昆 虫 学 报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$，!"#$%&&’，(（& )）：(*’+((* ,--.&*(*/)%0) """"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""" 家蚕丝素蛋白轻链基因（ ）启动子序列 !"#!" 的克隆及其活性分析 周文林，曹广力，薛仁宇，虞晓华，沈卫德，贡成良! （苏州大学生命科学学院，江苏苏州 %4(4%1） 摘要：家蚕 -’(./0(’1+丝素蛋白轻链（F:ME?:#;:J>A/C>9:#，F:M/N）基因 2+./N具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达 的特点。为了利用其启动子构建能够表达外源基因的丝腺生物工厂，本实验对 2+./N启动子活性进行了研究。通 过O2K法克隆了 2+./N启动子元件，序列分析显示 2+./N启动子由位于+11 P +%(处的QDQD盒元件和位于+4%R P +4%4处的特征性序列SQ2DDQQQ共同组成。用 2+./N启动子控制报告基因 34567进行家蚕38.细胞和蚕体内 的瞬时表达研究，结果表明 2+./N启动子可以驱动 34567报告基因在38.细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。 关键词：家蚕；丝素轻链基因；启动子；34567；瞬时表达 中图分类号：-RR4T%；U’R 文献标识码：D 文章编号：&*(*/)%0（) %&&’）&)/&(*’/&R #$%&’&( )&* )+,’-’,. )&)$./’/ %0 ,12 34%5%,24 %0 0’64%’&!" (2&2 04%5 ,12 /’$78%45，$%&#’( &%)" 5VWX Y$#/N:#，2DW S"9#J/N:，ZX7 K$#/6"，6X Z:9?/V"9，-V7. Y$:/[$，SW.S 2>$#J/N:9#J! （-C>??; ?F N:F$ -C:$#C$G，-??C>?< X#:L$EG:A\，-"=>?"，!:9#JG" %4(4%1，2>:#9） 96/,4)+,：Q>$ F:ME?:# ;:J>A/C>9:#J$#$（2+./N）?F A>$G:;]<?E8 -’(./0(’1+ :GA:GG"$/GH$C:F:C9;;\$^HE$GG$I :# A>$ H?GA$E:?E G:;] J;9#IG9A >:J>/;$L$;B Q? $GA9M;:G> 9 G:;] J;9#I M:?/F9CA?E\ A? HE?I"C$ F?E$:J# J$#$ :# -B (’1+ "#I$E A>$ C?#AE?; ?F A>$ HE?8?A$E ?F F:ME?:# ;:J>A/C>9:# J$#$（2+./N），A>$ 9CA:L:A\ ?F A>$ HE?8?A$E <9G :#L$GA:J9A$IB Q>$ 2+./N HE?8?A$E ?MA9:#$I M\ O2K <9G C;?#$I 9#I G$_"$#C$IB Q>$ G$_"$#C$ 9#9;\G:G G>?<$I A>9A A>$ HE?8?A$E ?F 2+./N <9G C?#GA:A"A$I ?F A>$ QDQD M?^（+11+ +1(）9#I A>$ C>9E9CA$E:GA:C G$_"$#C$ SQ2DDQQQ（+ 4%R + + 4%4）B Q>$ E$H?EA$E J$#$ 34567 IE:L$# M\ F:ME?:# ;:J>A/C>9:# J$#$ HE?8?A$E <9G AE9#G:$#A;\ $^HE$GG$I :# A>$ 38. C$;;G 9#I A>$ H?GA$E:?E G:;] J;9#IB Q>$ E$G";A G>?