Heidelberger Taschenbiicher Band 249 M. Holtzhauer Biochemische Labormethoden Arbeitsvorschriften und Tabellen Unter Mitarbeit von V. Hahn Mit 13 Abbildungen und 68 Tabellen Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York London Paris Tokyo Autor: Dr. Martin Holtzhauer Zentralinstitut flir Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der D D R Robert-Rossle-StraBe 10, Berlin-Buch, DDR-1115 Mitarbeiter: Dr. Volkmar Hahn Zentralinstitut flir Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der D D R Robert-Rossle-StraBe 10, Berlin-Buch, DDR-1115 ISBN-13: 978-3-540-19267-1 e-ISBN-13: 978-3-642-97111-2 DOl: IO.1007/978-3-642-97111-2 CIP-Titelaufnahme der Deutschen Bibliothek Holtzhauer, Martin: Biochemische Labormethoden : Arbeitsvorschriften u. Tab. / M. Holtzhauer. Unter Mitarb. von V. Hahn. - Berlin; Heidelberg; New York; London; Paris; Tokyo: Springer, 1988 (Heidelberger Taschenbiicher ; Bd.249) NE:GT Dieses Werk ist urheberrechtlich geschiitzt. Die dadurch begriindeten Rechte, ins besondere die der Obersetzung, des Nachdrucks, des Vortrags, der Entnahme von Abbildungen und Tabellen, der Funksendung, der Mikroverfilmung oder der Ver vielfliltigung auf anderen Wegen und der Speicherung in Datenverarbeitungsanla gen, bleiben, auch bei nur auszugsweiser Verwertung, vorbehalten. Eine Vervielfal tigung dieses Werkes oder von Teilen dieses Werkes ist auch im Einzelfall nur in den Grenzen der gesetzlichen Bestimmungen des Urheberrechtsgesetzes der Bun desrepublik Deutschland yom 9. September 1965 in der Fassung Yom 24.Juni 1985 zulassig. Sie ist grundsatzlich vergiitungspflichtig. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des Urheberrechtsgesetzes. © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1988 Softcover reprint of the hardcover I st edition 1988 Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, daB solche Namen im Sinne der Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten waren und daher von jedermann benutzt werden diirften. Datenkonvertierung, Druck, Einband: G.Appl, Wemding 2151/3140-5 4 3 2 1 0 - Gedruckt auf saurefreiem Papier Vorwort Biochemische Methoden flieBen in immer zahlreichere benachbarte Wissensbereiche ein. Fur die Losung der jewei ligen Aufgaben werden altbewahrte ebenso wie erst vor wenigen lahren publizierte Laborverfahren benotigt. Meist besitzt der in den biowissenschaftlichen Disziplinen Arbeitende eine Vielzahl von ausgefeilten Spezialvorschrif ten fUr die Losung der unmittelbaren Arbeitsaufgaben, fur nicht taglich benotigte Methoden ist man jedoch auf die Suche in der Fachliteratur angewiesen, und nicht immer laBt sich die in einer Publikation beschriebene Methode ohne Schwierigkeiten nacharbeiten. Aus dieser Erfahrung heraus resultiert das Bemuhen, eine begrenzte Auswahl von Labor vorschriften und Tabellen zusammenzustellen, die auf ihre Praktikabilitat hin uberpriift wurden und die hiermit den im Titel genannten Fachkollegen in der Form von Arbeitsvor schriften vorgelegt werden in der Hoffnung, daB ihre Beschreibung so erfolgte, daB bei einiger Laborpraxis ein muheloses und erfolgreiches Nacharbeiten moglich ist. Die Auswahl wurde unter dem Gesichtspunkt getroffen, moglichst vielseitig verwendbare Labormethoden aufzuneh men, aber selbstverstandlich waltet in jeder Auswahl eine gewisse Willkur. Ebenso konnen die "Biochemischen Labor methoden" nicht die Originalliteratur ersetzen, die in der Regel bei den Vorschriften oder Kapiteleinleitungen als Quelle angegeben wurde. Auch wurde auf die Aufnahme von Analysenverfahren fUr spezielle Substanzen und Enzyme verzichtet, da fUr dieses Gebiet eine Beschrankung, die der Handlichkeit dieser Arbeitsblatter dienen sollte, unmoglich erscheinen laBt. Es wurde auch bewuBt auf Erlauterungen zur Theorie der vorgestellten Methoden ver zichtet. Entsprechende einfuhrende Literatur ist sicherlich in der unmittelbaren Umgebung des Nutzers der "Biochemi schen Labormethoden" zu finden. VI Vorwort Der Zweck dieser Zusammenstellung ware erfUllt, wenn sie als praktisches Hilfsmittel im Labor die tagliche Routine erleichterte oder zur eigenen Sammlung