T.C. HİTİT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAZI ANTİFUNGAL İLAÇLARIN TERS FAZ SIVI KROMATOGRAFİK YÖNTEMLE ANALİZLERİ İÇİN METOT OPTİMİZASYONU Fatma BAŞARAN YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI DANIŞMAN Yrd. Doç. Dr. Senem ŞANLI HAZİRAN 2012 ÇORUM iv BAZI ANTİFUNGAL İLAÇLARIN TERS FAZ SIVI KROMATOGRAFİK YÖNTEMLE ANALİZLERİ İÇİN METOT OPTİMİZASYONU Fatma BAŞARAN HİTİT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HAZİRAN 2012 ÖZET Bu çalışmada, mantar enfeksiyonu tedavisinde önemli bir yere sahip olan fentikonazol, itrakonazol, izokonazol, ketokonazol, mikonazol, ornidazol, tinidazol ve tiokonazolun iyonlaşma sabitleri su ve su-organik çözücü karışımlarında ters faz sıvı kromatografik ve spektroskopik yöntemler ile tayin edilmiştir. Spektrofotometrik metot, nötral ve iyonik türlerin farklı absorbans özelliklerine sahip olması prensibine dayanır. Bunun için belli bir dalga boyu aralığında kaydedilen absorbans verilerinden yararlanılır. Bu kriterler sağlandığında elde edilen sonuçların kesinliği oldukça iyidir. Buna ilave olarak, iyonlaşma sabitleri iyonlar arası etkileşimler olmaksızın doğrudan ölçülebilir. HPLC ile iyonlaşma sabitlerinin tayini, günümüzde sıvı kromatografik yöntemle ayrılmaları istenen bileşiklerin ayırmalarının optimizasyonunda ilk aşamadır. İyonlaşma sabitlerinin hesaplanmasında gerekli grafikler yanı sıra bu amaç için geliştirilmiş bilgisayar programlarından yararlanılmıştır. HPLC yöntemlerinde elde edilen veriler ileayırmanın optimizasyonu sağlanmıştır. Anahtar Kelimeler: Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC), Spektroskopik Yöntem, İyonlaşma sabitleri, fentikonazol, izokonazol, itrakonazol, mikonazol, ketokonazol, ornidazol, tinidazol, tiokonazol. v REVERSE PHASE LIQUID CHROMATOGRAPHIC METHOD FOR THE ANALYSIS OF SOME ANTIFUNGAL DRUGS OPTIMIZATION METHOD Fatma BAŞARAN HITIT UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY JUNE 2012 ABSTRACT In this study, which has an important place in the treatment of fungal infection fenticonazole, itraconazole, izoconazole, ketoconazole, miconazole, ornidazole, tinidazole, and tioconazol ionization constants of water and water-organic solvent mixtures were determined by reversed-phase liquid chromatographic and spectroscopic methods. Spectrophotometric method is based on the principle that neutral and ionic species have different spectra. When all these criterias met, the precision of the following results was good enough. Moreover, the true dissociation constants can be measured directly without inter-ionic effects having to be considered. Determination of ionization constants by HPLC is the first step of optimization liquid chromatographic method. For calculation of ionization constants, graphics and computer programs developed for this purpose were used. Optimization of separation was setup by the data obtained from HPLC methods. Key words: HPLC, spectroscopic method, ionization constants, fenticonazole, izoconazole, itraconazole, miconazole, ketoconazole, ornidazole, tinidazole, tioconazole vi TEŞEKKÜR Çalışmalarım süresince bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım, yardımlarıyla beni yönlendiren tez danışmanım, değerli hocam Sayın Yrd. Doç. Senem Şanlı’ya çok teşekkür ederim. Değerli bilgi ve tecrübelerinden faydalandığım değerli hocam Doç. Dr. Nurullah Şanlı’ ya teşekkürlerimi sunarım. Laboratuar çalışmalarımın her aşamasında benden desteğini esirgemeyen arkadaşım Arş. Gör. Bediha Akmeşe çok teşekkür ederim. Hitit Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya bölümündeki bütün hocalarıma ve Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölüm Başkanı Sayın Prof. Dr. Ahmet Akbaş’a teşekkür ederim. Sonsuz bir sabırla bugünlere kadar gelmemi sağlayan, desteklerini esirgemeyen sevgili aileme, ingilizce öğretmeni kuzenim Sinem Barut’a teşekkür etmeyi borç bilirim. vii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET………………………………………………………………………………...iv ABSTRACT…………………………………………………………………………..v TEŞEKKÜR………………………………………………………………………….vi İÇİNDEKİLER……………………………………………………………………...vii ÇİZELGELER DİZİNİ……………………………………………………………...ix ŞEKİLLER DİZİNİ…………………………………………………………………..x SİMGELER VE KISALTMALAR………………………………………………...xiv 1. GİRİŞ………………………………………………………………………………1 2. KURAMSAL TEMELLER...……………………………………………………...3 2.1. Mantar Enfeksiyonları..……………...…………………………………………..3 2.2. Antifungal İlaçlar…………………...………..…………………………………..5 2.3. Çalışmada Kullanılan Maddelerin Kimyasal Farmakolojik Özellikleri…………8 2.3.1. Fentikonazol…….....……………………………………………….………8 2.3.2. İtrakonazol…………………...………………………………...…………..9 2.3.3. İzokonazol nitrat.......……………………………………………..…........11 2.3.4. Ketokonazol…………………….………………………………..…….....12 2.3.5. Mikonazol…………………………………………………….…………..13 2.3.6. Ornidazol………………………………………………………………….15 2.3.7. Tinidazol……………………………...…………………………………..16 2.3.8. Tiokonazol………………………………...