<$I A>9A A>$ F:ME?:# ;:J>A/ C>9:# J$#$ HE?8?A$E C?";I IE:L$ A>$ E$H?EA J$#$ AE9#G:$#A;\ $^HE$GG:#J M?A> :# A>$ 38. C$;;G 9#I A>$ H?GA$E:?E G:;] J;9#I ?F G:;]<?E8 -B (’1+B :2. 8%4*/：-’(./0 (’1+；2+./N J$#$；HE?8?A$E；34567；AE9#G:$#A $^HE$GG:?# 家蚕 -’(./0 (’1+ 是一种具有强大泌丝能力的 比肝细胞合成血清白蛋白快 )& 倍以上（吕鸿声， 昆虫。蚕丝蛋白由丝素（F:ME?:#，‘:M）和丝胶（G$E:C:#， 400&）。如此高的蛋白合成强度，在其他动物细胞内 -$E）组成。丝素由重链（>$9L\ C>9:#，F:M/V）、轻链 是罕见的。因此，丝蛋白基因启动子是具有较强时 （;:J>A C>9:#，2+./N）和 ‘>^aO%(（F:ME?>$^98$E:#）以摩尔 空特异性和强大启动能力的天然启动子。家蚕丝素 比)b)b4 组成（,#?"$ 6# $)B，%&&&）。形成茧层的丝 蛋白轻链基因 2+./N全长41 *’% MH，位于第 4*连锁 蛋白主要在家蚕幼虫 (龄中、后期合成。在短短的 群上，一般认为其表达是在后部丝腺中，具有龄中表 *P(天内，后部丝腺每个细胞合成丝素约1&& J，亦 达专一性的特点，并且已证实其表达的调控主要是 ! 即%条后部丝腺（大约 4 &&&多个细胞）每小时合成 在转录水平实现的（向仲怀，%&&(）。但是有关 2+./N 丝素% 8J左右，平均每秒钟合成)c4&R 丝素分子， 基因启动子的转录调控研究却远没有其他丝蛋白启 基金项目：国家重点基础研究发展计划“0’1”项目（%&&(234%4&&&）；江苏省研究生培养创新工程项目（561%&(&)） 作者简介：周文林，男，40’’年0月生，江苏人，博士，研究方向为动物生化与分子生物学，现工作单位浙江省农业科学院蚕桑所，7/89:;： <$#;:#=>?"@>?A89:;BC?8 !通讯作者 D"A>?EF?EC?EE$GH?#I$#C$，7/89:;：C>;J?#J@>?A89:;BC?8 收稿日期K$C$:L$I：%&&)/4%/%&；接受日期DCC$HA$I：%&&’/&*/&% >MZ 昆虫学报 6-%&,3%.4.’.7"-&5"3"-& >4卷 动子多，尚待进一步研究。 物 K!(（>W!OOD0OD8ODOO8OO80DD0DODO0OO0OO! 近年来，!"#!"基因启动子已用于转基因家蚕方 VW，下 划 线 表 示 5&’ " 位 点 ），K!3（ >W! 面的研究，如利用同源重组（#$%$& $% &’’，()))）和 DDO0OD8DO08O8DD88O8DD0DD0DDO!VW，下 划 线 *+,,-.$/转座子介导的转基因（0$%12$ $% &’’，3444； 表示 /0."位点）。引物合成及 LOK产物测序由上 5+6& $% &’’，3447；89$/:+ $% &’’，3447），均成功实现 海生工生物工程公司完成。 了 ;+<!"蛋白与目的蛋白的融合表达。 !"# 方法 为了利用 !"#!"基因启动子强大的启动能力及 !"#"! 序列克隆及瞬时表达载体的构建：按 其时空特异性，获得外源目的基因在家蚕丝腺组织 I$9&6&!PT19$等（3443）方法以家蚕（菁松 = 皓月杂 中的定点富集表达，我们克隆了 !"#!"基因启动子元 交品种）丝腺组织提取基因组?A8。以此为模板，"! 件，构建了 !"#!"启动子控制 ()*$+ 基因的瞬时表达 (和 "!3 为引物，LOK 扩增出 !"#!" 