Dissertation submitted to the Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics of the Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, Germany for the degree of Doctor of Natural Sciences (Dr. rer. nat.) Presented by Lda.-Chem. Maria Pilar Arpa Sancet Born in Zaragoza, Spain Oral examination: June 4th 2013 Influence of surface properties on adhesion of Cobetia marina and accumulation of marine microfoulers in the ocean Referees: Prof. Dr. Michael Grunze Prof. Dr. Joachim P. Spatz Abstract Marine biofouling, the colonization of submerged surfaces by unwanted organisms, has an important economic and environmental impact. This PhD thesis focuses on the smaller organisms involved in the biofouling process such as bacteria, diatoms and protozoa also called microfoulers. As bacteria are usually among the first organisms to settle on submerged surfaces, the characterization of their adhesion to these surfaces is essential for the development of strategies for antifouling, and in particular fouling release coatings. To this end, the adhesion of the bacterium Cobetia marina on various model systems for anti-fouling coatings was investigated using a microfluidic shear stress assay which applies shear stresses covering a range of nearly six orders of magnitude from 0.01 to 5,500 dyn/cm2. For this assay, the experimental parameters such as medium, incubation time and increase of the applied volumetric flow were optimized. In this work various surface properties relevant for bioadhesion were investigated, namely wettability, chemistry, hydration, transition from monolayers to polymeric coatings, and the controlled release properties of metal-organic frameworks as a smart release coating. The surfaces used for this study were self-assembled monolayers (SAMs) with different chemical end-groups and hydration levels, polysaccharide coatings with and without capping of their carboxylic groups, poly[oligo(ethylene glycol)methacrylate] (POEGMA) brushes and copper based metal-organic frameworks (Cu-SURMOF 2). The results showed that in general the hydration of the surface is more important for the resistance against bioadhesion than the wettability. It was demonstrated that the critical shear stress needed for removal of bacteria from a SAM system based on ethylene glycols (EGs) decreased with an increasing number of EG units which is directly related to an increment of hydration. Furthermore, good fouling-release properties of polysaccharide coatings were demonstrated, especially if the free-carboxyl groups of alginic acid (AA) and hyaluronic acid (HA) were capped with a hydrophobic amine. Cu-SURMOFs 2 were investigated as an example of smart release coatings. When bacteria interacted with these surfaces they induced a loss of crystallinity and a harmful effect on themselves. These findings, together with the observed stability of the coatings in artificial seawater (ASW) I and the integrity of the coating in areas without bacteria demonstrated a stimulus response of these surfaces upon presence of bacteria. In order to compare the performance in the field of the surfaces investigated in the laboratory assays, a set of well characterized samples were immersed into the ocean at the Sebastian test site of the Florida Institute of Technology. The aim of these field tests was to compare the results of the laboratory experiments, which solely investigated a single species under controlled conditions, with field experiments which employed a mixed species marine environment under natural conditions. The results showed that air and water temperature seemed to be an important factor for the abundance of species and composition of the fouling community. Furthermore, the level of hydration of the surfaces was found to be more important for their colonization than their wettability. Some trends that have also been observed in previous laboratory assays such as the good performance of the polysaccharide coatings and the EG SAMs, compared to other SAMs, could be confirmed in the field. Hence, the inert properties of hydrophilic hydrogels could