……………………………..17 2.4. Kullanılan Etken Maddeler Üzerine Yapılan Çalışmalar………………………18 2.5. Su Organik Çözücü Karışımlarında pK Tayini………………………………..21 a 2.5.1. Spektroskopik yöntemler……………………………………………...…21 2.5.2. Sıvı kromatografik yöntemle pK tayini…………………...……………23 a viii Sayfa 3. MATERYAL VE YÖNTEM...………………………………………...…………41 3.1. Kullanılan Cihazlar...…………………………………………...…………..41 3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler..……………………………………………41 3.4. Kullanılan Çözeltiler...……………………………...…………………........43 3.4.1. Spektroskopik Titrasyonlar…………………...………………….....43 3.4.2. Kromatografik Çalışmalar…………………...……………………..45 3.5.Yöntem………………………………………………..…………………….46 3.5.1. Spektroskopik Titrasyonlar…...………………………………...…..46 3.5.2. HPLC Yönteminin Optimizasyonu...………………………...……..47 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA…………………………………48 4.1. Çalışılan Bileşiklerin ACD-Lab ve SPARC Programı ile Hesaplanan İyonlaşma Sabitleri……………………………………………………….48 4.2. İlaçların Spektroskopik Yöntemle İyonlaşma Sabitlerinin Tayini…………51 4.3. HPLC Yöntemiyle İyonlaşma Sabitlerinin Tayini........................................71 4.4. Fentikonazol, İzokonazol, Ketokonazol, Mikonazol ve Tiokonazol için Geliştirilen HPLC-DAD Yöntemine Ait Analiz Bulgular............................77 4.4.1.HPLC Sisteminin Optimizasyonu......................................................77 5. SONUÇ...................................................................................................................82 5.1. İlaçların pK Değerlerinin Spektroskopik ve HPLC Yöntemi İle Tayini...82 a KAYNAKLAR...........................................................................................................84 ÖZGEÇMİŞ................................................................................................................88 ix ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Kimyasal yapılarına göre sınıflandırılması……………………….......…6 Çizelge 2.2.Etki mekanizmasına göre sınıflandırılması..…………………………....6 Çizelge 2.3. Kullanıldığı hasta grubuna göre sınıflandırılması……………………....7 Çizelge 2.4. Asetonitril-su karışımında 0,05 M KHP için pHs değerleri…………...39 Çizelge 3.1. Çalışılan bileşikler ve özellikleri………………………………………42 Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler……………………………...43 Çizelge 4.1. Çalışılan bileşiklerin pH=5,5 de, çeşitli ACN-H O ortamları için 2 kromatografik verileri (t : alıkonma zamanı, k: kapasite faktörü, : R seçicilik)…………………………………………………………………….78 Çizelge 4.2. Çalışılan bileşiklerin pH=6 da, çeşitli ACN-H O ortamları için 2 kromatografik verileri (t : alıkonma zamanı, k: kapasite faktörü, : R seçicilik)…………………………………………………………………….79 Çizelge 4.3. Çalışılan bileşiklerin pH=5,5 de çeşitli ACN-H O ortamları için 2 kromatografik verileri……………………………………………….80 Çizelge 4.4. Çalışılan bileşiklerin pH=6 da çeşitli ACN-H O ortamları için 2 kromatografik verileri……………………………………………….80 Çizelge 5.1. Su, % 10 ve % 20 ACN-su (v/v) karışımına ait spektroskopik titrasyon verileri………………………………………………………….……….82 Çizelge 5.2. Fentikonazol, izokonazol, ketokonzol, mikonazol ve tiokonazolun iyonlaşma sabiti değerleri……………………………………………83 x ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Fentikonazolün molekül yapısı….………………….……………………...8 Şekil 2.2. İtrakonazolün molekül yapısı……………………………………………...9 Şekil 2.3. İzokonazol nitratın molekül yapısı ………………………………..……..11 Şekil 2.4. Ketokonazolün molekül yapısı...………………………………………....12 Şekil 2.5.Mikonazolün molekül yapısı …………………..…...……………………13 Şekil 2.6. Ornidazolün molekül yapısı…………………...………………….………15 Şekil 2.7. Tinidazolün molekül yapısı………………………………………………16 Şekil 2.8. Tiokonazolün molekül yapısı………….…………………………………17 Şekil 2.9. Spektroskopik bir çalışmada (a) A - /nm ve (b) log absorbans farkı - pH grafikleri (A’: moleküler türün absorbansı; A’’: iyonik türün absorbansı)………………………………………………………………..22 Şekil 2.10. Kromatografik ayırımın şematik olarak gösterilmesi…...………………25 Şekil 2.11. Sıvı-sıvı dağılım kromatografisinde çözünmüş maddenin ayrımı………26 Şekil 2.12. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi cihazının şematik görünüşü (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT)……………………………..28 Şekil 2.13. HPLC için bir pistonlu pompa…………………………………………..30 Şekil 2.14. Sıvı kromatografide bir kromatogram…………………………………..34 Şekil 2.15. Ayırma gücü (Rs) değerinin piklerin birbirinden ayrılmasına etkisi……37 Şekil 4.1. Protonlanmış izokonazol iyonlaşma şeması……………………………..48 Şekil 4.2. Protonlanmış itrakonazol iyonlaşma şeması ………...……...…………...49 Şekil 4.3. Protonlanmışketokonazol iyonlaşma şeması …………………………...49 Şekil 4.4.Protonlanmışmikonazol iyonlaşma şeması………………………………50 Şekil 4.5.Protonlanmış ornidazol iyonlaşma şeması………………………….…….50 Şekil 4.6.Protonlanmış tinidazol iyonlaşma şeması………………..………………..51 Şekil 4.7.Protonlanmış tiokonazol iyonlaşma şeması……………………….………51