启动子序列（约 载体，在家蚕培养细胞和丝腺组织进行了初步瞬时 744 <*），经 ,-.K"和 ,-.K#双酶切后定向克隆至 表达研究。 载体 *.E1FG/2+*H!BI（ J），获得重组质粒 *BI!Y"。 同样以家蚕基因组?A8为模板，"!V和 "!M为引物， ! 材料与方法 LOK扩增出 !"#!"的 *&E-8加尾信号（约 3)4 <*），经 /0."和 123"双酶切后定向克隆至 *BI!Y"中 !"#! !"! 材料 "启动子下游，获得重组质粒*BI!Y"!L&E-8。以质粒 !"!"! 家蚕和细胞：家蚕杂交品种“菁松 = 皓月” *?GKF9!A( 为模板，K!( 和 K!3 为引物，LOK 扩增 （本实验室留种）；家蚕原种“4> 贝”、“?7 白”、“?@ ()*$+ 报告基因序列（约 7)4 <*），经 5&’"和 /0." 花”、“"(中”、“#(@”、“ABC”以及“C8”等@个品种，由 双酶切后定向克隆至 *BI!Y"!L&E-8载体上 !"#!"启 苏州大学生命科学学院虞晓华馈赠。来源于家蚕卵 动子与 *&E-8 加尾信号序列之间，获得瞬时表达载 巢的细胞株.%A为本实验室保存。 体 *BI!Y"!?GKF9!L&E-8（图(）。 !"!"# 菌株和质粒：宿主菌 ,’ -.’" 0D(菌株和质 粒 *.E1FG/2+*H!BI（J）、*?GKF9!A(均为本实验室保 存。 !"!"$ 主要试剂：实验所用的限制性内切酶及其 配套缓冲液均为 L2&%F,$公司产品；0M ?A8 连接酶 为DN.NOP" .K"公司产品；0$Q ?A8聚合酶及 LOK 配套缓冲液、M9A0L 为上海生工产品；LOK 产物纯 化试剂盒、?A8小量柱式凝胶回收试剂盒以及质粒 ?A8小量柱式回收试剂盒购自 R!DSAS生物公司； ?A8分子量标准为 0$I$K$ 公司产品；转染试剂 "+*&;F/H+6、0O!(44培养基等为 B+,%$公司产品。 图( 瞬时表达载体构建图谱 !"!"% LOK 引物：参照 DF6.$6T 中已公开的家蚕 Y+,’ ( O&6GH21/H+&6&;H2$6G+F6HF[*2FGG+&6 !"#!"全序列（登录号：U@7MV4），合成克隆启动子序 \F/H&2*BI!Y"!?GKF9!L&E-8 列 用 的 ( 对 引 物 "!(（>W!ODD8800OOD8O0 !"#"# 重组载体在家蚕 .%A 细胞中的瞬时表达： ODOO88D008OD0O!VW，下划线表示 ,-.K"位点）、"! 按B1%%F2G和 B%+H:（()Z@）方法培养昆虫细胞，以脂 3（>W!DOD8080OD0DD0O0D0080D0D8OO!VW，下划线 质体介导法进行细胞转染（0$6, $% &’’，344V）。以> 表示 ,-.K#位点）；合成克隆 !"#!" *&E-8加尾信号 =(47X%"个细胞的密度将 .%A细胞接种于 (3 /%3 序列用的 ( 对 LOK引物 "!V（>W!DDO0OD8DO88800 的瓶中，3@]培养过夜。在 (44 " 转染液体系中， $ D0D000DOD008DD!VW，下划线表示 /0."位点）、"!M 含M " "+*&;F/H+6、3 ,瞬时表达质粒 ?A8。倾去旧 $ $ （>W!DODD08OOO8O0D0OO880OO8OOD0O!VW，下划线 培养基，用无血清 0O!(44培养基洗细胞3次，再加( 表示 123"位点）；参照质粒 *?GKF9!A( 序列，合成 %"无血清 0O!(44培养基，逐滴加入转染液，M^> : 克隆 红 色 荧 光 蛋 白 报 告 基 因（ (")-.).4& 2F9 后用V %"含(4_ Y.B的0O!(44培养基替换旧培养 ;E1&2FG/F6H *2&HF+6，()*$+X92YL>ZV）用的 ( 对 LOK 引 基。