、 、 、 个模体 指示悬钩子蔷薇的 条 序列都 1 Pib N L6 RPM1 Dm3 Mi I2C的 区 3 , 4 RGAs 、 、 、 、 、 、 、 NBS 为 类 域氨基酸序列进行相似性比较分析 图 结 non鄄TIR鄄NBS鄄LRR (CC鄄NBS鄄LRR) 。 ( 4), 2 4摇 悬钩子蔷薇RGAs核苷酸相似性搜索 果显示 这些悬钩子蔷薇的 与已知R 基因 . , RGAs 使用 进行相似性搜索 未发现有与之 相应区域的氨基酸序列相似性在 Blastn , 5.4%~79.2% 完全相同的序列 但发现该 条序列与栽培月季 之间 相对于 条序列而言 与 之 , 4 , 4 , AC39 AC68 和刺梨的 有着 以上的相似性 与其它 间相似性最高为 与 之间相似 RGAs 90% , 79.2%, AC9 AC50 物种的 如毛果杨 葡萄 相似性也较高 性最低为 条序列与其它已知序列相似 RGAs ( 、 ) , 14.2%; 4 在 之间 并且发现 与高山栎抗 性都很低 与RPM1 相似性最高 但也只有 85% ~98% 。 AC9 , AC9 , 疫病基因RPc 相似性为 与芭 进一步进行聚类分析发现 图 条 (GU289638) 68%, 26.8%。 ( 5), 4 蕉抗镰刀菌枯萎病基因 BR 相似性 片段聚为一类 与Mi RPS2 Pib 和RPM1 (EU123875) RGAs , 、 、 为 与马铃薯抗晚疫病基因 R3a鄄like 聚为一大类 其中 Mi RPS2 Pib 和 RPM1 为 81%, AC39 , 、 、 相似性为 与马铃薯抗 类 R 基因 说明 条序列为 (AAW48299) 83%, AC68 non鄄TIR鄄NBS鄄LRR , 4 晚疫病基因 R3a 相似性为 类 与前面多重序列比较结果 (AAW48299) 95%, non鄄TIR鄄NBS鄄LRR , 与蔷薇科李属植物 如樱桃 甘肃桃等 相一致 AC50 ( 、 ) 。 植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷 摇60摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 34 图 悬钩子蔷薇 与已知植物R基因的 区域的氨基酸序列相似性比较 4摇 RGAs NBS Rosarubus R Fig.4摇 Theidentitypercentageamongaminoacidsequenceof RGAsandNBSregionofknownplant genes 图 悬钩子蔷薇 氨基酸序列与 个已知植物R基因 区域的聚类分析结果 5摇 RGAs 11 NBS Fig.5摇 Phylogenictreebasedonalignmentofthededucedaminoacidsequencesof Rosarubus R RGAsandNBSregionofknownplant genes 3摇 讨论 们筛选真正的R基因 。 3 1摇 悬钩子蔷薇RGAs的分离与鉴定 从获得的 条 的结构分析表明 这些 . 摇 摇 4 RGAs , 是个庞大的基因家族 从基因组中分 序列中含 类R基因的保守结构域 如 RGAs , RGAs NBS , 离的部分 可能由于内含子的存在 无法通 等 并且这些序列具有 RGAs , P鄄loop、 Kinase鄄2、 GLPL , 读 为不表达的假基因 而从 中分离的 连续的开放阅读框 因此 这些 , , cDNA (ORF)。 , RGAs 则均为表达序列 不含任何内含子 它们 序列可能是功能性的 R 基因的部分序列 尤其 RGAs , , , 为抗病候选基因的可能性更大 本研究从悬钩子 与马铃薯抗晚疫病基因 R3a , AC68 (AAW48299) 蔷薇 中扩增分离 这将更有利于我 相似性为 提示 很可能是抗晚疫病相 cDNA RGAs, 95%, AC68 期 陈 玲等 云南悬钩子蔷薇 类抗病基因同源克隆与分析 1 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 : NBS鄄LRR 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 6摇1 关基因序列 其中获得的部分序列 有的与从栽 假说和快速进化过程 。 , vergence) (rapidly evolving 培月季 金银岛 和 香云 中克隆的花香基 等 本研究结果为这两个 ‘ 爷 ‘ 爷 process) (Xu , 2005), 因 种子储存蛋白 羟基化酶家族基因 遗传机制提供了一些佐证 通过对 条序列的比 、 、 P450 、 。 4 或线粒体 Cox3 基因等有较高的相似性 说明 对分析表明 在保守结构域之间存在许多点突 , , 序列与上述基因有一定的进化关系 同时也 变 小片段的插入或缺失事件 它们是悬钩子蔷 NBS , , , 说明 上述基因在抗病进化过程中起到了一定的 薇植物 趋异的源泉 这表明 在悬钩子蔷 , RGAs , , 作用 薇中 类 R 基因的进化是逐步进化趋异 。 , NBS , 模式植物全基因的测序结果表明 虽然 而不是快速进化过程 这与前人关于R 基因进化 , , , 结构域是最重要的 R 基因保守结构域之一 的研究结果相近 等 等 NBS , (Pan , 2000; Yuksel , 2005; 在植物的抗病反应中起着重要的作用 但是植物 陈观水等 , , 2006)。 类 R 基因在植物基因组中广泛存在 3 3摇 悬钩子蔷薇RGAs分离的意义 NBS鄄LRR , . 而且并非只有 R 基因才具有 结构域 许多 R基因的获得是进行抗病育种的基础 发掘 NBS , , 蛋白家族 包括 族蛋白 R基因资源是提高植物抗病性 防治病害的关 , RAS (rat sarcoma) 、 AT鄄 、 延伸因子 蛋白都含有 位点 键 常规育种手段在许多病害育种中存在一定困 Pase 、 G NBS (Baker 。 等 另外 还出现在许多 和 难 将克隆的 R 基因应用于抗病育种 具有高 , 1997)。 , NBS ATP , 、 的结合蛋白中 除了 结 效 安全和广谱的优点 很有应用前景 悬钩子 GTP (Traut,1994) 。 NBS 、 , 。 