be demonstrated in both laboratory assays and in the natural marine environment. II Kurzfassung Die als marines Fouling bezeichnete unerwünschte Besiedelung von untergetauchten Oberflächen hat große ökonomische und ökologische Auswirkungen. Diese Dissertation beschäftigt sich mit den kleineren, am Foulingprozess beteiligten Organismen: Bakterien, Diatomeen und Protozoa, gemeinsam auch als Mikrofouler bezeichnet. Da Bakterien für gewöhnlich zu den ersten Organismen gehören, die untergetauchte Oberflächen besiedeln, ist die Charakterisierung ihrer Anhaftung auf diesen Oberflächen von grundlegender Bedeutung, um Strategien für Beschichtungen mit Antifouling- eigenschaften zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurde die Adhäsion des Bakteriums Cobetia marina auf verschiedenen Modelloberflächen für Antifoulingbeschichtungen mithilfe eines mikrofluidischen Scherkraft-Assays, welches Scherkräfte im Bereich von 0.01 dyn/cm2 bis 5,500 dyn/cm2, also beinahe sechs Größenordnungen abzudecken vermag, untersucht. Für diese Versuche wurden die experimentellen Parameter wie z. B. das verwendete Medium, die Inkubationszeit und die Wachstumsrate der applizierten Scherkräfte optimiert. In Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene, für die Bioadhäsion relevante Oberflächeneigenschaften wie die Benetzbarkeit, chemische Zusammensetzung, Hydratation, der Übergang von Monolagen zu Polymerschichten und die kontrollierte Freisetzung aus metallorganischen Gerüststrukturen als Beispiel für eine Smart-Release- Beschichtung untersucht. SAMs (selbstorganisierende Monoschichten) mit unterschiedlichen chemischen Endgruppen und Hydratationszuständen, Polysaccharid- Beschichtungen mit und ohne Schutz ihrer Carboxyl-Gruppen, POEGMA-Bürsten (Poly(oligoethylenglykol) methacrylat-Bürsten) und kupferbasierte MOFs (metallorganische Gerüststrukturen, engl. metal-organic framework) (Cu-SURMOF 2) wurden in dieser Arbeit als wohl-definierte Modelloberflächen genutzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Hydratation der Oberfläche von größerer Bedeutung für die Resistenz gegenüber Bioadhäsion ist als die chemische Zusammensetzung. Es konnte gezeigt werden, dass die kritische Scherkraft, die nötig war, um Bakterien von SAMs aus Ethylenglykol-Gruppen (EG-Gruppen) zu entfernen, mit steigender Anzahl der EG-Gruppen und daraus folgender verstärkter Hydratation abnahm. Desweiteren konnten gute Foul-release-Eigenschaften der Polysaccharid-Beschichtungen gezeigt werden, III insbesondere für Hyaluronsäure und Algininsäure mit geschützten freien Carboxylgruppen. Cu-SURMOFs 2 wurden als Beispiel einer Smart-Release- Beschichtung untersucht. Wenn Bakterien mit dieser Oberfläche interagierten, verursachten einen Abbau der kristallinen Struktur und letztlich eine Schädigung ihrer selbst. Diese Ergebnisse in Kombination mit der festgestellten Stabilität der Beschichtungen in ASW (künstliches Seewasser, engl. artificial seawater) belegen eine Reizantwort dieser Oberflächen auf die dort vorhandenen Bakterien. Um die Leistungsfähigkeit der im Labor untersuchten Oberflächen zu vergleichen, wurden identische Proben im Ozean auf dem Versuchsgelände Sebastian des Florida Institute of Technology getestet. Ziel dieser Versuche war es, die Ergebnisse der auf nur einer Bakterien-Art basierenden Labor-Assays mit Feldversuchen zu vergleichen, welche die komplette Bandbreite der im Ozean vorkommenden Arten unter natürlichen Bedingungen abdecken. Die Auswertung ergab eine starke Abhängigkeit der Anzahl an Spezien und deren Häufigkeit von den vorherrschenden Luft- und Wassertemperaturen. Die Besiedelung der Testoberflächen wurde stärker durch die Hydratation der Oberflächen als durch ihre Benetzbarkeit bestimmt. Manche zuvor in Laborversuchen gemachte Beobachtungen wie beispielsweise die guten Ergebnisse für Polysaccharid- Beschichtungen und EG SAMs, im Vergleich zu anderen SAMs, konnten in den Feldversuchen bestätigt werden. Somit konnten die inerten Eigenschaften hydrophiler Hydrogele sowohl in Labor- als auch in Feldversuchen demonstriert werden. IV