Universidad Complutense de Madrid Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I Biología estructural de la reparación de roturas de doble cadena en el ADN TESIS DOCTORAL Angel Rivera Calzada Madrid, 2008 Universidad Complutense de Madrid Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I Memoria presentada para optar al grado de Doctor por Angel Rivera Calzada Universidad Complutense de Madrid Julio de 2008 Esta Tesis ha sido realizada en el Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC) bajo la dirección del Dr. Óscar Antonio Llorca Blanco. Para Lucía, Eduardo, Alberto y Laura Agradecimientos C omencé esta tesis el 3 de junio del 2002. Han sido seis años en los que he tenido la suerte de hacer lo que me gusta rodeado de gente excepcional. En todo este tiempo han sido muchas las personas que han invertido tiempo y esfuerzo en este proyecto y por ello quiero hacer patente mi agradecimiento. Oskar nada de esto habría sido posible sin ti, sin tu esfuerzo, dedicación, criterio, motivación, ilusión, paciencia infinita y un largo etcétera. En estos años te he visto pasar de “post-doc” a Investigador Científico y no he dejado nunca de aprender de ti, tanto en lo profesional como en lo personal. Oskar te llevas mi más sincero y profundo agradecimiento. Este trabajo tampoco habría sido posible sin la colaboración de Laurence H. Pearl. Gracias por proporcionarnos los distintos especimenes analizados, especialmente a Laura Spagnolo y a Neil Rzechorzek que han sido los encargados de lidiar con su purificación. Además también me gustaría agradecer a Pablo Chacón la ayuda prestada durante los experimentos de análisis vibracional de DNA-PKcs y ATM. Gracias a José Jesús Fernández por solucionarnos todas las dudas durante la corrección de CTF. Me gustaría expresar mi agradecimiento al servicio de microscopía electrónica del CNB por habernos facilitado en todo momento el uso y disfrute del FEG (gracias Rocío y Cris). No puedo olvidarme de los organismos e instituciones que me han financiado durante este período de tiempo. Mi más interesado agradecimiento para el Ministerio de Ciencia y Tecnología y para el programa I3P del CSIC. Desde un punto de vista más personal tengo también muchas cosas que agradecer. Jaska de ti no me iba a olvidar, ¿dónde estaría yo ahora si no te hubieras acordado de mi?. Gracias Jaskita por estar siempre ahí. ¿Y vosotros compañeros?, ¡no sabéis lo importante que sois para mí!. Hemos pasado muchas horas juntos y en todo este tiempo siempre he estado encantado de teneros cerca. Gracias por saber escuchar, por saber discutir, por saber aportar. Gracias a Magi, a Eva, a Bego, a Rafa y a Gabriel. Gracias sobre todo a ti Ernesto, por ser un compañero excepcional y por muchas más cosas. Gracias también al servicio de Microscopía Electrónica del CIB, a Lola Guirao y Carmen Terrón, por conseguir que las horas de microscopio se hagan mucho más llevaderas. En este tiempo he coincidido con compañeros de muy diversos grupos. Muchos de ellos ya no están en el CIB y otros se acaban de incorporar, y a todos ellos me gustaría expresar mi agradecimiento por hacer que mi paso por este centro haya merecido la pena. Luque e Isra, gracias por seguirme hasta el infinito y más allá (entiéndase por infinito “la valla”). En definitiva gracias por darlo todo cuando hay que darlo. Gracias también a los compañeros de los laboratorios de Pablo Chacón, Germán Rivas, Jesús Jiménez Barbero, Francisco Javier Cañada, Antonio Romero, Guillermo Jiménez, Fernando Díaz, Luis Rivas, Rafa Giraldo, Miguel Ángel Vidal, Vicente Larraga, José Manuel Andreu, Rosa Lozano y Teresa Suárez. Concretamente gracias a Nuria, Ángeles, Elena, Carmen, Pilar, José Ángel, Chus, Bea, Ariadna, Mercedes, Patrick, Carmencita, Sonia, Terepower, Mon, Nacho, Víctor, Inés, Mónica, Carlos, Arturito, Iñaki, Mariqui, Félix, Mateo, Blas, Gonn, Juan, Jose, Marian, Rubén, Isabel, J. Gayarre, Fran, el Niño, Joao, Marta, … Gracias también al B-14 porque fue allí donde empezó todo. Jaimito no te me enfades, ya sabes que te adoro. Gracias a los compañeros de los laboratorios de J. L. Carrascosa, José María Valpuesta, Cristina, J.R y José María Carazo. Siempre da gusto visitaros. Gracias a Sjors y a Javi Chichón. Gracias a los Biolocos por hacer inolvidables los años de facultad. Gracias Raúl, Gabi, Marta, Tomás, Lucía, Isabel, Cristina, Yolanda y Ángela. Gracias a los Bioquímicos por aceptar mis rarezas y por no dejarme nunca en paz. Gracias