3M :后用荧光显微镜（ANIIPA 0S!3444）观察细 %期 周文林等：家蚕丝素蛋白轻链基因（!"#(&）启动子序列的克隆及其活性分析 #.V 胞荧光情况。 !"#"$ 重组载体在家蚕丝腺中的瞬时表达：!个品 种家蚕（"#贝、$%白、$!花、&’(中、)’!、*+,和 ,-）， 分别随机抽取数条.龄蚕，解剖出丝腺组织，以荧光 倒置显微镜观察其自身荧光情况。筛选丝腺自身无 红色荧光的家蚕品种，取 /0# 1 重组质粒与 / & ! ! &234567829充分混合，用 ::; <补至总体积为 ’" &， / ! 注射#龄期家蚕幼虫。注射后 /. =解剖丝腺组织， 荧光显微镜观察其荧光情况。 # 结果与分析 图/ 重组载体3+T(?&($BS6:(O4JQ-酶切鉴定 ?21@ / S6B8C278249G9GJQB2B458CG9B26986K3C6BB249 Z6784C3+T(?&($BS6:(O4JQ- #"! 重组载体的酶切鉴定 A：’""I3$*-梯度’""I3$*-JG::6C；’：)*+S"E)*+S#， 常规 OLS法扩增 !"#(&启动子序列、34JQ-加尾 !"#(&3C4D486C（%""I3）；/：,-."E/0+"，$%&’(（%V"I3）； >：/0+"E123"，34JQ-（/V"I3）@ 信号序列以及 $%&’( 报告基因序列后，按方法’0/0’ （登录号：A!%.>"）中的对应区域的相似性均为 构建重组载体3+T(?&($BS6:(O4JQ-，该载体的酶切鉴 VV[；克隆的 $%&’( 报告基因序列与质粒 3$BS6:( 定如图 / 所示。用 )*+S"U)*+S#、,-."U/0+"、 *’中对应序列的同源性为 ’""[。其中，!"#(&启动 /0+"U123"组合分别酶切，可切出%"" I3（!"#(&）、 子片段测序结果如图>所示。 %V" I3（$%&’(）和 /V" I3（34JQ-）的片段，表明重组 根据相关文献（YC\6JGM，’VV#；向仲怀，/""#）， 载体 3+T(?&($BS6:(O4JQ-已按预期正确构建。 我们推测#!>位的碱基 F为转录起始位点，并记为 #"# !"#%&启动子序列分析 “E ’”，在其 #] 上游侧翼区检索到 F-F- 盒 OLS克隆的 !"#(& 启动子、34JQ- 加尾信号以及 （F-F-F---F，^>>_ ^/#）和 L--F盒（YFL--FFF， $%&’( 报告基因序列经双向测序后用 W6784C *FX V0" ^’/‘_ ^’/’）。在 F-F-盒上游（^%>_ ^#V）亦发 软件分析，结果显示，克隆的 !"#(& 启动子序列和 现同 !"#(;基因上游近端-、N区相同的特征性保守 34JQ-加尾信号与Y69NG9M中已登录的 !"#(&全序列 图> !"#(&启动子中特征性基序 ?21@ > A4825B45 !"#(&3C4D486C 黑体为转录起始位点，记为E’FCG9B7C23824929282G8249B286HGB29I4J:5G76，G9::69486:GB E’；方框为F-F-盒F-F-I4KHGBI4K6:； 阴影为推测的L--F盒 L--FI4K(J2M66J6D698HGBB=G:6:；下划线序列与 !"#(;启动子-、N区同源OC486295G784CC6741928249B28629 -C61249HGBP9:6CJ296:；双下划线为类果蝇同源异型域蛋白结合位点;$3C486295G784CC6741928249B286HGB:4PIJQP9:6CJ296:； 斜体为引物序列OC2D6CB6RP6976BH6C62928GJ27@ JJD 昆虫学报 ()%&*+%,-,’,.")&/"+")& JD卷 序列（!"!!!），该区域为丝腺组织特异性结合因子 !(((!