von bewahrten Vor schriften anregen wurde. Besonders soll aber erreicht wer den, die Scheu vor einer Erweiterung des individuellen Methodenspektrums abzubauen und die Arbeitsmethoden, sowohl die der Originalliteratur als auch die hier vorgelegten und die eigenen, kritisch zu uberprufen und zu erweitern. Schlief3lich sei allen Kollegen, die durch eine angeregte Diskussion die Zusammenstellung dieser Methodensamm lung forderten und einer ersten kritischen Uberprufung unterzogen, herzlich gedankt. Ganz besonderer Dank gebuhrt Herrn Prof. Dr. H. Bielka, Berlin-Buch, fUr seine tat kraftige UnterstUtzung wahrend der Abfassung des Manu skripts. Dem Vorstand, Herrn Prof. Dr. H. Glossmann, und den Kollegen des Instituts fUr Biochemische Pharmakologie der Universitat Innsbruck bin ich zu ganz besonderem Dank fUr die anregenden Diskussionen, freundschaftlich-kritischen Hinweise und die Moglichkeit zur technischen Bewaltigung der Manuskriptarbeiten verpflichtet. Berlin-Buch Martin Holtzhauer Inhaltsverzeichnis 1 Quantitative Methoden . . . . . . . . . . 1 1.1 Quantitative Proteinbestimmungen . . . . . 1 1.1.1 Proteinbestimmung nach Lowry u. Mitarb. 2 1.1.2 Proteinbestimmung nach Lowry u. Mitarb. in Gegenwart storender Begleitsubstanzen . 4 1.1.3 Proteinbestimmung nach Bradford . . . . . 5 1.1.4 Proteinbestimmung in Probenlosungen fUr die SDS-Gelelektrophorese . . . . . . . . . 6 1.1.5 Proteinbestimmung mit Amidoschwarz 7 1.1.6 Mikro-Biuret-Methode ........ . 8 1.1.7 Proteinbestimmung durch UV-Messung 8 1.2 Quantitative N ukleinsaurebestimmungen 9 1.2.1 DNS-, RNS- und Proteintrennungsgang nach Schmidt und Thannhauser ..... . 9 1.2.2 RNS-Bestimmung mit Orcin .... . 10 1.2.3 DNS-Bestimmung mit Diphenylamin 10 1.2.4 DNS- bzw. RNS-Bestimmung in Gewebehomogenaten . . . . . . . . . 11 1.2.5 Quantitative Nukleinsaurebestimmung durch UV-Messung ................ . 12 1.3 Quantitative Phosphatbestimmungen. . . . 15 1.3.1 Bestimmung von anorganischem Phosphat 15 1.3.2 Bestimmung von Gesamt-Phosphat 15 1.3.3 Phospholipid-Bestimmung 17 1.4 Monosaccharid-Bestimmung . . . . 17 2 Gelelektrophoretische Methoden . 19 2.1 Elektrophoresesysteme ...... . 19 2.1.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli ................... . 21 VIII Inhaltsverzeichnis 2.1.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Weber, Pringle und Osborn . . . . . . . . . . 24 2.1.3 Harnstoff-SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . 26 2.1.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei ph 2.4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.1.5 Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei ph 2 ......................... 29 2.1.6 Anodisches diskontinuierliches Polyacrylamid- Gelelektrophoresesystem ......... 30 2.1.7 Kathodisches diskontinuierliches Polyacrylamid-Gelelektrophoresesystem . 31 2.1.8 Zweidimensionale Polyacrylamid- Gelelektrophorese (O'Farrel-Technik) . . . . .. 32 2.1.9 Nicht-denaturierende Nukleinsaure Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . 35 2.1.10 Denaturierende Nukleinsaure-Elektrophorese . 37 2.1.11 Identifizierung von Phosphoaminosauren . . .. 38 2.2 Hilfsmittel fUr die Kontrolle der Elektrophorese 40 2.2.1 Markerfarbstoffe fUr die Kontrolle der Elektrophorese . . . . . . . . . . .. ..... 40 2.2.2 Eichproteine fUr die Polyacrylamid Gelelektrophorese . . . . . . . . . . 41 2.2.3 Kovalente Farbmarkierung von Eichproteinen 42 2.3 Farbemethoden. . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2.3.1 Proteinfarbung mit organischen Farbstoffen . 43 2.3.2 Silberfarbung von Proteinen (Glutaraldehyd-Fixierung) ........... 45 2.3.3. Silberfarbung von Proteinen (Formaldehyd-Fixierung) .. . .... 47 2.3.4 Silberfarbung von Glycoproteinen und Polysacchariden . . . . . . . . . . . . . 48 2.3.5 Abschwachen von silbergefarbten Gelen . . .. 49 2.3.6 Farbung von Proteinen auf Nitrocellulose mit Tusche. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 2.3.7 Farbung auf Nitrocellulose mit kolloidalem Gold. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Inhaltsverzeichnis IX 2.3.8 Farbung von Proteolipiden bzw. Lipiden und Lipoproteinen ................ .. 51 2.3.9 Farbung von Glycoproteinen und Polysacchariden mit Schiffschem Reagenz (PAS staining) ........ . . . . . . . . 52 2.4 Elektroelution aus Gelen .. . . . . . . . . 53 2.4.1 Quantitative Elektroelution von Proteinen aus Polyacrylamid-Gelen und Entfernung von SDS. 53 2.4.2 Elektrotransfer von Proteinen (Western blot) 54 2.4.3 Immunochemischer Antigennachweis nach Elektrotransfer . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 2.4.4 Glycoprotein-Detektion nach Elektrotransfer 57 2.4.5 Transfer von Nucleinsauren . . . . . 58 2.5 Trocknung von Elektrophoresegelen 60 2.6 Autoradiographie von 3H_ und 35S-markierten Verbindungen in Elektrophoresegelen . . . .. 61 3 Chromatographische Methoden ........ 63 3.1 Diinnschichtchromatographie (DC) ....... 63 3.1.1 Diinnschichtchromatographie von modifizierten Aminosauren (Bestimmung der N-terminalen Aminosaure im Polypeptid) . . . . . . 63 3.1.2 Trennung von Nukleosidphosphaten . . . . .. 67 3.1.3 Lipidextraktion und Diinnschicht- chromatographie von Lipiden. . . . . 69 3.2 Saulenchromatographie. . . . . . . . 71 3.2.1 Konzentrierung von Proteinlosungen . 71 3.2.2. Praktische Hinweise zur Saulenchromatographie 74 3.2.3 Vorbehandlung von Ionenaustauscher- Materialien . . . . . . . . . 85 3.3 Affinitatschromatographie....... 87 3.3.1 Bromcyanaktivierung von Polysaccharid- Chromatographietragern ........ 90 3.3.2 Kopplung an Bromcyan-aktivierte Gele . 91 3.3.3 Kopplung von Reaktivfarbstoffen an Polysaccharide . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 93 X Inhaltsverzeichnis 3.3.4 Kovalente Bindung von Biotin (Biotin-Avidin/Streptavidin-System) . . . . . .. 94 4 Immunchemische Methoden . 96 4.1 Heidelberger-Kurve . . . . . . 96 4.2 Doppelt-radiale Immunodiffusion nach Ouchterlony .................... 98 4.3 Immunelektrophorese . . . .... 100 4.4 Gegenstromelektrophorese · 101 4.5 dot-blot-Test ....... . · 102 4.6 Enzym-Immunosorbent-Test (EIA bzw. ELISA) 103 4.7 Meerrettichperoxidase-Immunoglobulin- Konjugat (Glutaraldehyd-Methode) . . . . 105 4.8 AIkalische-Phosphatase-Immunoglobulin- Konjugat (Glutaraldehyd-Methode) 107 4.9 Protein-kolloidales-Gold-Komplex . . 109 5 Ultrazentrifugation . . . . 112 5.1 Differentialzentrifugation . 113 5.2 Dichtegradientenzentrifugation . 114 5.2.1 Stufengradientenzentrifugation. 116 5.2.2 Saccharosegradientenzentrifugation 117 5.2.3 Isopyknische Zentrifugation .... . 120 5.3 Drehzahl-Zentrifugalbeschleunigungs- Nomogramme . . . . . . . . . . . . . . 125 6 Nukleinsaure-Sequenzanalyse (Y. Hahn) 127 6.1 DNS-Sequenzanalyse . . . . . . . . . 127 6.1.1 Chemisches Sequenzierungsverfahren (Maxam-Gilbert-Verfahren) ..... . · 127 6.1.2 Enzymatisches Sequenzierungsverfahren (Sanger-Technik), Prinzip der basenspezifisch beendeten Synthese (Kettentermination) ..... 148 Inhaltsverzeichnis XI 6.2 RNS-Sequenzanalyse.. . . . 155 6.2.1 Markierung der RNS .... . 156 6.2.2 Sequenzierung der RNS mittels basenspezifischer chemischer Spaltung . . 159 6.2.3 Sequenzierung durch basenspezifische enzymatische Spaltung. . . . . . . . . . . 161 6.2.4 Basenspezifische chemische Spaltung von RNS an einem Trager (Festphasen-Sequenzanalyse) . 163 7 Markierung mit radioaktiven Isotopen . 166 7.1 [32p]-Phosphatinkorporation in Proteine . 167 7.2 Iodierung mit 125I-Iodverbindungen . 169 7.3 Radioaktiver Zerfall . . . . . . . . . . 171 7.4 Zerfallstabellen fUr Phosphor-32, Schwefel-35 und Iod-125 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 7.5 Szintillator-Losungen fUr die Flussigszintillati onsmessung . . 174 8 Puffersysteme und pH-Wert .......... 176 8.1 pk-Werte und Molmassen von Puffersubstanzen 176 8.2 Diagramm zur Pufferberechnung . . 177 8.3 pH-Farbindikatoren........ . 180 8.4 Nomogramm zur Herstellung von Phosphatpuffem mit definierter Ionenstarke . 182 8.5 Pufferlosungen . 184 8.6 pH-Eichpuffer . 188 9 Reinigungsvorschriften filr ausgewahlte Laborchemikalien. . . . . . . . . . . . .. . 190 10 Tabellen...... . 193 10.1 Konzentrationsma13e . . . . . 193 10.2 Umrechnung SI-fremder Ma13einheiten in SI-Einheiten ................. . 193