Fer, Rafa, Chus, Montse, Gloria, Ana, Juanfran, Laura, Raquel, Mamen, Eva, Pilar y Víctor. Y porque hay vida más allá de la ciencia gracias también a David y Fernando, a Rodrigo (la arqueología no era lo mío golfo), a Patricia (¡al final lo conseguí!, ¡ahora te toca a ti!), a Juanma por hacerme correr más que a su abuela, a Wyatt (my best Chinese friend), a Iñigo (¡gracias jartolari!), a Idoia, Bevan, Jorge, Paco, Moncho, Andrés, José María, … Gracias al balonmano (Gustavo) y al Valdeluz (Nélida, María José y Padre Soto). Gracias a la Antilla por existir. Sobre todo y más que a nadie gracias a vosotros familia, a mis padres Eduardo y Lucía y a mi hermano Alberto. Sois lo más valioso que tengo. Todo os lo debo a vosotros, a vuestro ejemplo. Vosotros sabéis quién soy y siempre estaréis a mi lado. Tenéis toda la culpa de esto, ¿cómo se os ocurrió regalarme el Micronova?. Por último me gustaría darte las Gracias a ti Laura. Gracias por creer en mi, por demostrármelo todo y gracias, en definitiva, por lo más importante, por hacerme FELIZ. Bueno señor@s, hasta aquí llegamos. Relájense y disfruten. Va por ustedes. ARC (Angelito/illo) Madrid 12+1 Junio 2008 Summary Double strand DNA breaks (DSBs) are one of the most challenging threats for cell viability. The main mechanism to repair DSBs in higher eukaryotes is the process known as non-homologous end-joining (NHEJ) which consists in the ligation of the generated ends after the break using no template. The components that participate in this repair pathway play a fundamental role in maintaining genomic stability. Furthermore they participate in programmed DNA breaks mediating biological processes such as V(D)J recombination. During NHEJ the Ku protein binds to the generated ends and recruits the catalytic subunit of the DNA Dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) to the DSB. The DNA-PKcs:Ku complex formed on a DNA end acts then as a scaffold for the additional enzymatic activities required during the repair process. Besides, the interaction of two DNA-PKcs:Ku:ADN complexes can create a synaptic complex that holds both DNA ends together avoiding their diffusion. Some DSBs could require the processing of the generated ends prior to the final ligation of both ends. The nuclease Artemis has been implicated in this processing in association with DNA-PKcs and, additionally, the DNA-PKcs:Artemis complex has been proposed to act as the enzyme that opens the hairpin present in the coding ends during the V(D)J recombination process. The focus of my Ph.D. project consists in the structural determination of molecular complexes implicated in the repair of DSB by NHEJ. To carry out this analysis I have used structural techniques based on the combination of electron microscopy and single particle analysis. More specifically I have solved the structure of full-length Ku alone and after binding to DNA. These structures have provided a structural model that explains the conformational changes that take place in Ku upon DNA end recognition and their functional implications. Also, I have determined the structure of DNA-PKcs that, combined with further analysis, has provided a structural model that explains the overall topology of this kinase. The conformational changes that take place in DNA- PKcs upon recognition of DNA have also been characterised. Upon DNA binding significant movements in key domains of DNA-PKcs seem to act as transducer of DNA recognition to the catalytic domain. Additionally I have solved the structure of the DNA- PKcs:Ku:DNA complex providing important clues in the structural basis of the NHEJ reaction. When analysing the DNA-PKcs:Ku:DNA complex the presence of a dimeric complex constituted by two DNA-PKcs:Ku:DNA complexes facing each other was observed. The structure of this dimeric complex is fully compatible with the requirements described for the synaptic complex that participates in the NHEJ process. Finally I have also determined the biochemical requirements to form a complex between DNA-PKcs and Artemis proteins in our experimental conditions. This analysis has provided the initial characterization required for future structural studies of the DNA-PKcs:Artemis complex. Overall, the results presented in this Thesis have contributed to our understanding of the structural basis of the NHEJ DNA repair reaction. The work provides the structural foundations of some of the biological functions and regulatory mechanisms of DNA-PKcs and Ku.