基序，可能包括 #"$%+、#"$%I、#"$%* 因子的 #"$%&的结合位点，同时亦是泛在因子 $’$%(&的结 结合位点（向仲怀，+DDJ）。 合位点。在上游远端区（)*+,- )*&.）可检索到与 利用U@(:98L?9L82*C+软件对克隆的 !"#%E启动 果蝇同源异型蛋白（/0120301456 7809256:，;<）的结 子的单链序列进行分析，结果表明该序列中存有许 合区域高度同源的保守序列!=((!((!!。 多反向重复序列，如：((!"!=（ ) I,H - ) I,+）与 用>2?908 @!A BCD软件比对分析克隆的 !"#%E启 "(=(!!（)IJ*- )I*B）、((!((!!（)I.B- )I.I） 动子序列与"26’46F中已登录的 !"#%E全序列（登录 与((!!(!!（)IHH- )IH&）、"((="!（)B.- )BI） 号：GH,*ID）中的对应区域，结果显示，克隆序列的 与"="!!=（) .D - ) HJ）、((!!!!（) JDJ - ) JDD） )*H（+ !）、)**（J !）、)*&（& (）、)+&（* "）、)&D（J (） 与 ((((!!（ ) *H, - ) *H&）、(=""!"=（ ) *B* - 位点在 GH,*ID 对应位点的碱基分别为 =、=、!、(、 )*..）与 "=(!="!（ ) *.I - ) *HH）、=("!!((( "；)*D&- )IBB位点为 (((，GH,*ID序列对应位 （)+..- )+.&）与 !!!((=!（ ) &++ - ) &&J）、 点为缺失。此外，!"#%E启动子的)*&,- )++H序列 ("!!(((!!（ ) +.H - ) +HB）与 ("!!!((=!（ ) +DJ 与 !"#%;启动子的)+HI- )&BI序列存在很大程度 - )&BH）等，这些序列间的相互配对，可形成多个潜 的同源性（K5FL?/5 $% &’M，&BB+），将克隆的 !"#%E 启 在的茎环结构，部分结构如图*所示。 动子 序 列 与 !"#%; 启 动 子（"26’46F 登 录 号： 在后部丝腺细胞核中存在有许多蛋白因子，它 ($++,,..）的相应区域进行比对分析，结果显示二者 们可以和 !"#%;与 !"#%E 所共有的 JV上游元件结合 间的同源性约JIN。 （向仲怀，+DDJ）。图*（?）中包含有核心的 !((!基 以软件 "Q@Q!RS%TA@（>28:506 JC&）分析克隆 序，有可能是 #"$%+、#"$%I、#"$%*因子的结合区域； 的 !"#%E启动子序列，结果显示其上游区域（)*ID- 图*（/）中包含推定的 =((! 盒；图 *（W）中包含 )+ID）富含 (!（HJN）和重复序列，如：((!((!! !(!(盒以及与 !"#%;启动子(、’区同源的序列，是 （)*+*- )*&.，)I.B- )I.I）、!!(((!!（ ) *&. - #"$%&和 $’$%(&结合位点。此外，还有一些包含未 )*&+，)+.J- )+HB）、(!!!!((!!（)I&H- )IDB， 知功能序列的茎环结构，这些结构有可能使得启动 )J& - ) *I）、"!!((!!（ ) +HJ - ) +,B，) JD. - 子区域内原本相距较远的一些调控因子的作用序列 )JD+）等等，并且还可检索到较多的寡聚3(和寡聚 相互靠近，从而通过调控因子间的协调作用发挥其 3!区段。在这些重复序列中多含有核心的!((!或 顺式调控功能。因此，推测其中的部分茎环结构有 图* !"#%E启动子的部分二级结构分析 $5OM * #2?063:98L?9L820P !"#%E78010928 GGW 昆虫学报 A,*2=.*"#"/"8(,2>(.(,2 G6卷 究，提示在荧光报告基因标记的转基因家蚕研究中 模式分析研究E 生物化学与生物物理进展，T（5 P）：VW6HVW7］ 也应选择合适的蚕品种，以避免荧光背景的干扰。 