构域 类 R 基因还应具有其它一些重 蔷薇利用的目的是将其优良的目标性状基因导入 , NBS鄄LRR 要的结构域 如 到栽培月季中 扩大栽培月季的遗传基础 选育 , TIR (toll or interluken鄄1鄄recep鄄 , , 或 出具有优良抗逆抗病能力的月季新品种 本研究 tor)、 LRR (leucine鄄rich repeats) LZ (leucine 。 等 所以本研究分离得到的 条 类 中悬钩子蔷薇的 条 克隆 为进一步通过 zipper) 。 4 NBS 4 RGAs , 仅为潜在的 R 基因片段 其确切的功能 分子生物学和遗传学手段对这些抗病相关基因片 RGA, , 还需进一步的分析 段进行全长克隆 功能分析和染色体定位等工作 。 、 3 2摇 悬钩子蔷薇RGAs的多样性及进化关系分析 奠定了基础 . 。 目前 已有 多条蔷薇属的 被分离 , 200 RGAs 出来 经 查询 将本研究获得的 条 也参 考 文 献页 ( GenBank ), 4 摇 摇 摇 序列进行相似性比较之后 发现 条序列与这 , 4 多条 中的部分序列具有较高的相似 白锦荣 部分蔷薇属种质资源亲缘关系分析及抗白粉病育 200 RGAs ,2009. 性 但没有完全相同的序列 从中表明了蔷薇植 种 北京 北京林业大学 博士论文 [D]. : ( ) , , 李卉 月季抗白粉病育种初步研究 北京 北京林业 物的 类 基因及候选基因为一个庞大的基 ,2010. [D]. : NBS R 大学 硕士论文 因家族 可能分属于不同的亚族 表现出丰富的 ( ) , , 张佐双 朱秀珍 中国月季 北京 中国林业出版社 , ,2006. [M]. : 多态性 这暗示了获得具有抗病功能的基因可能 白锦荣 张启翔 潘会堂 , BaiJR( ), Zhang QX ( ), Pan HT ( ), 性较大 研究表明 在植物基因组中的 序 Rosa 。 , RGAs 2009. Investigationongermplasmresourcesofthegenus L. 列多样性可能是由于不等交换造成的 但造成 Journal of Plant Genetic Resources in Northwest Yunnan [J]. , 植物遗传资源学报 10 序列多样性和复杂度的遗传机理直接证据 ( ), (2):218—223 RGAs etal 还待进一步研究 BakerB,ZambryskiP,StaskawiczB .,1997. Signalinginplant鄄 。 Science 276 microbeinteraction [J]. , (2):726—733 本研究 条 氨基酸序列相似性比较中 etal 4 RGAs ByrneDH,BlackW,MaY .,1995. Theuseofamphidiploidyin 图 与 之间相似性最高 Acta ( 3), AC39 AC68 (79.2%), thedevelopmentofblackspotresistantrosegermplasm [J]. 与 之间相似性最低 由此 Horticulturae 424 AC9 AC50 (14.2%), , :269—272 陈观水 周以飞 林生 et al 推测 与 可能是同一基因的不同拷 ChenGS( ), Zhou YF ( ), Lin S ( ) ., , AC39 AC68 贝 而 与 则可能为趋异起源 2006. IsolationandsequenceanalysisofNBS鄄typeinsweetpo鄄 , AC9 AC50 (diver鄄 Ipomoeabatatas JournalofTropicaland 目前关于 R 基因进化的遗传机制 tato( (L.) Lam) [J]. gent origins)。 SubtropicalBotany(热带亚热带植物学报),14 (5):359— 主要有两个 逐步进化趋异 : (slowing evolving di鄄 365 植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷 摇62摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 34 etal EllisJ,JonesD,1998. Structureandfunctionofproteinscontrolling SpeulmanE,BouchezD,HolubEB .,1998. Diseaseresistance CurrentOpinion Arabidopsis strain鄄specificpathogenresistanceinplants [J]. genehomlogscorrelatewith disease resistance loci of inPlantBiology 1 thaliana ThePlantJournal 14 , (4):288—293 [J]. , (4):467—474 高丽华 周以飞 郑伟文 唐开学 邱显钦 张颢 et al GaoLH( ), Zhou YF ( ), Zheng WW ( ), TangKX( ), Qiu XQ ( ), Zhang H ( ) ., Rosa 2007. Cloning and analysis of NBS class resistance gene ana鄄 2008. Studyongeneticdiversityofsome L. germplasmin Cucurbita moschata Journal of Acta Horticulturae Sinica loguesin Squash ( Duch.) [J]. Yunnanbased on SSR markers [J]. ChangjiangVegetables 长江蔬菜 园艺学报 35 ( ),(8):40—43 ( ), (8):1227—1232 Hammond鄄KosackKE,JoneJDG,1997. Plantresistancegene [J]. TrautTW,1994. 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