Y. N,，FII68 ’%: ,:<&$.@*.<#@ ,$&:;$: &; O%&;#E ,%#;1%#&：,%#;1%#& ,$&:;*&=&$#;"’:$%;&$#@Z.?@&4%:<4E FPWCCE［吕鸿声，FII68 中国养 参 考 文 献（!"#"$"%&"’） 蚕学E 第F版E 上海：上海科学技术出版社EFPW页］ ,#$$%:**&!，,.?<#)#;&#)b，K(U&;’+，!@?:<*&,，56658 0@&1():<&-#*&(;(= !"#$%&’，’()&*#+，,%&)&-./，01#2#,，3(4%&-#*(/，56678 9:;:<#*&(; 90:+; &4 <:S.&<:" =(< *%: 1:;:<#*&(; (= # =.;$*&(;#@ <:" =@.(<:4$:;* (= %>?<&" *<#;41:;&$ 4&@A2(<)4 *%#* :BC<:44 !"#$%& #"’( C<(@>@D $%<()(C%(<:E <=!>?+**+’0，G5G：FTHFIE %>"<(B>@#4:!D4.?.;&*4 #;" %.)#; $(@@#1:;4 &; C(4*:<&(< 4&@A 1@#;"4： ,.)):<4+L，,)&*%9\，FIPV8 !)#;.#@(=):*%("4=(<?#$.@(U&<.4U:$*(<4 C<(".$*&(;(=$($((;4*%#*$(;*#&;:"$(@@#1:;42&*%%>"<(B>@#*:"C<(@&;: #;"&;4:$*$:@@$.@*.<:C<($:".<:4E @+&20A8’(,B/*B’2/=&4+’(#+.*>*2*(". <:4&".:4E )E !("*+,-."/E，F57：56GH5FIE !B//+*(.，（FGGG）：F6HFP，TPHW7E J.4*(4++，9.&@*&;#; +K，K(<"#;( K，J:1.) L，/#@A#; M!，N#@@ ’O， ’#).<#’，’%&?:<*O，Q(>:<O，/#;"#’，!?<#%#)\，/#)?#+，/()(*( FIPI8 Q:1.@#*&(; (="D1@.$.<(;&"#4: :BC<:44&(; &; *<#;41:;&$ *(?#$$( ^，’%()#4 KY，+#.$%#)C J，O%#U#;$> 9，,%&<A Z，M<#4:< +， C@#;*4?>#;!R’D<&$%，,(0D#$*&;14:S.:;$:=(.;".C4*<:#)(=#M<:;$% Z<."%()): KO，O(.?@: Z，56668 9:<)@&;: *<#;4=(<)#*&(; (= *%: ?:#;"DC%#4:(@&;1:;:E 1/2.*3+//，（F I）：PTIHPGTE 4&@A2(<)，!"#$%& #"’( YE .4&;1 # C&11>J#$，*<#;4C(4(;D":<&U:" N&;( Q，’()&*# +，3(4%&-#*( /，56678 ’%: 1:;:<#*&(; (= 1:<)@&;: U:$*(<E C2*B’+!("*+,-."/E，F（P F）：PFHPWE *<#;41:;&$4&@A2(<)4=(<*%:C<(".$*&(;(=?&(@(1&$#@@>#$*&U:<:$()?&;#;* ’#;1,+，3& 3_，,%:; ‘K，_%#;1_M，Y& 3Q，N: KY，566T8 M.;$*&(;#@ =.4&(; C<(*:&;4 (= =&?<(&; #;" %.)#; ?#4&$ =&?<(?@#4* 1<(2*% =#$*(<E #;#@>4&4 (= *%: @#<U#@ 4:<.) 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